防控甜瓜枯萎病病菌的生防菌篩選及其根際定殖

李青　謝昶琰　張苗　孫春梅　陳川　章安康

摘要： 為了開發(fā)在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中能夠穩(wěn)定發(fā)揮功能的生防菌資源，本研究從甜瓜根際挖掘具有良好根際定殖能力的抗甜瓜枯萎病病菌生防菌株。通過繼代培養(yǎng)法、平板對(duì)峙法、發(fā)芽率測(cè)試和盆栽試驗(yàn)篩選出對(duì)甜瓜枯萎病有較強(qiáng)防控作用的生防菌株R1-3，經(jīng)該菌發(fā)酵液處理的甜瓜植株對(duì)甜瓜枯萎病病菌的防效達(dá)50.04%，且菌株發(fā)酵液處理能夠促進(jìn)甜瓜植株的生長。根際定殖相關(guān)因素的測(cè)試結(jié)果表明，菌株R1-3能形成強(qiáng)健的生物膜結(jié)構(gòu)且對(duì)不同質(zhì)量濃度的甜瓜根系分泌物均具有顯著趨化性，具備良好的根際定殖能力。該菌株對(duì)不同植物?；图怄哏牭毒吐莶〔【灿幸欢ǖ囊种谱饔茫揖哂蟹置谶胚嵋宜幔↖AA）、溶解無機(jī)磷及耐鹽能力。通過菌株16S rDNA序列分析，將R1-3初步確定為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.）。

關(guān)鍵詞： 甜瓜枯萎病；生防菌；防病和促生作用；根際定殖；趨化性

中圖分類號(hào)： S652 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）02-0336-08

Screening of antagonistic bacteria against muskmelon Fusarium oxysporum and their colonization on rhizosphere

LI Qing， XIE Chang-yan， ZHANG Miao， SUN Chun-mei， CHEN Chuan， ZHANG An-kang

（Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu Province， Huaian 223001， China）

Abstract： To explore antagonistic bacterium materials that can play a stable role in agricultural practice， this research aimed to screen antagonistic bacteria against muskmelon Fusarium oxysporum which were easy to colonize in the rhizosphere. Strain R1-3 with strong antagonistic effect against muskmelon F. oxysporum was screened by using successive transfer culture method， plate confrontation method， germination rate test and pot experiment. Muskmelon treated by fermentation solution of R1-3 showed 50.04% control efficiency to muskmelon Fusarium wilt and the treatment could promote the growth of muskmelon. Test results of rhizosphere colonization-related factors showed that， strain R1-3 had fine rhizosphere colonization ability because it could form strong biofilm structure and had significant chemotaxis to musk melon root exudates with different mass concentrations. This strain had inhibitory effects on different plant specialized F.oxysporum and Stagonosporopsis spp.， it also had the abilities of secreting indole-3-acetic acid （IAA）， dissolving inorganic phosphorus and salt tolerance. Based on the phylogenetic analysis of 16S rDNA， strain R1-3 was preliminary identified as Bacillus sp..

Key words： muskmelon Fusarium wilt;antagonistic bacteria;disease prevention and growth promotion effect;rhizosphere colonization;chemotaxis

甜瓜屬于中國廣泛栽種的經(jīng)濟(jì)作物，近年來其產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益較高，在種植業(yè)中的地位不斷提升^[1-2]。但是長年連續(xù)種植甜瓜會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田土壤病原微生物積累，造成土傳病害頻發(fā)，連作障礙已成為甜瓜可持續(xù)生產(chǎn)的重要限制因素之一^[3]。特別是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）導(dǎo)致的甜瓜枯萎病、蔓枯病病菌（Stagonosporopsis spp.）引起的甜瓜蔓枯病等，在連作地發(fā)生的概率很高，嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)^[4]。目前這些土傳病害的防治主要依賴化學(xué)藥劑，但化學(xué)藥劑的長期使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且易造成安全隱患^[5]。相比之下，生物防治因其環(huán)境友好和經(jīng)濟(jì)投入較少等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注和認(rèn)可^[6]。許多芽孢桿菌屬細(xì)菌不僅能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)拮抗病原菌，還具有植物促生特性，在生物防治中發(fā)揮著重要作用^[7]。然而，盡管多數(shù)生防菌在室內(nèi)條件下具有良好的防病效果，但它們?cè)谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中對(duì)病害的實(shí)際防效依然有限，效果往往不穩(wěn)定^[8-9]。首先，許多生防菌是在富營養(yǎng)的培養(yǎng)基中被分離篩選出來的^[10-12]，未必能適應(yīng)土壤中較貧瘠的營養(yǎng)條件。其次，很多研究在篩選過程中多以平板對(duì)峙試驗(yàn)中生防菌對(duì)病原菌的抑制率作為主要篩選指標(biāo)^[12-14]，而平板抑制率僅能表征菌株產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的活性與能力。菌株充分發(fā)揮生防功能的重要前提是其在植物根際能夠有效定殖^[15]。影響細(xì)菌根際定殖的關(guān)鍵因素包括菌株對(duì)植物根系分泌物的趨化性和自身生物膜的形成能力^[16]。根系分泌物中包含的信號(hào)物質(zhì)能夠調(diào)控細(xì)菌向根表趨化運(yùn)動(dòng)^[17]，停留在根表的細(xì)菌群體分泌胞外基質(zhì)（主要成分為蛋白質(zhì)、多糖和胞外DNA等），將自身包裹而形成膜樣的細(xì)菌群體聚合物，細(xì)菌群體聚合物被稱為生物膜，可為其提供一種受保護(hù)的、競(jìng)爭力更強(qiáng)的生存模式^[18-19]，因而有益細(xì)菌向根表趨化并聚集成膜是其發(fā)揮抑病促生功能的關(guān)鍵。為獲得在植物根際能夠穩(wěn)定發(fā)揮功能的微生物，本研究在貧營養(yǎng)條件下采用傳統(tǒng)的生防菌篩選方法，同時(shí)結(jié)合菌株生物膜形成能力和對(duì)根系分泌物趨化性的評(píng)估，分離篩選獲得1株具有防病促生效果和良好根際定殖能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌R1-3，并探索了其潛在的促生因子、耐鹽能力以及拮抗多種病原菌的特性。研究結(jié)果能夠?yàn)樯谰甑暮Y選應(yīng)用提供新的思路及資源，有助于減少對(duì)農(nóng)用化學(xué)品的依賴以及促進(jìn)甜瓜產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品采集：甜瓜植株及其根際土壤樣品采自江蘇省淮安市甜瓜枯萎病發(fā)生地塊，于甜瓜收獲期隨機(jī)選取靠近枯萎病發(fā)病株附近的健康植株，連根帶土采集其根系用于菌株分離。

供試病原菌：甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis），菌種編號(hào)為ACCC36102，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. niveum）、蔓枯病病菌（Stagonosporopsis spp.）由淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心提供。尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. cucumerinum）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院提供。

供試培養(yǎng)基：細(xì)菌的分離篩選參照Sun等^[20]的方法，采用貧營養(yǎng)的1/10胰酪大豆胨（TSA）培養(yǎng)基（胰蛋白胨1.5 g，大豆蛋白胨0.5 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂20.0 g，用蒸餾水定容至1.0 L）。拮抗效果鑒定使用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，采用PDA培養(yǎng)基^[11]。生物膜測(cè)試參照張楠^[21]的方法，采用MSgg培養(yǎng)基。IAA產(chǎn)量測(cè)定的樣品制備參照陳小娟^[22]的方法，采用添加L-色氨酸的Landy培養(yǎng)基。溶磷能力的測(cè)定參照劉娜^[23]的方法，使用蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基。菌株耐鹽能力檢測(cè)參照李晉等^[24]的方法，使用添加不同質(zhì)量濃度氯化鈉的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根際及內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 抖落植物根部松散的附著土，剪成長約3 cm的小段，稱量植物根及其根際土10 g倒入盛有90 ml無菌水和滅菌玻璃珠的三角瓶內(nèi)振蕩30 min，取1 ml土壤懸液經(jīng)系列梯度稀釋后涂布于1/10 TSA平板上。30 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d后，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)劃線純化后制備甘油管，保存至-80 ℃冰箱。內(nèi)生菌分離時(shí)需對(duì)根進(jìn)行表面消毒（用2%次氯酸鈉浸泡15 min，用70%乙醇浸泡5 min，用無菌水沖洗干凈），然后剪成1 cm左右的碎塊，立即轉(zhuǎn)移至無菌研缽中研磨，最后轉(zhuǎn)移至上述三角瓶內(nèi)，其余操作和根際細(xì)菌分離純化步驟相同。

1.2.2 生防菌的初步篩選 以甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌作為指示菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)法^[14]，測(cè)試保存菌株的拮抗效果。先活化病原菌，再沿菌落邊緣打孔獲取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。28 ℃培養(yǎng)2 d后，將分離得到的細(xì)菌按1%的接種量在1/10 TSA液體培養(yǎng)基中過夜活化并點(diǎn)接2 μl至病原菌菌片兩邊，點(diǎn)接處距離病原菌中心2.5 cm，對(duì)照為單獨(dú)接種尖孢鐮刀菌菌餅的平板，28 ℃培養(yǎng)7～8 d，觀察是否有抑制效果，參照文獻(xiàn)[14]計(jì)算其抑制率，選擇抑制效果明顯的菌株用于后續(xù)研究。菌株對(duì)不同病原菌的平板拮抗效果試驗(yàn)與此步驟相同。

將上述獲得的菌株在1/10 TSA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行20次傳代培養(yǎng)，選取第1、第5、第10、第15和第20代的菌液進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，測(cè)量病原菌被抑制的菌落半徑（r），篩選出在傳代過程中對(duì)甜瓜尖孢鐮刀菌的拮抗效果較穩(wěn)定的菌株^[25]。

將拮抗效果穩(wěn)定的菌株分別接種至TSA液體培養(yǎng)基中，振蕩（30 ℃，170 r/min）培養(yǎng)24 h制成含量約為1×10⁸CFU/ml的菌懸液用于種子發(fā)芽率測(cè)試，對(duì)照為空白TSA培養(yǎng)基。挑取外觀一致的甜瓜種子，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液對(duì)種子進(jìn)行表面消毒后使用無菌水沖洗干凈。分別將種子放入上述生防菌菌懸液和空白TSA培養(yǎng)基中浸泡2 h，取出種子后置于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)的濕潤無菌濾紙上，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)。30 ℃條件下催芽36 h，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算種子的發(fā)芽率^[25]。

1.2.3 盆栽防效及促生試驗(yàn) 甜瓜種子催芽后在滅菌基質(zhì)中播種育苗14 d，生防菌菌懸液制備參照方法1.2.2，在每株甜瓜根圍分別接種3 ml含量為1×10⁸CFU/ml的生防菌菌懸液，每個(gè)處理21株甜瓜，重復(fù)3次，空白對(duì)照設(shè)置為添加等量無菌TSA培養(yǎng)基。參照張美君等^[12]的方法制備甜瓜枯萎病病原菌孢子懸液，生防菌菌懸液接種5 d后，在每株甜瓜根圍接種2 ml甜瓜枯萎病病原菌孢子懸液（含量為1 ml 1×10⁶個(gè)），于病原菌接種20 d后統(tǒng)計(jì)植株發(fā)病情況，參照郝芳敏等^[11]的方法計(jì)算病情指數(shù)和防病效果。

甜瓜種子催芽后在滅菌基質(zhì)中播種育苗14 d，挑選長勢(shì)一致的幼苗，參照上述方法進(jìn)行生防菌菌懸液接種，接種18 d后統(tǒng)計(jì)不同處理甜瓜苗的株高和鮮質(zhì)量。

1.2.4 菌株生物膜形成試驗(yàn) 將過夜活化的生防菌菌株振蕩培養(yǎng)，待其OD₆₀₀達(dá)到1.0時(shí)，離心（5 000 r/min，5 min）收集菌體并用等體積的無菌水重懸。生物膜形成試驗(yàn)采用48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1 ml MSgg培養(yǎng)基^[21]和10 μl菌懸液，每處理設(shè)8個(gè)重復(fù)，以無菌水為對(duì)照，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)，在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)觀察不同處理的生物膜形成情況。選取培養(yǎng)48 h形成的生物膜用于定量測(cè)定，將培養(yǎng)孔中的浮游生物膜及液體培養(yǎng)基在無菌條件下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞濾器（濾膜孔徑為100 μm）中過濾，留在細(xì)胞濾網(wǎng)上的生物膜連同細(xì)胞濾器一起放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干并稱質(zhì)量。

1.2.5 甜瓜根系分泌物的收集 甜瓜播種育苗30 d后輕輕拔起幼苗，將根部雜質(zhì)沖洗干凈，放入裝有100 ml無菌去離子水的三角瓶中，每瓶2棵幼苗，培養(yǎng)24 h后收集三角瓶中的液體，置于冷凍干燥機(jī)中抽干，用去離子水將凍干物溶解，使其質(zhì)量濃度為1 mg/ml，用濾膜（孔徑為0.22 μm）過濾，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.6 菌株對(duì)甜瓜根系分泌物的趨化試驗(yàn) 趨化定量試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[26]，采用1 ml注射器作為毛細(xì)管，分別吸取100 μl不同質(zhì)量濃度梯度（0.03 mg/ml、0.10 mg/ml、0.30 mg/ml、1.00 mg/ml）的甜瓜根系分泌物溶液，以無菌水為對(duì)照。待測(cè)菌株菌懸液制備參照方法1.2.4。使用無菌移液槍頭（規(guī)格為200 μl）吸取菌懸液100 μl，將注射器的針頭輕輕裝入200 μl移液槍頭內(nèi)，放置于超凈臺(tái)內(nèi)30 min，梯度稀釋注射器中的溶液并進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)，獲得注射器溶液中的菌落數(shù)，每個(gè)處理3次重復(fù)。趨化性指數(shù)（RCI）=處理菌落數(shù)的平均值/相應(yīng)對(duì)照菌落數(shù)的平均值，一般當(dāng)RCI≥2時(shí)^[26]，則認(rèn)為與對(duì)照相比，處理的趨化性具有顯著差異。

1.2.7 菌株的根際定殖試驗(yàn) 分別將菌株R1-3和R1-6接種至TSA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（35 ℃，180 r/min）30 h左右，使菌株發(fā)酵液含量為1×10⁹CFU/ml。將各菌株發(fā)酵液按照5%（體積比）的比例接種至滅菌基質(zhì)中，混合均勻。甜瓜種子催芽后播種于基質(zhì)中育苗16 d，輕輕拔起幼苗并將根上的基質(zhì)抖落，稱取1 g根放置于含9 ml無菌水的離心管中，使用渦旋儀劇烈振蕩，吸取懸液進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布計(jì)數(shù)，菌株數(shù)量以每克根質(zhì)量計(jì)，用CFU/g表示。

1.2.8 菌株促生、耐鹽特性研究 按照細(xì)菌IAA檢測(cè)試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司產(chǎn)品）說明書測(cè)定菌株IAA的產(chǎn)量。菌株溶磷能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]。使用NaCl將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板分別調(diào)至不同的鹽含量（3%、5%、8%、11%和13%，質(zhì)量體積比），將菌株劃線接種至這些平板上并觀察其生長狀況，測(cè)試菌株的耐鹽能力。

1.2.9 菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 參照陳小娟^[22]的方法，提取菌株R1-3的總基因組DNA，使用通用引物27F和1492R^[22]進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔回收并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性較高且具有代表性的序列下載。使用MEGA 11.0內(nèi)置ClustalW命令進(jìn)行多序列比對(duì)，去除間隔后，通過自動(dòng)分析找到最佳核酸替換模型為Kimura 2+Gamma分布，基于該模型構(gòu)建Bootstrap為500的最大似然進(jìn)化樹，進(jìn)化樹采用FigTree 1.4.4制作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的分離與初篩

本試驗(yàn)從供試樣品中分離獲得根際菌株（用S表示）及內(nèi)生菌株（用R表示）共122株，通過PDA平板對(duì)峙試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中12株菌株對(duì)甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌有拮抗能力。在繼代培養(yǎng)試驗(yàn)中，當(dāng)在1/10 TSA液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)至20代時(shí)，只有8株菌株仍對(duì)病原菌有一定的拮抗能力（表1）。因此推斷這些菌株抑制甜瓜枯萎病病原菌的能力具有較好的穩(wěn)定性，在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中具有持續(xù)發(fā)揮作用的潛力。甜瓜種子發(fā)芽率測(cè)試結(jié)果（圖1）表明，除了菌株R1-11外，其余7株菌株處理后的甜瓜種子發(fā)芽率為86.0%～95.3%，與對(duì)照的種子發(fā)芽率（90.7%）相比差異不顯著（P>0.05），表明這7株菌株不影響甜瓜種子的發(fā)芽情況，可用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 生防菌對(duì)甜瓜的防病和促生效果

在平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，5株菌株的抑制率大于50%，其中菌株R1-6對(duì)甜瓜尖孢鐮刀菌的平板抑制效果最強(qiáng)，抑制率達(dá)到59.2%（圖2、表2）。在溫室盆栽防效試驗(yàn)中，當(dāng)病原菌接種20 d后，病害防控效果突出的菌株為R1-3和R1-1，病情指數(shù)分別下降50.2%和48.3%，防病效果分別達(dá)50.04%和48.41%（表2）。在促生試驗(yàn)中，生防菌接種18 d后，發(fā)現(xiàn)R1-3菌懸液處理可以顯著提高盆栽甜瓜植株的株高和鮮質(zhì)量，與對(duì)照相比，甜瓜苗株高增加了12.4%，鮮質(zhì)量增加了25.0%（表2），表明菌株R1-3對(duì)甜瓜幼苗具有一定的促生作用。綜上所述，經(jīng)菌株R1-3處理的甜瓜苗發(fā)病最輕且具有促生效果，綜合表現(xiàn)最佳。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，生防菌的實(shí)際防治效果和平板上的抑制率并不具有相對(duì)應(yīng)的關(guān)系。

2.3 生防菌株的生物膜形成能力、對(duì)根系分泌物的趨化性及其根際定殖研究

由上述分析可知，平板抑制率最高的菌株R1-6，其實(shí)際防效卻并不理想，而菌株R1-1和R1-3盡管平板抑制率不是最佳，卻有更好的實(shí)際防效。為了進(jìn)一步探索其中的原因，以菌株R1-1、R1-3和R1-6為研究對(duì)象，分別測(cè)試不同菌株的生物膜形成能力及其對(duì)甜瓜根系分泌物的趨化能力。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下3株菌株的生物膜逐漸成熟，培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，生物膜呈現(xiàn)出褶皺復(fù)雜且致密的狀態(tài)（圖3）。定量試驗(yàn)結(jié)果表明，3株菌株的生物膜質(zhì)量（24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中1個(gè)孔的生物膜質(zhì)量）分別為20.55 mg、21.32 mg和22.31 mg，三者之間差異不顯著（P>0.05），說明3株菌株都能夠形成強(qiáng)健的生物膜結(jié)構(gòu)。趨化定量試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，在0.01～1.00 mg/ml甜瓜根系分泌物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著根系分泌物質(zhì)量濃度的升高，3株菌株的趨化性指數(shù)都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。菌株R1-1表現(xiàn)出對(duì)低質(zhì)量濃度根系分泌物（0.01～0.03 mg/ml）的趨化性不顯著（RCI<2），對(duì)較高質(zhì)量濃度的根系分泌物（0.10～1.00mg/ml）趨化性顯著（RCI≥2）。而菌株R1-3在測(cè)定范圍內(nèi)對(duì)任意質(zhì)量濃度的根系分泌物都具有顯著趨化性，表明該菌對(duì)甜瓜根系分泌物的趨化性較強(qiáng)，可推測(cè)其在土壤環(huán)境中更容易向甜瓜根際趨化從而實(shí)現(xiàn)在根表的定殖成膜。在根系分泌物質(zhì)量濃度為0.10 mg/ml和0.30 mg/ml時(shí)，3株菌株的趨化性都具有顯著性差異，但菌株R1-6的趨化性指數(shù)（RCI）最低，且R1-6對(duì)其他質(zhì)量濃度的根系分泌物趨化性都不顯著，表明菌株R1-6對(duì)甜瓜根系分泌物的趨化現(xiàn)象較弱，這很可能造成其根際定殖能力較差并導(dǎo)致其實(shí)際防效不佳。為了驗(yàn)證推測(cè)，選取菌株R1-3和R1-6為研究對(duì)象，測(cè)試其根際定殖數(shù)量。結(jié)果表明，育苗16 d后，菌株R1-3在甜瓜根際的定殖數(shù)量達(dá)1.84×10⁷CFU/g，而菌株R1-6的定殖數(shù)量顯著低于R1-3，僅有2.2×10⁶CFU/g，說明其根際定殖能力較差。

2.4 菌株R1-3的其他生物學(xué)特性

菌株R1-3與不同植物（西瓜、黃瓜）?；图怄哏牭毒奥莶〔【钠桨鍖?duì)峙試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，該菌也能夠抑制這3種供試病原菌的生長。促生因子的定量測(cè)定結(jié)果表明，菌株R1-3具有一定的產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶解無機(jī)磷的能力，其分泌IAA的量為1.27 mg/L，溶磷量為39.65 mg/L，這可能是該菌促進(jìn)植物生長的原因。耐鹽能力檢測(cè)結(jié)果表明，菌株R1-3最高可耐受11%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaCl，達(dá)到中度的耐鹽水平^[24]，推測(cè)其在連作條件導(dǎo)致的鹽漬化土壤中具有一定的生存能力。綜上，可將菌株R1-3作為防控植物病害和促進(jìn)植物生長的功能菌進(jìn)行開發(fā)和利用。

2.5 菌株系統(tǒng)鑒定

將菌株R1-3的16S rDNA序列提交到NCBI中進(jìn)行比對(duì)，利用FigTree 1.4.4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示，R1-3與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）FZB42在同一分支，相似性最高，初步鑒定R1-3為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.）。

3 討論

芽孢桿菌具有生長速度快、環(huán)境友好以及抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在防控植物病害和促進(jìn)作物生長等方面都具有良好的表現(xiàn)，應(yīng)用前景廣闊^[27-29]。本研究首先在貧營養(yǎng)條件下分離細(xì)菌，然后初篩出能夠穩(wěn)定拮抗甜瓜枯萎病病菌且不影響種子發(fā)芽率的生防菌株，進(jìn)一步利用溫室盆栽試驗(yàn)復(fù)篩出對(duì)甜瓜幼苗枯萎病防控效果較好且具有促生作用的菌株R1-3。該菌被鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌，與貝萊斯芽孢桿菌的同源性較近，在以后的工作中需要進(jìn)一步確定其具體到種的分類地位。

生防芽孢桿菌可通過多種機(jī)制幫助植物抵御病原菌侵染，例如產(chǎn)生抗生素抑制病原菌生長、與病原菌競(jìng)爭養(yǎng)分和生態(tài)位及誘導(dǎo)植物系統(tǒng)產(chǎn)生抗性等^{[16，30-34]}，也可通過產(chǎn)植物激素IAA、溶磷增加養(yǎng)分獲取等促進(jìn)植物生長的方式間接發(fā)揮其生防功能^[35]。菌株R1-3能夠抑制不同植物?；图怄哏牭毒吐莶〔【纳L，可通過產(chǎn)IAA、溶磷等方式提高甜瓜幼苗株高及鮮質(zhì)量，兼具抵御病害和促生功能，然而其具體防病機(jī)制還有待更深入的研究。

研究中發(fā)現(xiàn)不能簡單地將生防菌的平板抑菌能力直接等同于該菌的病害防控能力。楊迪等^[36]在篩選鑒定香蕉枯萎病拮抗菌過程中發(fā)現(xiàn)拮抗菌盆栽防效強(qiáng)弱與其平板測(cè)試的抑菌活性高低并不一致。說明在篩選過程中，如果僅以實(shí)驗(yàn)室條件下的平板抑制率對(duì)菌株進(jìn)行取舍，很可能會(huì)遺漏一些實(shí)際防效好的菌株。王亞嬌等^[37]的研究也充分證實(shí)這一點(diǎn)，所以，提倡將平板對(duì)峙試驗(yàn)和溫室生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定（包括菌株對(duì)植物生長的影響及防病效果測(cè)定）結(jié)合起來，才能夠更準(zhǔn)確地評(píng)估拮抗菌的生防能力。本研究中的菌株篩選思路與此一致，然而此方法在篩選對(duì)象數(shù)目較多時(shí)，大量候選菌株的溫室生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定會(huì)產(chǎn)生較大的工作量。相關(guān)研究結(jié)果表明，微生物功能的穩(wěn)定發(fā)揮還要依賴于其在植物根際能夠有效定殖^[15]，菌株在植物根際的定殖能力又與其對(duì)根系分泌物的趨化性和生物膜形成能力緊密相關(guān)^[16]。因此，本研究進(jìn)一步探索了試驗(yàn)中獲得的代表性菌株的生物膜形成能力、趨化性及根際定殖能力，試驗(yàn)結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。實(shí)際病害防控能力最好的菌株R1-3對(duì)不同質(zhì)量濃度的甜瓜根系分泌物都具有顯著趨化性，還能形成強(qiáng)健的生物膜，并且具有較強(qiáng)的根際定殖能力。而在平板上表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制能力的菌株R1-6，雖然生物膜形成能力與R1-3沒有顯著差異，但其對(duì)根系分泌物的趨化性較弱，其根際定殖能力也相應(yīng)較差，這很可能是其在盆栽試驗(yàn)中防效不佳的原因。由此可見，生物膜形成能力相當(dāng)?shù)那疤嵯拢瑢?duì)根系分泌物趨化性強(qiáng)的菌株擁有更有效的根際定殖能力和對(duì)病害的實(shí)際防控能力。鑒于部分植物促生菌能夠有效利用根系分泌物從而實(shí)現(xiàn)根際定殖，崔曉雙等^[38]在根際促生菌的篩選工作中將菌株對(duì)根系分泌物競(jìng)爭能力的強(qiáng)弱作為初篩標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上減少了工作量且篩選出對(duì)根系分泌物中的營養(yǎng)物質(zhì)具有高競(jìng)爭能力的菌株。本研究結(jié)果表明，可以將平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果和根際定殖能力結(jié)合起來考量菌株特性，即把候選菌株對(duì)根系分泌物的趨化性和生物膜形成能力納入初篩標(biāo)準(zhǔn)，選擇綜合表現(xiàn)較好的生防菌株進(jìn)行溫室生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，生防芽孢桿菌R1-3是一株有著較強(qiáng)根際定殖能力的多功能生防菌株，下一步將探索該菌的規(guī)?；囵B(yǎng)條件和田間防效，以期為開發(fā)防控甜瓜土傳病害的生物肥料及微生物制劑奠定基礎(chǔ)。

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