牛乳蛋白過(guò)敏原檢測(cè)與改性及低致敏性乳制品研究進(jìn)展

張文華，朱 麗，付尚辰，李林強(qiáng)，劉永峰*

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

食物過(guò)敏是指人體的免疫系統(tǒng)對(duì)某一特定食物產(chǎn)生的一種不正常的免疫反應(yīng)，具體是指食物中所含的一些蛋白質(zhì)所引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)[1]。近年來(lái)，隨著食物過(guò)敏的發(fā)病率逐漸升高，食物過(guò)敏已成為世界范圍內(nèi)最受關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。我國(guó)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)約有2.69%的嬰幼兒對(duì)牛乳蛋白發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[2]，可牛乳不但是日常飲食中蛋白質(zhì)的良好來(lái)源，更是母乳缺少時(shí)的優(yōu)秀替代品[3]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將牛乳、雞蛋、魚(yú)、貝類、堅(jiān)果、花生、小麥、大豆和芝麻認(rèn)定為九大主要的食物過(guò)敏原，嬰幼兒則是牛乳過(guò)敏的主要受害人群。

牛乳過(guò)敏是指在牛乳蛋白分子進(jìn)入血液后，人體免疫系統(tǒng)與其發(fā)生過(guò)度反應(yīng)；由于乳制品在幼童時(shí)期是必需品，這也導(dǎo)致牛乳過(guò)敏成為嬰幼兒階段最常見(jiàn)的食物過(guò)敏類型[4]。部分消費(fèi)者在食用乳制品后會(huì)引起腸胃和呼吸道不適，極少數(shù)人還會(huì)引起休克或死亡[5-6]。當(dāng)前，牛乳過(guò)敏無(wú)法完全治愈，此類患者不得不嚴(yán)格避免攝入含有乳蛋白的部分乳制品，在很大程度上影響了對(duì)牛乳過(guò)敏人群的身體健康和生活質(zhì)量[7]。所以降低乳蛋白致敏性和開(kāi)發(fā)低致敏性乳制品是食品領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

針對(duì)牛乳過(guò)敏問(wèn)題，現(xiàn)階段研究熱點(diǎn)主要在對(duì)牛乳過(guò)敏蛋白進(jìn)行改性和尋找其主要致敏表位方面。最近的研究表明，還可以通過(guò)益生菌來(lái)調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)，從而起到緩解過(guò)敏反應(yīng)的作用。Basturk等[8]研究表明，鼠李糖乳桿菌可顯著緩解牛乳過(guò)敏患者的過(guò)敏癥狀。因此，利用合適的益生菌對(duì)過(guò)敏性乳蛋白進(jìn)行改性可能成為開(kāi)發(fā)低致敏乳制品的新研究熱點(diǎn)。本文綜述牛乳中主要的蛋白過(guò)敏原及其發(fā)生機(jī)理、過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)與改性方法，旨在為開(kāi)發(fā)低致敏性牛乳制品提供可靠的理論依據(jù)。

1 牛乳過(guò)敏的過(guò)敏原及其發(fā)生機(jī)理

大部分牛乳蛋白可能都會(huì)引起過(guò)敏，通常認(rèn)為牛乳過(guò)敏中最常見(jiàn)的過(guò)敏源是酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA），構(gòu)象表位和線性表位是它們的共同特征，細(xì)胞上的這2 種表位在被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別后會(huì)表現(xiàn)出致敏性。而牛血清白蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）等則被認(rèn)為是次要過(guò)敏原[9-10]。

牛乳過(guò)敏的介導(dǎo)類型分為免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、非IgE和二者兼有，其中第1種類型介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)最多[11]。IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是指在人體初次接觸到牛乳過(guò)敏原的情況下，乳蛋白經(jīng)過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞的吸收處理后，迅速呈遞給初始的CD4＋淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在過(guò)敏原和其他因子的刺激下，將不斷分化成不同的效應(yīng)T細(xì)胞，比如Th1、Th2、Th17和Treg等，然后則會(huì)刺激B細(xì)胞合成免疫抗體，再使肥大細(xì)胞與特定的Fc受體結(jié)合，最后這個(gè)結(jié)合受體與過(guò)敏原蛋白相結(jié)合，使機(jī)體處于致敏階段[12]。非IgE介導(dǎo)的類型主要包括食物蛋白誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎綜合征、過(guò)敏性直腸結(jié)腸炎、腸病等，這些疾病多由牛乳蛋白引起，主要發(fā)病人群為嬰幼兒和兒童[13]。但目前非IgE介導(dǎo)背后的免疫機(jī)制仍不明確，缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和生物標(biāo)志物，主要依靠病史、臨床癥狀和具有較高過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的口服食物激發(fā)實(shí)驗(yàn)來(lái)診斷。

牛乳過(guò)敏的原因有兩方面，一是乳中蛋白質(zhì)的組成和含量與人乳有較大差異，二是與人體消化系統(tǒng)和胃腸黏膜的免疫能力緊密相關(guān)[14]。免疫過(guò)敏反應(yīng)涉及到對(duì)蛋白質(zhì)表位進(jìn)行免疫識(shí)別，根據(jù)蛋白質(zhì)表位的結(jié)構(gòu)變化，將其分為構(gòu)象表位（由序列上沒(méi)有相連的氨基酸殘基經(jīng)過(guò)折疊而形成的結(jié)構(gòu)）和線性表位（由序列上有連接的氨基酸殘基經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵而形成的結(jié)構(gòu)）[15-16]。

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)，分為αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN。研究[17]表明，酪蛋白中免疫原性相對(duì)較強(qiáng)的肽段是αs2-CN對(duì)應(yīng)的肽段Ile86-Phe103，其與血清IgE反應(yīng)的強(qiáng)弱程度差異較大，且與乳中4 種酪蛋白的比例相關(guān)。牛乳α-LA與人乳α-LA的氨基酸序列具有高度相似性，但人乳蛋白質(zhì)是過(guò)敏性最低的，且人乳中的α-LA并不是一種主要過(guò)敏原，這表明牛乳α-LA的構(gòu)象表位在其過(guò)敏原性上起著重要作用[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@示[19]，在α-LA的三級(jí)結(jié)構(gòu)中肽段Val42-Asp49是過(guò)敏表位，α-LA中成環(huán)肽段Trp60-Met80和Cys91-Leu96是其主要的抗原位點(diǎn)。而胃蛋白酶不能消化水解β-LG，因此其可自由穿過(guò)胃腸道進(jìn)入血液循環(huán)中，在其三級(jí)結(jié)構(gòu)中肽段Pro48-Glu55是過(guò)敏表位，90%牛乳過(guò)敏患者的血清能識(shí)別的β-LG肽段為Val41-Trp60、Tyr102-Arg124和Leu149-Ile162[20]。由于這些過(guò)敏原在結(jié)構(gòu)和作用上并沒(méi)有很大的共同點(diǎn)，所以很難完全清除它們，另外這對(duì)牛乳本身也是一種巨大的營(yíng)養(yǎng)損失。

2 乳制品過(guò)敏源檢測(cè)技術(shù)

目前，針對(duì)過(guò)敏物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)有很多，根據(jù)檢測(cè)原理可以將其分為3 種：過(guò)敏原DNA聚合酶鏈反應(yīng)法、過(guò)敏原蛋白色譜法和免疫測(cè)定法。由于牛乳中幾乎不含與變應(yīng)性有關(guān)的DNA，因此最常用的檢測(cè)技術(shù)則是色譜技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，包括生物傳感器法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法和其他方法等。

2.1 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器主要包括食物適配體傳感器、食物免疫原傳感器、酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器等，其中免疫原和適配體傳感器可快速且簡(jiǎn)單地測(cè)定牛乳中的多重過(guò)敏原。Hong Liping等[21]將熒光檢測(cè)技術(shù)與適配體相結(jié)合，開(kāi)發(fā)具有高靈敏度和簡(jiǎn)單檢測(cè)程序的生物傳感器，為檢測(cè)過(guò)敏原酪蛋白與乳清蛋白提供了可行的策略，熒光團(tuán)以標(biāo)記或非標(biāo)記的方式與適配體結(jié)合，分析物濃度和其他信息通過(guò)激發(fā)光和識(shí)別元件的相互作用反映。Jiang Donglei等[22]提出并開(kāi)發(fā)了一種新的多功能、制作簡(jiǎn)單、一次性的電化學(xué)肥大細(xì)胞傳感器，成功用于靈敏測(cè)定牛乳中的主要過(guò)敏原酪蛋白，其電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的掃描電鏡、透射電鏡和Ca2＋濃度測(cè)定結(jié)果一致，檢測(cè)限為32 ng/mL。因此，生物傳感器方法可用于乳品過(guò)敏原的定量檢測(cè)，有效避免了復(fù)雜的操作和耗時(shí)的預(yù)處理，將成為現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)管時(shí)用于測(cè)定各種乳品過(guò)敏原的重要技術(shù)。

但生物傳感器的應(yīng)用局限性比較多，用于檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的適體傳感器仍處于初級(jí)發(fā)展階段，抗體的不穩(wěn)定性和高成本等限制了適體傳感器的發(fā)展。雖然適體的高度特異性反應(yīng)可以解決檢測(cè)器的交叉反應(yīng)問(wèn)題，但當(dāng)其他類似物共存或靶標(biāo)濃度較低時(shí)，這種微弱的非特異性信號(hào)的影響不能忽視。因此，提高特異性適體篩選技術(shù)水平是未來(lái)適體技術(shù)特異性研究的方向之一，相信科研人員能夠在實(shí)際應(yīng)用中逐步克服適體熒光傳感器的技術(shù)難題，并使其在環(huán)境檢測(cè)、健康和醫(yī)療領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

2.2 HPLC-MS法

過(guò)敏原的定量分析推動(dòng)了檢測(cè)技術(shù)向靶向MS法的發(fā)展，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法正是利用了其在單一分析實(shí)驗(yàn)中有著多重定量的能力。相比之下，LC-MS具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，它選擇蛋白水解肽作為過(guò)敏原蛋白的區(qū)別性特征，并在可調(diào)的提取、消化和儀器條件下選擇性優(yōu)化，主要用于過(guò)敏原的定量檢測(cè)。Ansari等[23]用胰蛋白酶初步消化牛乳蛋白，再通過(guò)MS技術(shù)對(duì)牛乳水解產(chǎn)物中的α-CN、α-LA和β-LG的特征肽進(jìn)行檢測(cè)，其中LIVTQTMK不僅是β-LG的標(biāo)志性肽，還是其主要的IgE表位肽，其檢出限為1.11 ng/mL，該方法是建立免疫分析方法的可能替代和比較方法的第1步，可作為測(cè)定不同食品中牛乳過(guò)敏原的參考方法。

LC-MS是將色譜與MS技術(shù)結(jié)合起來(lái)的有效手段，不但分析范圍廣、純化能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果也較穩(wěn)定；該方法具有快速、高自動(dòng)化以及同時(shí)檢測(cè)單一或多種靶蛋白的能力，但在此過(guò)程中，對(duì)預(yù)加工要求會(huì)變得更高。

2.3 ELISA法

ELISA法具有特異性強(qiáng)、速度快和易操作等諸多優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)過(guò)敏原β-LG最成熟的方法之一。根據(jù)ELISA檢測(cè)類型可分為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（competitor ELISA，cELISA）和夾心ELISA（sandwich ELISA，sELISA）。何圣發(fā)等[24]比較cELISA和sELISA檢測(cè)牛乳過(guò)敏原β-LG的靈敏性和特異性，發(fā)現(xiàn)sELISA比cELISA更加靈敏，線性關(guān)系也更好，且前者對(duì)牛乳和非牛乳制品的區(qū)分更加準(zhǔn)確；可能是因?yàn)楹笳咧恍枰环N特異性抗體，而前者卻需要2 種特異性抗體，對(duì)比之下，sELISA的特異性更強(qiáng)。

作為一種免疫檢驗(yàn)技術(shù)，ELISA法仍有不小的局限性。若在所檢測(cè)的樣本中含有乳清類的物質(zhì)，則會(huì)成為干擾實(shí)驗(yàn)的因素，而且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，影響結(jié)果的因素也很多，尤其是進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)樣品的預(yù)處理和環(huán)境對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大。因此，ELISA在實(shí)驗(yàn)時(shí)容易受重復(fù)性差、本身抗體和嗜異性抗體等的干擾，這時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果極易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

2.4 其他方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是基于過(guò)敏物質(zhì)DNA檢測(cè)的方法。PCR技術(shù)是使用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增最初目標(biāo)DNA序列，從而使檢測(cè)結(jié)果具有高度特異性，K?ppel等[25]研發(fā)了2 種可同時(shí)檢測(cè)乳品中幾種過(guò)敏原的六重實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，2 種測(cè)試系統(tǒng)對(duì)分析物都表現(xiàn)出良好的特異性和至少0.1%的檢測(cè)限。LAMP是一項(xiàng)相對(duì)較新的DNA擴(kuò)增技術(shù)，若要在等溫條件下快速實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)式增長(zhǎng)，可以使用LAMP法在特定的DNA聚合酶和4 條引物存在的情況下，特異性識(shí)別靶序列上的6 個(gè)位點(diǎn)[26]。Kim等[27]開(kāi)發(fā)了一種直接的雙聯(lián)實(shí)時(shí)LAMP測(cè)定法，用于同時(shí)檢測(cè)牛乳和山羊乳，發(fā)現(xiàn)此法的最低檢測(cè)限分別達(dá)到0.1、1.0 pg。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，本方法具有檢出限低、成本低、耗時(shí)短、技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)乳過(guò)敏原中具有廣闊的應(yīng)用前景。與蛋白質(zhì)不同，DNA分子即使在劇烈的食品加工過(guò)程中也保持著一定的完整性。DNA分子的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)快速、穩(wěn)定性強(qiáng)、不易發(fā)生交叉反應(yīng)、分析成本適中。在實(shí)際檢測(cè)中，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的檢測(cè)方法。

3 乳制品過(guò)敏源改性方法

近幾年來(lái)，降低乳過(guò)敏性的研究熱點(diǎn)都聚焦在對(duì)乳蛋白質(zhì)進(jìn)行改性上，所謂蛋白質(zhì)改性就是利用物理、化學(xué)和生物法改變氨基酸殘基和多肽鏈，使蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而獲得具有更好功能特性和營(yíng)養(yǎng)特性的蛋白質(zhì)。其中物理法包括超聲波處理、加壓改性、射線輻照及熱處理；化學(xué)法包括糖基化和其他化學(xué)修飾法；生物法包括發(fā)酵改性、基因技術(shù)、酶法交聯(lián)和酶法水解。

3.1 超聲波處理

超聲處理廣泛應(yīng)用于食品加工、化學(xué)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域，目前其在乳品行業(yè)中的應(yīng)用研究主要集中在清洗工具、滅菌、乳化和均質(zhì)方面[28]，乳品工廠合理利用此技術(shù)能節(jié)約大量時(shí)間。但超聲波處理在降低牛乳過(guò)敏性方面仍是一種新興技術(shù)，在乳制品中，高功率超聲波通過(guò)液體介質(zhì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)，液體中溶解的氣泡在超聲波的作用下發(fā)生振蕩，隨著時(shí)間的推移，多個(gè)氣泡之間會(huì)逐漸結(jié)合，當(dāng)氣泡達(dá)到一定尺寸時(shí)會(huì)發(fā)生潰滅[29]，而能量的釋放會(huì)使介質(zhì)的溫度和壓力升高，這些效應(yīng)會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成二級(jí)結(jié)構(gòu)改變、分子間發(fā)生相互作用和二硫鍵重組等變化[30]，這些變化對(duì)牛乳蛋白致敏性均會(huì)產(chǎn)生重大影響?，F(xiàn)已證實(shí)，超聲波與其他加工方式（紫外線、加熱、加壓等）聯(lián)合使用能發(fā)揮更顯著的作用[31]。

3.2 高壓改性

高壓處理牛乳是一種新型的非熱加工技術(shù)，其調(diào)節(jié)牛乳蛋白的致敏性是通過(guò)施加高壓來(lái)影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，從而迫使蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Bogahawaththa等[32]研究脫脂牛乳經(jīng)不同壓力處理后的變化，表明高壓通過(guò)巰基或二硫鍵相互作用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集，改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而削弱了蛋白質(zhì)的免疫原性。研究[33]顯示，若在低于80 MPa的壓力下對(duì)乳制品進(jìn)行動(dòng)態(tài)高壓處理，會(huì)導(dǎo)致乳制品中β-LG的抗原性增加；反之，若在高于80 MPa的壓力下處理牛乳，其中的β-LG的抗原性則會(huì)顯著降低。目前高壓處理的牛乳尚未進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，除了昂貴的成本之外，高壓處理牛乳還會(huì)導(dǎo)致其顏色從乳白色變成淡黃色[34]，這在一定程度上影響了消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望。

3.3 射線輻照改性

輻照技術(shù)是一種通過(guò)射線或電子束處理食品的方法。在射線輻照下，牛乳蛋白將會(huì)直接吸收能量，引起蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從而削弱乳過(guò)敏原引發(fā)Th2型過(guò)敏反應(yīng)的能力[35]。β-LG在輻照后會(huì)發(fā)生一系列的結(jié)構(gòu)和性能改變，蛋白質(zhì)聚集成高分子，破壞了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，并隨輻照劑量的增大而降低。當(dāng)輻照劑量達(dá)到10 kGy時(shí)，β-LG與IgE的結(jié)合能力降低到20%，而在20 kGy時(shí)完全消失，這說(shuō)明輻照時(shí)使用的劑量會(huì)嚴(yán)重影響牛乳蛋白結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)性，適當(dāng)?shù)膭┝靠山档瓦^(guò)敏原與IgE的結(jié)合率，雖然高劑量處理能很好地破壞過(guò)敏原表位，但其副作用更多，比如會(huì)導(dǎo)致牛乳風(fēng)味劣變和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量下降[36]。此技術(shù)目前還處于初級(jí)發(fā)展階段，其最終輻照產(chǎn)物的安全性還有待研究。Meng Xuanyi等[37]利用γ射線輻照牛乳，并用小鼠模型成功驗(yàn)證射線輻照能夠降低乳中過(guò)敏原的致敏性；Tammineedi等[38]利用紫外輻照后也顯示α-LA和乳清蛋白的致敏性分別降低25.0%和27.7%。

3.4 熱處理改性

熱處理可使蛋白質(zhì)通過(guò)共價(jià)作用或非共價(jià)作用形成一種具有一定程度遮蔽變應(yīng)原決定位置的熱誘導(dǎo)高分子，減少蛋白過(guò)敏性。一般在溫度55～70 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生擴(kuò)展，而在70～80 ℃會(huì)出現(xiàn)二硫鍵斷裂，使分子之間產(chǎn)生新的反應(yīng)；80～90 ℃下二硫鍵重排；在90～100 ℃下，β-LG與κ-CN以二硫鍵結(jié)合，形成一種凝膠，其表面性質(zhì)發(fā)生變化，表面積增加[39]。熱處理后的蛋白結(jié)構(gòu)改變的性質(zhì)與程度依賴與熱處理的時(shí)間和溫度有關(guān)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)也對(duì)其有影響[40]。牛乳經(jīng)熱處理后，其免疫原性分別降低至生牛乳的12.72%和18.74%。

實(shí)際上在過(guò)敏原改性中很少運(yùn)用單一技術(shù)，而是將多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。劉俊[41]使用超聲波輔助糖基化修飾法探究其對(duì)α-LA過(guò)敏性的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理會(huì)增加α-LA糖基化位點(diǎn)，未經(jīng)超聲波前處理的α-LA有5 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生糖基化修飾，而經(jīng)超聲波預(yù)處理后其糖基化位點(diǎn)增加了6 個(gè)，這種復(fù)合改性方法通過(guò)糖基化位點(diǎn)掩蓋α-LA的線性表位和增加糖基化程度，從而降低了α-LA的致敏性。一些物理復(fù)合改性技術(shù)如表1所示。

表1 物理法復(fù)合改性技術(shù)Table 1 Physical modification technologies for reducing the allergenicity of milk proteins

3.5 糖基化改性

糖基化法是一種用于抑制乳蛋白抗原性、改善其功能性質(zhì)的方法。目前已經(jīng)有很多成功的糖基化方法將糖原與β-LG結(jié)合，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的乳糖-β-LG產(chǎn)物可改變抗原的活性，通常將其作為修飾物，其中大部分都是具有較低抗原性和免疫原性的大分子物質(zhì)。Kobayashi等[46]研究表明，羧甲基葡聚糖（carboxymethyl dextran，CMD）可作為一種優(yōu)異的屏蔽物來(lái)決定抗原部位，它與β-LG結(jié)合后，可以得到高耐熱性且無(wú)過(guò)敏性的β-LG-CMD聚合物。此外，將葡萄糖胺（glucosamine，GLCN）、殼聚糖（chitosan，CHS）、海藻酸寡糖（alginate oligosaccharides，ALGO）和磷酸寡糖（phosphorylated oligosaccharides，PO）作為改良劑，可以結(jié)合成β-LG-GLCN、β-LG-CHS、β-LG-ALGO和β-LG-PO等復(fù)合物質(zhì)，Hattori等[47]研究中的ELISA結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)糖基化改性的乳蛋白抗原性和免疫特性均降低。

除利用糖基化外，還可以通過(guò)其他化學(xué)途徑降低牛乳的致敏性，以改善牛乳品質(zhì)。具體處理方法如表2所示。

表2 其他化學(xué)修飾法對(duì)乳蛋白改性的影響Table 2 Effects of other chemical modifications on reducing the allergenicity of milk proteins

3.6 乳酸發(fā)酵改性

在牛乳蛋白中，酪蛋白被認(rèn)為是致敏性最強(qiáng)的蛋白，利用乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵是降低牛乳中酪蛋白致敏性的最佳途徑[52]，乳酸菌菌株所產(chǎn)生的蛋白水解酶可使牛乳中的蛋白質(zhì)敏感表位數(shù)目減少，使其對(duì)免疫球蛋白的敏感性下降。臨床實(shí)例表明，滅菌乳經(jīng)37 ℃條件下乳酸菌發(fā)酵后，乳清蛋白的抗原力下降99%左右，但其變應(yīng)原卻未被完全去除，僅是顯著減少。Kordesedehi等[53]采用相似的方法對(duì)從駱駝生乳中分離的糞腸球菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明，糞腸球菌也能水解包括主要致敏表位在內(nèi)的αs1-CN的多個(gè)位點(diǎn)，可緩解牛乳過(guò)敏患者的過(guò)敏反應(yīng)。但該菌種在乳制品中的作用機(jī)理還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。Kleber等[54]還篩選出了一些能有效降低β-LG抗原性的乳酸菌菌株，經(jīng)發(fā)酵后與未發(fā)酵的脫脂乳和甜乳清相比，β-LG的抗原性下降可達(dá)90%和70%以上。

3.7 基因技術(shù)改性

牛乳生產(chǎn)中利用基因技術(shù)是為了提高乳的產(chǎn)量或組成，再利用基因工程方法對(duì)乳蛋白的過(guò)敏原表位進(jìn)行編碼，使其不能產(chǎn)生過(guò)敏性。Cui Chenchen等[55]效仿相似的技術(shù)，經(jīng)核移植后，將人體的乳鐵蛋白基因?qū)肷窖蝮w內(nèi)，通過(guò)分析山羊乳汁，發(fā)現(xiàn)純合子山羊分泌的乳汁中缺失β-LG，而雜合子山羊分泌的乳汁中乳鐵蛋白大量表達(dá)并抑制了β-LG的表達(dá)水平。此發(fā)現(xiàn)或許能夠制備一種完全消除β-LG過(guò)敏性的山羊乳，使牛乳過(guò)敏人群食用含高含量乳鐵蛋白且不含β-LG的牛乳制品成為可能。

3.8 酶法交聯(lián)改性

酶法交聯(lián)是指蛋白酶與類蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，使乳清蛋白與其他肽鏈進(jìn)行交聯(lián)，從而完成對(duì)多肽的修飾。在此反應(yīng)過(guò)程中，原過(guò)敏原蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞其過(guò)敏表位或?qū)⑵潆[藏于蛋白質(zhì)分子中，使牛乳蛋白的致敏性削弱。Róblewska等[56]通過(guò)將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（microbial trans-glutaminase，MTGase）加入到發(fā)酵后的牛乳中，研制出一種開(kāi)菲爾發(fā)酵型飲料，結(jié)果表明，該飲料中的乳過(guò)敏原不會(huì)與特定的抗體發(fā)生反應(yīng)。

3.9 酶法水解改性

酶法水解即利用蛋白酶催化具有過(guò)敏表位的牛乳蛋白片段水解，將乳蛋白水解為幾種不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過(guò)敏的小肽和游離氨基酸，此法在顯著降低牛乳蛋白抗原性的同時(shí)，還能提高人體對(duì)牛乳的吸收率[57]。牛乳蛋白酶改性工藝的關(guān)鍵在于酶的選擇，而目前由于乳蛋白的變應(yīng)性表位較多，所以要進(jìn)行相應(yīng)的酶解，但具體的酶解方式、酶解程度及酶解時(shí)所產(chǎn)生的各種反應(yīng)對(duì)牛乳的敏感度及風(fēng)味的影響機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

由于不同牛乳蛋白具有不同的致敏原表位，因此，酶法修飾的關(guān)鍵在于選擇合適的酶。梁肖娜[58]探究酶水解處理對(duì)牛乳主要過(guò)敏蛋白致敏性的影響，結(jié)果表明，堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶處理可以有效降解牛乳中α-LA、β-LG和α-CN，在最佳參數(shù)條件下，它們與IgE結(jié)合能力的抑制率分別高達(dá)44.24%、47.30%和50.07%。近幾年一些工業(yè)化酶發(fā)揮的作用效果如表3所示。

表3 部分工業(yè)生產(chǎn)酶的作用效果Table 3 Effect of some industrial enzymes on reducing the allergenicity of milk proteins

4 低致敏性乳制品開(kāi)發(fā)的研究進(jìn)展

隨著乳品科技工作者對(duì)牛乳過(guò)敏原的過(guò)敏表位和改性技術(shù)有了更深層次的認(rèn)識(shí)，如何在保證牛乳蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)損失較小的前提下研發(fā)出低致敏性且滿足人們口味的乳制品已迫在眉睫。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的小眾品牌低致敏性乳制品有以下幾種。

4.1 即食嬰兒配方乳粉

嬰兒配方乳粉是母乳喂養(yǎng)的即時(shí)替代品，人們正在不斷研究模仿母乳的成分，對(duì)于因過(guò)敏而不能耐受牛乳的嬰兒，建議食用低致敏性嬰兒配方乳粉。β-LG是牛乳中主要的過(guò)敏原且含量較高，通過(guò)調(diào)整其在乳中的占比能降低牛乳的致敏性。Wazed等[63]使用高壓輔助巴氏殺菌法（pressure assisted thermal pasteurization，PATP）加工牛乳時(shí)發(fā)現(xiàn)α-LA與β-LG的比值較高，相比高溫短時(shí)殺菌（high temperature short-time sterilization，HTST）技術(shù)能更好地制備低致敏即食嬰兒配方乳粉。加工時(shí)需向乳產(chǎn)品中添加適量具有生物活性的LF和α-LA，促使對(duì)過(guò)敏原β-LG的還原具有協(xié)同作用。此外，PATP比HTST對(duì)α-LA的保留率更高，對(duì)β-LG的保留率更低。但由于在PATP中LF的保留率較低，故在處理過(guò)程中應(yīng)多使用10%～20%的LF來(lái)補(bǔ)償差異，從而更能有效地降低嬰兒配方乳粉中過(guò)敏原β-LG的含量，對(duì)不能及時(shí)攝入母乳的嬰幼兒可喂食即時(shí)嬰兒配方乳粉。因此，采用添加LF和α-LA的新鮮牛乳，使用PATP法加工制作的即食嬰兒配方乳粉是一種具有低致敏性的新型乳產(chǎn)品。

4.2 豆乳混合物

目前許多乳品研究者關(guān)注于生產(chǎn)具有理想功能特性和理化特性的混合蛋白食品，大豆和牛乳均是高蛋白含量的食物，然而二者都會(huì)引起人體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。Xing Guangliang等[64]使用乳酸菌發(fā)酵聯(lián)合MTGase介導(dǎo)的改性方法探究其對(duì)牛乳和大豆乳-牛乳混合物中β-LG抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用MTGase處理時(shí)，可大幅降低大豆乳-牛乳混合物中β-LG抗體的結(jié)合反應(yīng)性（與單獨(dú)處理牛乳或大豆乳相比下降至37.1%），尤其在乳酸菌存在時(shí)β-LG的致敏性會(huì)進(jìn)一步降低至9.9%。由此可見(jiàn)，乳酸菌發(fā)酵與酶法水解的聯(lián)合使用比單一改性方法對(duì)降低過(guò)敏原β-LG的效果更加顯著，從乳酸菌發(fā)酵聯(lián)合MTGase處理大豆乳-牛乳混合物可大幅降低其中乳過(guò)敏原的潛在致敏性來(lái)看，大豆乳-牛乳混合物這樣的蛋白質(zhì)混合物也可用于生產(chǎn)低致敏性乳制品。

4.3 酶水解牛乳

蛋白酶的工業(yè)化集中生產(chǎn)，使許多人將乳制品的研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移到酶法改性蛋白質(zhì)方面。所謂的酶水解牛乳是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-凝乳蛋白酶等酶在高壓條件下生產(chǎn)出的一種低致敏性乳制品。Liang Xiaona等[65]研究并評(píng)估酶水解牛乳中過(guò)敏原的致敏性和抗原性，發(fā)現(xiàn)酶水解牛乳在體內(nèi)表現(xiàn)出較低的潛在致敏性，并且可防止體質(zhì)量減輕和腹瀉癥狀，緩解腸道過(guò)敏性炎癥；在其體外消化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白分離物的穩(wěn)定乳液中α-LA已完全消失，但仍然存在不少β-LG，可能是由于β-LG對(duì)酶消化具有極強(qiáng)的抵抗力，尤其是在胃腸道消化條件下使用胃蛋白酶，這與其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)相關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，酶水解牛乳仍然可有效緩解純牛乳所產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)，并顯著降低純牛乳中過(guò)敏原的致敏性。因此，利用胃蛋白酶或其他蛋白酶水解純牛乳所生產(chǎn)的一類乳制品也是一種新興的低致敏性乳產(chǎn)品。

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，牛乳中可被免疫細(xì)胞識(shí)別的過(guò)敏原的線性表位和構(gòu)象表位是導(dǎo)致人體發(fā)生牛乳過(guò)敏的主要原因，但乳蛋白的致敏表位可以利用物理、化學(xué)、生物乃至基因技術(shù)去破壞，從而減輕牛乳制品的強(qiáng)致敏性。由于酶法和發(fā)酵法合成的產(chǎn)品相對(duì)來(lái)說(shuō)比較安全，與其他方法相比，它們具有更大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力；同時(shí)，多種改性技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用比單一的改性技術(shù)能更好地抑制乳蛋白的致敏性。最后在減少人體過(guò)敏性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新出安全、有效的脫敏技術(shù)，研制出符合人們口味和營(yíng)養(yǎng)的新型乳類產(chǎn)品，還有待于進(jìn)一步研究。