等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)快速檢測沙門氏菌的研究

梁振瑞，張 薇，許紹坤，李鮮鮮，馮 紅，自武全

（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）

沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是常見的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500 個以上[1-3]。人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的食品，就會引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而導(dǎo)致食物中毒、急性腸胃炎等疾病，因此，沙門氏菌檢測是各個國家檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的必檢項(xiàng)目之一[4]。目前，檢測沙門氏菌的方法有很多，如酶聯(lián)免疫法[5]、PCR 法等[6]，但這些檢測方法都存在檢測過程煩瑣、檢測周期長的弊端[7]。近年來，隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的分析檢測方法迅速發(fā)展[8-9]。因此，建立一種快速簡便的沙門氏菌檢測方法具有重要意義。

等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)是核酸等溫擴(kuò)增和熒光技術(shù)結(jié)合的新型核酸診斷POCT 技術(shù)，針對目的片段設(shè)計4 ～6 條特異引物。使用DNA 聚合酶，通過添加熒光染料實(shí)時監(jiān)控整個擴(kuò)增過程，分析實(shí)時擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物熔解曲線對產(chǎn)物進(jìn)行定性或半定量。等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)對溫度精準(zhǔn)度要求低，只需要恒定溫度就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA 的變性，大大縮短了反應(yīng)時間。由于該方法具有操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，已被廣泛用于病原體的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病原菌

沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、惡臭假單胞菌（簡稱：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南國際旅行衛(wèi)生保健中心（昆明海關(guān)口岸門診部）提供。

1.2 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、OPG GENIE Ⅱ系統(tǒng)等溫擴(kuò)增熒光系統(tǒng)（OptiGene 公司）、恒溫水浴鍋、大龍移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

采用菌液直接擴(kuò)增法提取DNA，按1 ∶1 的比例加入裂解液與菌液混合，95 ℃水浴或金屬浴加熱5 min，備用。

1.3.2 引物的設(shè)計

利用美國NCBI 提供的BLAST 在線軟件分析沙門氏菌中的SSAQ 基因目標(biāo)序列，結(jié)合快速熒光PCR 法對目標(biāo)片段的要求，篩選出長度為1 079 bp穩(wěn)定的保守區(qū)域，作為引物設(shè)計的目標(biāo)片段，并利用目標(biāo)片段序列作為引物探針，針對保守區(qū)使用Lamp Designer 軟件設(shè)計引物SM-1，其包括1 對內(nèi)引物（FIP，BIP）和1 對外引物（F3，B3）。

1.3.3 等溫擴(kuò)增熒光法的建立

向擴(kuò)增反應(yīng)管中加入2.5 μL 沙門氏菌DNA，18.5 μL 反應(yīng)液，4 μL 引物，陰性對照加2.5 μL ddH2O，混勻。用GENIE Ⅱ設(shè)置擴(kuò)增程序65 ℃反應(yīng)40 min，熔解程序98 ～80 ℃，0.05 ℃為1 個循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（1）特異性檢測試驗(yàn)。用等溫擴(kuò)增熒光法對沙門氏菌和其他非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）菌株提取的DNA 分別進(jìn)行擴(kuò)增。

（2）靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10 倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10濃度檢測最低檢測限。取八連管，每管分裝18.5 μL Mix，4 μL 引物組，2.5 μL 樣本，用ddH2O 作陰性對照。65 ℃反應(yīng)40 min；熔解程序?yàn)?8 ～80 ℃進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增。

1.3.4 常規(guī)PCR 檢測沙門氏菌

（1）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。向擴(kuò)增反應(yīng)管中加入1 μL 沙門氏菌DNA（未稀釋），12.5 μL 反應(yīng)液，2 μL 引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混勻，設(shè)置一個空白對照，以ddH2O 代替，重復(fù)7 次，設(shè)置程序開始運(yùn)行。完成電泳后，將凝膠塊放置凝膠成像儀中，觀察電泳條帶。

（2）靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10 倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度檢測最低檢測限。設(shè)置一個原液濃度、一個空白對照，分別對擴(kuò)增后不同濃度的沙門樣本進(jìn)行電泳分析，根據(jù)其條帶的亮度和清晰度分析其最低檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計

引物設(shè)計完成后，使用BLAST 軟件比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物序列與沙門氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步證明SM-1 引物有比較高的特異性。

2.2 等溫擴(kuò)增熒光法

2.2.1 特異性檢測試驗(yàn)

對沙門氏菌和其他4 種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）同時進(jìn)行檢測，其結(jié)果只有沙門氏菌出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，起峰時間在30 min 以內(nèi)，將時間延長至1 h 后其他樣本也未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明該試劑盒只針對沙門氏菌進(jìn)行特異性檢測。

2.2.2 靈敏性檢測實(shí)驗(yàn)

由表1 可知，當(dāng)樣本檢測濃度大于等于10-4時，本試驗(yàn)所建立的等溫擴(kuò)增熒光檢測方法均能在30 min 內(nèi)檢出；當(dāng)檢測濃度低于10-4時未出現(xiàn)完整的擴(kuò)增曲線，說明建立的等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)能快速檢測沙門氏菌的濃度為10-4，檢測限為5.28×10-2ng·μL-1。

表1 靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 常規(guī)PCR 檢測沙門氏菌的結(jié)果

2.3.1 PCR 方法檢測沙門氏菌的重復(fù)性

對沙門氏菌的DNA（未稀釋）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，重復(fù)10 次，均可見清晰明顯的288 bp 大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果吻合，說明該引物重復(fù)性好。

2.3.2 PCR 方法檢測沙門氏菌的靈敏度

菌液稀釋到10-3時候擴(kuò)增效果不穩(wěn)定，有微弱的條帶但時常不會顯現(xiàn)，因此判斷10-2為常規(guī)PCR的最穩(wěn)定的最低檢測濃度，檢測限為5.28 ng·μL-1，詳見圖1。與等溫擴(kuò)增熒光法相比，檢測的靈敏度弱于等溫擴(kuò)增熒光法。

圖1 沙門氏菌不同濃度電泳結(jié)果

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法整個過程需4 ～5 d，且過程煩瑣[10]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在沙門氏菌診斷方法中具有較高的特異性和靈敏度，是沙門氏菌感染診斷中最具有應(yīng)用前景的一種方法。然而，常規(guī)PCR 檢測時間長，對反應(yīng)環(huán)境要求較高，且檢測儀器笨重。因此，建立一種反應(yīng)快速、操作簡單、特異性靈敏的方法至關(guān)重要。目前，等溫擴(kuò)增熒光法是一種能在恒定溫度下進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原物檢測、食品安全檢測和植物病原物的檢測等方面[11]，有著極為廣泛的應(yīng)用前景。

本文測試了4 種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法只對沙門氏菌的檢測結(jié)果呈陽性，而對4 種非沙門氏菌的檢測結(jié)果呈陰性，表明該方法特異性良好。同時梯度稀釋方法進(jìn)行沙門氏菌的靈敏度試驗(yàn)，并與常規(guī)PCR 檢測方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的等溫擴(kuò)增熒光法檢測沙門氏菌的靈敏度為5.28×10-2ng·μL-1，而常規(guī)PCR 的檢測限為5.28 ng·μL-1，比常規(guī)PCR 靈敏100 倍。

等溫擴(kuò)增熒光法不需要反復(fù)變換溫度，檢測速度、易攜性等方面比PCR 有很大的優(yōu)勢，有著操作簡單、快速、敏感性和特異性好等特點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景，是病原檢測的一項(xiàng)重要技術(shù)。