色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)在食品真菌毒素檢測中的應(yīng)用研究

黃志強

（鐘祥市公共檢驗檢測中心，湖北鐘祥 431900）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次級代謝產(chǎn)物，其通常會影響食品或飼料的品質(zhì)和安全性，因此對人們的健康有一定的影響。同時，真菌毒素也是食品、農(nóng)產(chǎn)品、藥用植物及其制劑的重要污染源之一[1]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了400 種以上的真菌毒素，其中有200 多種產(chǎn)毒絲狀真菌，如曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬[2]。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的一種毒素，含有B1、G1等羥基化代謝物，其中B1在糧食污染中較為常見，且其致癌性與毒性最強，容易導致肝癌。因此，黃曲霉素B1可作為食品安全性檢驗的一個重要指標。赭曲霉毒素是由鮮綠青霉、赭曲霉等代謝產(chǎn)生[3]，其中以赭曲霉毒素A的毒性最強，容易導致腸炎、腎病，甚至會誘發(fā)腎臟癌變。伏馬毒素是由串珠鐮刀菌等霉菌代謝所產(chǎn)生的一類真菌霉毒素，其中以伏馬毒素B 的毒性最強[4]。單端孢霉烯族化合物是由頭孢菌、鐮孢菌等代謝產(chǎn)生的有毒代謝物[5]。玉米赤霉烯酮是一種從禾谷鐮孢和其他鐮刀菌屬真菌中分解出來的次生產(chǎn)物，雖然毒性不強，但仍會對哺乳類動物產(chǎn)生一定的致病性。在適宜的環(huán)境下，真菌毒素會侵染農(nóng)作物，對人與畜的健康造成了極大的威脅[6-7]。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一種基于傳統(tǒng)色譜的分離分析方法，可同時實現(xiàn)真菌毒素的定性與定量測定。然而傳統(tǒng)的HPLC 在抗干擾能力、通用性方面上的表現(xiàn)較差，因此液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）技術(shù)得到了飛速發(fā)展。本文對食品中真菌毒素的檢測方法進行了深入分析，旨在為食品中真菌毒素的安全風險評價監(jiān)測提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap 質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）：美國ABI 公司；振蕩器，上海康華生化儀器制造有限公司；高速離心機，美國BECKMAN公司；N-EVAP 水浴氮吹儀，美國OA 公司；Milli-Q 超純水器，美國Millipore 公司。

1.2 試劑與材料

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）標準儲備液、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）標準儲備液、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）標準儲備液、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）標準儲備液、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）標準儲備液、伏馬毒素B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2）標準儲備液；甲酸﹑乙酸、甲醇和乙腈等均為色譜純；氯化鈉、氯化鉀﹑磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉等均為分析純；What-man 934-AH 玻璃微纖維濾紙；6 種毒素復合免疫親和柱。

1.3 方法

1.3.1 分析條件

（1）色譜條件。流動相A（甲醇）、流動相B（將1 nL 甲酸和0.0 771 g 的醋酸銨加水溶解后置于1 000 mL 的容量瓶中，并加入高純水定容至刻度線即得）[8]；色譜柱為C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：4 μL；流速0.3 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源采用電噴霧離子源，其具有獨特的離子碰撞反應(yīng)，可以有效進行元素分析。質(zhì)譜掃描方式采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式，通過多個不同的反應(yīng)來監(jiān)測物質(zhì)的存在，可以實現(xiàn)多元素的檢測和分析。

1.3.2 樣品提取

糧食中多組分真菌毒素的萃取溶液主要為甲醇和乙腈等有機溶劑與水的混合溶液[7]。實驗將兩種谷物混勻，使其粒度小于2 mm，選擇V乙腈∶V水∶V甲醇=80 ∶19 ∶1 的混合液作為提取液。稱取兩個25 g 的糧食樣品，加入100 mL 的萃取劑。在10 000 r·min-1以上的速度下快速均勻2 min，或在200 ～300 r·min-1的搖床上猛烈振動30 min。然后以4 000 r·min-1的速度離心5 min，將試樣的上清液放進潔凈的容器中。分別向離心后的殘渣中加入100 mL 的V水∶V甲醇=20 ∶80 的混合溶液，再次進行振蕩操作。再以4 000 r·min-1的速度離心5 min，將殘余物的上清移到上述的干凈的容器內(nèi)，混合搖勻為上清液。稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4，以及1.16 g Na2HPO4·12H2O，用800 mL 的超純水溶解后，將其溶液定容到1 L，作為稀釋液。此外，取混合均勻的上清液10 mL加入70 mL稀釋液，混合均勻，再用微型濾紙濾取后，即可獲得提取物。

1.3.3 提取液凈化

為了降低探測過程中的干擾，提高實驗檢測的準確度。在提取待測樣本前需要進行凈化處理。改進型固相萃取法的原理與固相萃取法相似，主要方法包括免疫親和柱（Immunoaffinity Chromatography，ICA）與多功能凈化柱（Multifunctional Column Cleanup，MFC）。ICA 又被稱為免疫親和色譜法，其利用抗原-抗體反應(yīng)，有選擇性地將被測物從復雜的環(huán)境中分離出來，再將抗體與不溶解的固體高分子進行共價結(jié)合，填充到色譜上[8]。此次實驗利用免疫親和色譜法對樣品進行純化，取提取液32 mL 上樣。復合免疫親和柱中液體排干后，上樣2 mL 洗脫劑，靜置3 min。然后以每秒1 滴的速度進行洗脫，并將其置于5 mL的離心試管中，待洗脫液在復合免疫親和柱中放凈后，取1 mL 的洗脫放液，靜置3 min。再以每秒1 滴的速度進行洗脫，并將收集到的洗脫液置于5 mL 的離心管中。按照V乙酸∶V甲醇=2 ∶98 的混合溶液進行兩次洗脫。將所采集的洗提物在50 ℃用氮氣進行干燥處理，并用1 mL 50%甲醇進行定容，即可獲得待測液。

2 結(jié)果與分析

此次實驗采用色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)對糧食承儲企業(yè)稻谷的真菌毒素進行檢測。先對樣品進行預處理，用微纖維濾紙過濾，得到提取液。然后用復合免疫親和柱對其進行凈化處理，獲得待測液。最后以50%甲醇為溶劑制備6 種不同的混合標準液。如圖1所示，為6種真菌毒素的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）色譜圖。

圖1 6 種真菌毒素MRM 色譜圖

由圖1 可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 和伏馬毒素B2這6 種真菌毒素的色譜峰峰形尖銳，分離度好，適合進行定性定量。根據(jù)6 種真菌毒素在質(zhì)譜MRM 模式下的響應(yīng)強度，配制出不同濃度的混合標準溶液。按照樣品前處理方法處理后，再進行測定分析。

由表1 可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B2這6 種真菌毒素的檢出限為0.5 ～50.0 μg·kg-1。取糧食承儲企業(yè)稻谷的空白糧食樣品，分別添加表1 中不同濃度的6 種真菌毒素混合標準溶液，按照樣品處理步驟進行操作，得到的平均回收率與相對偏差值結(jié)果如表2 所示。

表1 6 種真菌毒素的檢出限

表2 6 種真菌毒素平均回收率與相對偏差值結(jié)算結(jié)果

由表2 可知，此次實驗檢測的糧食樣品中6種真菌毒素加標量在2 ～800 μg·kg-1時，平均回收率為75.5%～102.5%，批內(nèi)的相對標準偏差為3.7%～9.7%。實驗結(jié)果表明，研究采用色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)測得糧食承儲企業(yè)稻谷的毒素結(jié)果滿足食品理化檢測要求。

3 結(jié)論與討論

為了檢測食品中的真菌毒素和代謝物的污染情況，對真菌毒素的檢測流程以及各項操作步驟進行分析，提出使用色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)對糧食承儲企業(yè)稻谷的真菌毒素進行檢測。結(jié)果表明，AFB1、DON、ZEN、OTA、FB1和FB2這6 種真菌毒素的色譜峰峰形尖銳，分離度好，適合進行定性定量分析，其檢出限在0.5 ～50.0 μg·kg-1。6 種真菌毒素加標量在2 ～800 μg·kg-1時，其平均回收率在75.5%～102.5%，批內(nèi)的相對標準偏差為3.7%～9.7%。這表明研究采用色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)滿足食品理化檢測要求。