桃內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成相關(guān)的環(huán)氧化物水解酶候選基因的鑒別

張圓圓　劉文敬　張斌斌　馬瑞娟　俞明亮

摘要： 環(huán)氧化物水解酶（EH）因其重要的生物學(xué)功能而在哺乳動(dòng)物以及諸多植物中被廣泛關(guān)注，更是果實(shí)典型“桃香”氣味——內(nèi)酯芳香物質(zhì)生物合成的一個(gè)重要酶，但在桃等果實(shí)中的研究較少且鮮有該家族成員的系統(tǒng)報(bào)道或生物學(xué)功能的解析。為鑒別桃果實(shí)中與內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成相關(guān)的環(huán)氧化物水解酶家族成員，本研究使用了同源序列比對(duì)和關(guān)鍵詞搜索等方法，在桃中共篩選獲得7個(gè)環(huán)氧化物水解酶家族成員。序列比對(duì)分析結(jié)果表明，這7個(gè)成員均有典型的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)和環(huán)氧化物水解酶保守的序列片段。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，桃的環(huán)氧化物水解酶成員與擬南芥、煙草等其他物種中已被鑒別的環(huán)氧化物水解酶成員的親緣關(guān)系很近?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示，在桃的發(fā)育成熟進(jìn)程中7個(gè)EH基因均在果實(shí)的中果皮表達(dá)，在果實(shí)發(fā)育前期均呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)錄模式包括3種類(lèi)型。綜合已報(bào)道的內(nèi)酯芳香物質(zhì)的生物合成通路以及前人指出的內(nèi)酯芳香物質(zhì)含量在果實(shí)成熟期開(kāi)始顯著增加的變化規(guī)律，推測(cè)桃環(huán)氧化物水解酶成員的表達(dá)量可能與內(nèi)酯芳香物質(zhì)的積累負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)深入挖掘桃或者其他果實(shí)環(huán)氧化物水解酶家族成員的生物學(xué)功能尤其是參與內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成的分子機(jī)理提供了參考。

關(guān)鍵詞： 桃；內(nèi)酯芳香物質(zhì)；環(huán)氧化物水解酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）01-0178-09

Identification of candidate epoxide hydrolase genes involved in the biosynthesis of lactone volatile compounds in peach （Prunus persica L.）

ZHANG Yuan-yuan¹， LIU Wen-jing^1，2， ZHANG Bin-bin¹， MA Rui-juan¹， YU Ming-liang¹

（1.Institute of Pomology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China；2.School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： Epoxide hydrolases （EHs） were extensively characterized in mammals and numerous plant species for their multiple biological functions， and acted as one important enzyme in the biosynthesis of lactones——a group of volatile compounds which endowed fruit a typical peach-like aroma. However， there were few reports on the family members or biological functions of epoxide hydrolases in peach or other fruits. To identify the EH members involved in the biosynthesis of lactone volatile compounds in peach fruit， homologous sequence alignment and keyword search were used in this study. A total of seven EH family members were screened in peach， and sequence alignment analysis showed that they all had the typical α/β-hydrolase fold structure and conserved sequences. Phylogenetic tree analysis showed that EH members in peach were closely related to the identified EH members in Arabidopsis， tobacco and other plant species. The results of gene expression analysis indicated that these EH genes were expressed in the mesocarp of peach fruit during the development and maturation， and showed a high expression level in the early stages of fruit development. The transcription patterns included three types. Based on the reported biosynthetic pathways of lactones and the fact that the content of lactones began to increase significantly at fruit ripening stages， it was speculated that the expression levels of the epoxide hydrolase genes may be negatively correlated with the contents of lactones volatile compounds. Overall， these results lay a foundation for further exploration of the biological functions of EH family members in peach or other fruits， especially the molecular mechanism involved in the biosynthesis of lactone volatile compounds.

Key words： peach；lactones volatile compounds；epoxide hydrolases

在桃果實(shí)上百種揮發(fā)性芳香物質(zhì)中，內(nèi)酯是賦予其典型“桃香”氣味的重要貢獻(xiàn)組分，亦是桃果實(shí)芳香品質(zhì)研究和改良的重點(diǎn)。目前已知的內(nèi)酯合成途徑包括經(jīng)由飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸的2條支路^[1]，其中不飽和脂肪酸支路通過(guò)一個(gè)重要酶——環(huán)氧化物水解酶（EH）的作用產(chǎn)生羥基脂肪酸，最終在自身環(huán)化或醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)酯。Schttler和Boland^[2]指出環(huán)氧化物水解酶在成熟桃和草莓果實(shí)的內(nèi)酯芳香組分的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該酶在油桃果實(shí)中具有催化活性且催化產(chǎn)物通過(guò)后續(xù)代謝最終形成了內(nèi)酯物質(zhì)，由此推測(cè)不飽和脂肪酸如亞油酸和亞麻酸的環(huán)氧化作用可能是果實(shí)中發(fā)生飽和脂肪酸衍生物氧化的一種普遍途徑，并最終產(chǎn)生了γ-內(nèi)酯物質(zhì)和δ-內(nèi)酯物質(zhì)。

環(huán)氧化物水解酶存在于所有生物中，是一類(lèi)能立體選擇地將水分子加成到環(huán)氧底物上生成相應(yīng)的1，2-二醇類(lèi)的酶，具有α/β水解酶折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其活性位點(diǎn)包括核心結(jié)構(gòu)（通常由2個(gè)天冬氨酸殘基和1個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成）和帽子結(jié)構(gòu)^[3-5]。由于諸多被EH催化的脂類(lèi)基質(zhì)生物活性強(qiáng)，因此EH在植物和動(dòng)物中具有重要而多樣的生物學(xué)作用，如參與宿主防御和發(fā)育控制等，對(duì)生理系統(tǒng)有著深遠(yuǎn)的影響。根據(jù)細(xì)胞定位的不同和底物的特異性，高等生物中不同的環(huán)氧化物水解酶被分為7種亞型，包括可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）、微粒體環(huán)氧化物水解酶（mEH）、保幼激素環(huán)氧化物水解酶（JhEH）、膽固醇環(huán)氧化物水解酶（ChEH）、羥環(huán)氧烯酸水解酶、白三烯A4環(huán)氧化物水解酶（LAH）和檸檬烯環(huán)氧化物水解酶（LEH），且不同類(lèi)型和來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小明顯不同^[6-8]。

環(huán)氧化物水解酶廣泛分布于發(fā)芽的種子、根、果實(shí)、塊莖和葉等組織中，并在大豆、綠豆、擬南芥、馬鈴薯、普通煙草等多種植物中被廣泛研究^[9-18]。在植物環(huán)氧化物水解酶中，有關(guān)sEH的相關(guān)研究目前報(bào)道較多。sEH定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和乙醛酸循環(huán)體，以羥基酸和環(huán)氧脂肪酸等為催化底物，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約35 000，一般以單體或二聚體蛋白質(zhì)的形式存在^[4，6]。在模式植物擬南芥中，目前已有EH成員AtSEH和AtEH1等獲得報(bào)道，為其他植物EH的研究提供了借鑒。Kiyosue等^[10]從干旱脅迫處理的擬南芥中分離獲得AtSEH基因的cDNA序列，研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)素和干旱脅迫的誘導(dǎo)并呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)模式，其編碼的可溶性環(huán)氧化物水解酶的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)測(cè)為36 423。Pineau等^[18]的研究結(jié)果表明，AtEH1酶蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，具有環(huán)氧化物水解酶保守的核心催化位點(diǎn)，參與了角質(zhì)的形成。除擬南芥外，馬鈴薯也是植物中EH研究較為深入的物種。Mowbray等^[13]通過(guò)X射線(xiàn)衍射的方法揭示了馬鈴薯環(huán)氧化物水解酶StEH1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這是植物環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)首次被報(bào)道，并促進(jìn)了其后馬鈴薯EH及其變種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的逐步深入^[14，17]。此外，本氏煙草中過(guò)氧化物酶體靶向的EH成員NbEH2.1和NbEH2.2能夠特異地參與細(xì)菌等病原體的防御^[15]；環(huán)氧化物水解酶NbEH1.1和NbEH2.1來(lái)自2個(gè)進(jìn)化分支，生化功能分析結(jié)果表明，這2種酶具有不同的底物特異性，EH1可能通過(guò)在脅迫環(huán)境下產(chǎn)生信號(hào)物質(zhì)激活植物的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)發(fā)揮功能，EH2則可能參與角質(zhì)單體的形成^[16]。

近年來(lái)，環(huán)氧化物水解酶作為桃果實(shí)內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成的參與酶在多項(xiàng)研究中獲得關(guān)注。Vecchietti等^[19]創(chuàng)建了多基因型多發(fā)育階段的桃外果皮和中果皮的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)的桃表達(dá)序列標(biāo)簽信息，通過(guò)綜合分析芳香物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)錄模式篩選出了與芳香相關(guān)的重要基因，其中包含1個(gè)內(nèi)酯合成的關(guān)鍵基因——環(huán)氧化物水解酶編碼基因，可從果實(shí)材料中克隆獲得該環(huán)氧化物水解酶編碼基因1 350 bp的全長(zhǎng)序列?；贐olero桃與OroA桃的芳香差異極大的特點(diǎn)，Pirona等^[20]對(duì)這2種基因型的桃構(gòu)建了微陣列數(shù)據(jù)以分析桃果實(shí)在3個(gè)發(fā)育成熟階段中基因的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)2個(gè)環(huán)氧化物水解酶基因EPH2（ppa008854m）和EPH3（ppa009153m）在2種桃的發(fā)育成熟階段呈現(xiàn)差異表達(dá)模式。Li等^[21]以溶質(zhì)桃為試驗(yàn)材料通過(guò)基因表達(dá)分析鑒定與芳香相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)ppa007004m、ppa008918m、ppa008854m、ppa008756m、ppa013585m等環(huán)氧化物水解酶基因在果實(shí)的不同發(fā)育階段以及4個(gè)品種之間呈現(xiàn)差異表達(dá)。

目前，有關(guān)桃果實(shí)內(nèi)酯合成相關(guān)環(huán)氧化物水解酶基因的報(bào)道呈零星分布，多由差異表達(dá)基因分析獲得，且不同研究涉及的環(huán)氧化物水解酶基因成員之間存在重疊，鮮有文獻(xiàn)系統(tǒng)報(bào)道桃EH基因家族成員的構(gòu)成和序列特征或深入解析其具體的生物學(xué)功能等。本研究篩選獲得了桃EH家族候選成員，對(duì)候選成員編碼的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并分析了果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中各成員基因的表達(dá)量變化，鑒別桃果實(shí)中內(nèi)酯合成相關(guān)的候選環(huán)氧化物水解酶成員，以期為深入研究果實(shí)環(huán)氧化物水解酶的生物學(xué)功能和果實(shí)內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成的分子機(jī)理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以2020年取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)南京桃資源圃的白花水蜜（Prunus persica L.）的桃果實(shí)為試驗(yàn)材料。對(duì)S1～S4發(fā)育成熟階段（分別對(duì)應(yīng)盛花后43 d，77 d，115 d，144 d）的桃果實(shí)依次進(jìn)行采收，選取大小和色澤一致且無(wú)機(jī)械傷的果實(shí)用于研究。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)選取6個(gè)果實(shí)，設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。中果皮部位切碎后速凍于液氮，樣品存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

使用RNAprep Pure試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]提取S1～S4發(fā)育成熟階段桃果實(shí)樣品的總RNA。凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

使用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品]去除基因組DNA殘留，并對(duì)1 μg的RNA進(jìn)行cDNA合成。合成的cDNA經(jīng)過(guò)DEPC（焦碳酸二乙酯）稀釋后作為后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。

1.3 桃EH家族候選成員搜索與蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

基于JGI（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，參考已報(bào)道的桃（Prunus persica L.）和擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）的EH家族成員^{[10，18，20-21]}的蛋白質(zhì)氨基酸序列，通過(guò)同源序列比對(duì)、α/β水解酶結(jié)構(gòu)家族成員搜索、可溶性環(huán)氧化物水解酶的關(guān)鍵詞搜索等方法獲得桃EH家族的候選成員；使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的CCD在線(xiàn)工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析桃EH家族候選成員的保守結(jié)構(gòu)域（表1）。

1.4 氨基酸序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用ISPript3.0在線(xiàn)工具（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）^[22]進(jìn)行桃EH候選成員與其他物種已報(bào)道的EH成員的氨基酸序列的比對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用Clustalx軟件進(jìn)行桃EH候選成員的蛋白質(zhì)氨基酸序列和其他物種已報(bào)道的EH成員的比對(duì)，采用Figtree （version 1.3.1）軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.6 RT-qPCR分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品]檢測(cè)桃EH家族候選基因在S1～S4發(fā)育成熟階段的表達(dá)量變化。反應(yīng)體系包括SYBR PCR 預(yù)混液[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品]10.0 μl，RT-qPCR上下游引物各1.0 μl，滅菌DEPC水6.0 μl，稀釋的cDNA模板2.0 μl。根據(jù)EH基因成員的編碼區(qū)堿基序列，利用NCBI/Primer-BLAST在線(xiàn)設(shè)計(jì)各基因相應(yīng)的RT-qPCR引物，經(jīng)過(guò)熔解曲線(xiàn)分析和回收產(chǎn)物測(cè)序分析等方法檢驗(yàn)引物的擴(kuò)增特異性^[23]。以PpTEF2基因?yàn)閮?nèi)參基因^[24]，設(shè)定S1階段的各基因相對(duì)表達(dá)量為1，使用2^-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR引物序列見(jiàn)表2。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析與圖表制作

使用Microsoft excel 2019計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，使用Origin8.0進(jìn)行相關(guān)圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃EH家族候選成員的篩選和氨基酸序列比對(duì)

通過(guò)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，首先從相關(guān)序列中篩選出屬于α/β水解酶結(jié)構(gòu)超級(jí)家族的成員，它們均具有保守的MhpC（Pimeloyl-ACP methyl ester carboxylesterase）結(jié)構(gòu)域。隨后參考馬鈴薯環(huán)氧化物水解酶StEH1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)PDB編號(hào)：2CJP），通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析鑒別出7個(gè)蛋白質(zhì)具有環(huán)氧化物水解酶保守的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域，將其命名為PpEH1～PpEH7，其編碼的基因?yàn)樘褽H家族的候選基因（表1）。桃EH家族候選成員所編碼的蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)氨基酸序列最短為313個(gè)氨基酸（PpEH7），最長(zhǎng)為339個(gè)氨基酸（PpEH1）。這些成員的MhpC結(jié)構(gòu)域的位置存在差異。

將桃與已報(bào)道的其他物種EH成員的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它們的α/β水解酶結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)較大的相似性，氨基酸序列的平均相似度達(dá)到60.35%。桃的EH成員均具有標(biāo)準(zhǔn)的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，8條β片層被多個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)包圍，而高度保守的三聯(lián)體組成了催化殘基，包括位于β5之后的親核氨基酸（天冬氨酸），位于最后一個(gè)β片層之后的負(fù)責(zé)活化水分子的組氨酸以及輔佐組氨酸的位于β7片層之后的酸性催化殘基（天冬氨酸）（圖1）。三位一體的結(jié)構(gòu)之外，2個(gè)氧陰離子洞位置的氨基酸在桃EH成員之間非常保守，包括β3附近的色氨酸和β5親核天冬氨酸旁的色氨酸（PpEH3）或苯丙氨酸。同時(shí)，所有比對(duì)的EH成員在β4結(jié)束的位置上有保守的RGYG（D/L）（S/T）序列片段。

2.2 桃EH家族候選成員的蛋白質(zhì)進(jìn)化樹(shù)分析

利用Figtree1.3.1軟件構(gòu)建桃和其他植物EH成員的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。在進(jìn)化樹(shù)的3個(gè)分支中，擬南芥的2個(gè)EH成員（AtEH4和AtEH5）位于第一分支，馬鈴薯、粗皮檸檬、大豆和油菜的4個(gè)EH蛋白與擬南芥的2個(gè)EH成員（AtEH2和AtEH3）共同位于第二分支，桃的7個(gè)EH成員、擬南芥的2個(gè)EH成員（AtEH1和AtEH6）和煙草的EH成員共同聚類(lèi)在第三分支。

在第二分支，馬鈴薯和粗皮檸檬的EH成員聚類(lèi)在一起，大豆、油菜和擬南芥的2個(gè)EH成員聚類(lèi)在一起，具有較近的親緣關(guān)系。在第三分支，PpEH1、PpEH4、PpEH5、PpEH6、PpEH7和煙草EH成員聚類(lèi)在一起，PpEH2、PpEH3和擬南芥AtEH6聚類(lèi)在一起，且上述EH成員均與AtEH1親緣關(guān)系很近。

2.3 桃EH家族候選基因在果實(shí)發(fā)育成熟階段的表達(dá)模式

從果實(shí)的第一次快速膨大期至成熟期，7個(gè)EH基因均有表達(dá)，在發(fā)育成熟階段前期呈現(xiàn)了較高的表達(dá)水平，在整個(gè)發(fā)育成熟進(jìn)程中呈現(xiàn)整體逐漸下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)（圖3）。

桃EH家族候選基因表達(dá)變化分為3種模式。模式Ⅰ表現(xiàn)為3個(gè)基因（PpEH1、PpEH3、PpEH6）的表達(dá)量伴隨果實(shí)發(fā)育成熟進(jìn)程逐步下調(diào)，模式Ⅱ表現(xiàn)為1個(gè)基因（PpEH2）的表達(dá)量在發(fā)育成熟階段的前期上調(diào)而后期下調(diào)，模式Ⅲ表現(xiàn)為3個(gè)基因（PpEH4、PpEH5、PpEH7）的表達(dá)量在發(fā)育成熟階段的前期有下調(diào)和上調(diào)趨勢(shì)而隨后下調(diào)，整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。

表達(dá)模式Ⅰ的3個(gè)基因在S1階段的表達(dá)量最高，而在S4階段的表達(dá)量下調(diào)至S1階段的4.5%以下，是整個(gè)發(fā)育成熟階段表達(dá)量的最低值。模式Ⅱ的EH基因PpEH2存在一個(gè)上調(diào)表達(dá)過(guò)程，最高表達(dá)量出現(xiàn)在S2階段，最低表達(dá)量出現(xiàn)在S4階段，S4階段的基因表達(dá)量下調(diào)至S2表達(dá)量的2.3%。模式Ⅲ中，PpEH4在S4階段的基因表達(dá)量下調(diào)至最高表達(dá)量（S3階段）的37.2%，PpEH5在S4階段的基因表達(dá)量下調(diào)至最高表達(dá)量（S3階段）的31.9%；PpEH7在S4階段的基因表達(dá)量下調(diào)至最高表達(dá)量（S1階段）的8.5%，下調(diào)幅度最大。綜合上述分析，桃的EH家族基因在S4階段之前均具有較高的表達(dá)水平，在成熟期S4階段的基因表達(dá)水平相對(duì)前期呈現(xiàn)顯著的下調(diào)；結(jié)合前人研究所報(bào)道的內(nèi)酯芳香物質(zhì)的含量在成熟后顯著增加的規(guī)律，可知這些EH基因表達(dá)量可能與內(nèi)酯芳香物質(zhì)的積累負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 環(huán)氧化物水解酶的結(jié)構(gòu)特征

環(huán)氧化物水解酶具有α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，屬于包含有酯酶、蛋白酶、脂肪酶、脫鹵酶、裂解酶等功能的α/β水解酶超級(jí)家族中的一類(lèi)^[25-26]。標(biāo)準(zhǔn)的α/β水解酶折疊是由幾乎平行的8條β片層（其中只有第二個(gè)β片層與其他片層反向平行）和包圍在兩邊的多個(gè)α螺旋共同組成的，且α/β水解酶的催化殘基都是由1個(gè)高度保守的三聯(lián)體組成。根據(jù)賈佳^[27]統(tǒng)計(jì)的EH家族的核心催化位點(diǎn)的特征，EHs除了上述三聯(lián)體結(jié)構(gòu)之外，在質(zhì)子供體、氧陰離子洞位置的氨基酸的選擇也具有高度保守性，且在β4結(jié)束的位置存在保守片段GXGXS（甘氨酸-可變氨基酸-甘氨酸-可變氨基酸-絲氨酸）。本研究中，我們鑒別的7個(gè)桃的EH家族候選成員均具有標(biāo)準(zhǔn)的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，與馬鈴薯、柑橘、煙草、擬南芥等其他植物中所報(bào)道的EH成員結(jié)構(gòu)的相似度高，且催化殘基包括2個(gè)天冬氨酸和1個(gè)組氨酸。在質(zhì)子供體的氨基酸選擇上，除了PpEH3之外，分析的其他EH成員位于α5螺旋的質(zhì)子供體均為酪氨酸。本研究所涉及的EH成員的氧陰離子洞位置的氨基酸的選擇均很保守，且具有GXGX（甘氨酸-可變氨基酸-甘氨酸-可變氨基酸）的保守片段，與賈佳^[27]的結(jié)論一致。

3.2 植物環(huán)氧化物水解酶的生物學(xué)功能

環(huán)氧化物水解酶在生物體系中發(fā)揮著重要的作用，包括外源化合物代謝、信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)等，在哺乳動(dòng)物中的研究相對(duì)深入，在植物中的研究略為滯后。Neuteboom等^[28]鑒別了在菠蘿根部呈現(xiàn)組織特異表達(dá)的基因，其中PFE258是長(zhǎng)為1 199 bp的環(huán)氧化物酶基因。大戟屬植物（Euphorbia lagascae）的種子胚乳中含有高水平的環(huán)氧化脂肪酸-羥基乙酸，而環(huán)氧化物水解酶參與了種子萌發(fā)過(guò)程中羥基乙酸的氧化過(guò)程，Edqvist和Farbos^[29]從該植物中分離到了這種酶，并發(fā)現(xiàn)其編碼基因的表達(dá)受到種子萌發(fā)過(guò)程的誘導(dǎo)，而且外源激素如生長(zhǎng)素和乙稀等的刺激也可增加該基因的轉(zhuǎn)錄。鄭柳城和朱宏波^[30]通過(guò)在水稻蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，獲得了10個(gè)水溶性環(huán)氧化物水解酶，并對(duì)編碼這些酶的基因開(kāi)展了表達(dá)模式分析、蛋白質(zhì)氨基酸序列聯(lián)配、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了它們可能具有與抗逆相關(guān)的重要功能。在擬南芥中，近期有研究關(guān)注了一些EH的生物學(xué)功能，并證明EH參與了宿主防御的重要功能。AtEH1參與角質(zhì)的形成^[18]，催化水解C18脂肪酸環(huán)氧化物生成鄰二醇；在敲除了AtEH1基因的擬南芥突變體中，葉片和種子角質(zhì)中C18脂肪酸環(huán)氧化物含量會(huì)升高，并伴隨鄰二醇產(chǎn)物含量的降低。現(xiàn)有研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了植物EH在植物抗逆性方面的重要功能。

3.3 桃果實(shí)環(huán)氧化物水解酶基因的表達(dá)分析

目前涉及果實(shí)EH鑒別和生物學(xué)功能的研究較少，其中桃果實(shí)EH參與內(nèi)酯芳香物質(zhì)合成的相關(guān)研究備受關(guān)注。Pirona等^[20]報(bào)道了2個(gè)可能的EH成員，其中EPH3（編號(hào)：ppa009153m）的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示其屬于HAD水解酶超家族，而EPH2（編號(hào)：ppa008854m）對(duì)應(yīng)于本研究所鑒別的PpEH2。Pirona等^[20]對(duì)更為芳香的溶質(zhì)品種Bolero桃和香氣較弱的不溶質(zhì)品種OroA桃開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)EPH2在Bolero桃果實(shí)發(fā)育前期上調(diào)表達(dá)，在Bolero和OroA桃果實(shí)的發(fā)育后期均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。本研究所用品種白花水蜜為溶質(zhì)桃而且香氣濃郁，在該品種果實(shí)發(fā)育的S2階段PpEH2有明顯的上調(diào)表達(dá)，且在整個(gè)成熟期呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，類(lèi)似于Bolero桃的表達(dá)趨勢(shì)，與Pirona等^[20]的研究結(jié)果一致。Li等^[21]報(bào)道了若干可能的EH成員，其中EPH2（編號(hào)：ppa008854m）對(duì)應(yīng)于本研究所鑒別的PpEH2，且與Pirona等^[20]所報(bào)道的EPH2是同一個(gè)基因；EPH1（編號(hào)：ppa008918m）對(duì)應(yīng)于本研究所鑒別的PpEH6；但所報(bào)道的基因編號(hào)為ppa007004m和ppa013585m基因編碼的不屬于α/β水解酶結(jié)構(gòu)家族，另一個(gè)基因編號(hào)為ppa008756m基因編碼的不具有EH家族的保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果表明PpEH6和PpEH2在成熟期S4階段相比于S3階段表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而Li等^[21]更精細(xì)地分析了這2個(gè)基因在HJ1階段（成熟早期）、HJ2階段（商業(yè)采收成熟期）、HJ3階段（完全成熟期）表達(dá)量的變化：EPH1（對(duì)應(yīng)本研究的PpEH6）在湖景蜜露果實(shí)HJ2階段相比HJ1階段表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，EPH2（對(duì)應(yīng)本研究的PpEH2）在HJ2階段表達(dá)下調(diào)后在HJ3階段又呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。

有研究結(jié)果表明，內(nèi)酯芳香物質(zhì)伴隨桃果實(shí)的成熟逐漸積累。Zhang等^[31]分析了內(nèi)酯物質(zhì)在湖景蜜露和奉化玉露桃果實(shí)的不同發(fā)育成熟階段（S0：未成熟階段；S1：早期成熟階段；S2：商業(yè)采收成熟階段；S3：完全成熟階段）的含量變化，發(fā)現(xiàn)γ-癸內(nèi)酯是其中含量最高的內(nèi)酯物質(zhì)，且該內(nèi)酯在2個(gè)品種桃果實(shí)中的含量均在S1階段呈現(xiàn)顯著增加，在S3階段達(dá)到最高。Peng等^[32]對(duì)盛花后114～132 d的Fenghuayulu桃果實(shí)每隔2 d進(jìn)行1次取樣，并對(duì)芳香物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從花后124 d開(kāi)始可以在果實(shí)中檢測(cè)到γ-癸內(nèi)酯，且在隨后的階段中含量逐漸上升，在最后一個(gè)取樣點(diǎn)γ-癸內(nèi)酯含量達(dá)到最高。結(jié)合本研究的基因表達(dá)分析結(jié)果，在桃果實(shí)中表達(dá)的7個(gè)EH基因在成熟期的S3階段均有一定的表達(dá)量，可能與內(nèi)酯的合成相關(guān)聯(lián)。由于內(nèi)酯的合成通路尚未完全闡明，而環(huán)氧化物水解酶在內(nèi)酯合成通路的中游發(fā)揮作用，因此EH成員催化特征的鑒別、各EH成員催化產(chǎn)物的明確、EH產(chǎn)物是否以及如何作為前體物質(zhì)參與內(nèi)酯的合成等將是后續(xù)相關(guān)研究需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。同時(shí)需要注意桃的EH是否具有多重生物學(xué)功能，如在其他物種中所報(bào)道的參與逆境防御的功能等。

綜上所述，本研究系統(tǒng)鑒別出7個(gè)桃的EH家族成員，序列特征分析結(jié)果表明它們具有典型的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，屬于環(huán)氧化物水解酶家族。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，桃的EH成員與擬南芥、煙草、油菜、大豆、粗皮檸檬等物種的EH的聚類(lèi)很近?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示，它們均在果實(shí)的S1～S4發(fā)育成熟階段表達(dá)，表達(dá)模式分為3種，基本呈現(xiàn)成熟前期表達(dá)量較高而在整個(gè)成熟期整體表達(dá)量下調(diào)的總趨勢(shì)，與內(nèi)酯芳香物質(zhì)的積累負(fù)相關(guān)。本研究對(duì)于桃環(huán)氧化物水解酶家族成員的構(gòu)成、進(jìn)化關(guān)系和基因表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為后續(xù)桃乃至其他果實(shí)中內(nèi)酯物質(zhì)合成相關(guān)的EH成員的深入研究提供參考。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）