趙 嵩
(馬鞍山市食品藥品安全檢查中心,安徽馬鞍山 243000)
腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)又稱三磷酸腺苷。ATP 是一切生命體能量的直接來源,普遍存在于動植物、細菌、真菌細胞和食物殘渣中,而無生命的碎屑物質中不存在ATP[1]。生物活性物質中的ATP含量是相對恒定的,借助“熒光素-熒光素酶”發(fā)光反應可對ATP 進行定量測試,從而反映出生物細胞量的殘留。ATP 與熒光素反應發(fā)出的熒光強度(Relative Light Unit,RLU)與活細胞數量基本呈正比例關系[2]。熒光值越高,表明ATP 的量越多,也就意味著表面的殘留物越多,清潔狀態(tài)越差。因此,ATP 檢測法就被用來快速檢驗物品表面是否潔凈。
RLU 值越高代表存在微生物污染風險的可能性越大,但ATP 不能替代微生物涂抹檢測,一般ATP的靈敏度可達到10-15mol ATP 標準物質(有的品牌甚至更高),以細菌為例基本也要達到103才能達到ATP 的檢測靈敏度[3]。研究表明,只有純微生物培養(yǎng)物而沒有任何食物殘渣的情況下,熒光強度(RLU)和菌落數(Colony-Forming Units,CFU)呈很好的正相關關系[4]。
ATP 生物發(fā)光技術由于具有操作簡單、快速、方便的特點,能夠簡單快速驗證清潔消毒效果而被廣泛應用于食品、制藥、醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)。隨著ATP 生物發(fā)光技術的普及,市場也涌現(xiàn)了大量的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)品牌,如3M、海凈納、龜甲萬、天隆、美正、巔峰、綠洲等品牌,其價格和性能差異較大,也造成了用戶選擇的困惑。
兩個品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)(包括ATP 熒光檢測儀和表面ATP 采樣拭子);Pipet-lite 移液槍(美國RAININ 公司);sx500 高壓滅菌鍋(日本TOMY 公司);ATP 標準品(Merck,貨號:A1852-1VL)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(ATCC 25922)、啤酒酵母菌(ATCC 10231)。
從2 ~8 ℃環(huán)境中取出ATP 表面采樣拭子,放置10 ~20 min 使其恢復至室溫狀態(tài)。撕開包裝袋,取出采樣拭子。拔出含有潤濕棉簽的手柄,若涂抹表面,則按Z 字形涂抹待測表面10 cm×10 cm 的區(qū)域;若檢測ATP 液體標準品,則將20 μL 待測標準品滴加至棉簽上。后將棉簽插回拭子內并按下,使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5 ~10 s,充分混勻后,插入對應品牌的ATP 熒光檢測儀,點擊快速檢測即可。
1.3.1 靈敏度
靈敏度是驗證一個系統(tǒng)/方法的重要性能指標。先進行陰性值檢測,來確定ATP 的本底值。兩種品牌分別取6 支拭子,無需取出棉簽,直接按下手柄使棉簽與反應液接觸,按照1.2 進行操作。靈敏度驗證方法為取ATP 標準品,稀釋多個濃度梯度,取1×10-13mol和1×10-15mol 兩個濃度,按照1.2 進行分別檢測,重復8 次。對比不同ATP 標準品濃度檢測值與陰性值,與陰性有顯著差異的最低檢測濃度為其靈敏度。
1.3.2 衰減率
ATP 反應激發(fā)后,其熒光信號會隨時間的延長逐步衰減,考慮到檢測人員在現(xiàn)場檢測的過程中易受外界因素的影響,衰減過快可能會影響檢測結果。衰減率的驗證方法為測定拭子在5 min 內的熒光檢測值衰減率,吸取20 μL 不同濃度梯度ATP 標準品稀釋液,測定兩個品牌的ATP 在反應開始后5 min 內的熒光衰減率,分別在反應1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min 時進行讀值。
1.3.3 重復性
精密度是保證獲得良好準確度的先決條件,一般情況下,測量精密度不好,就不可能有良好的準確度,而重復性是精密度的一個重要度量方式。取一份高濃度(1×10-13mol)ATP 標準品稀釋液,分別檢測兩個品牌ATP 在同一濃度下的重復性,檢測方法參考1.2。同一濃度ATP 標準品重復測試10 次,計算10 次結果的相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD),重復性用RSD 表示。
1.4.1 標準菌株檢測
選取較為常見的革蘭氏陽性細菌(大腸埃希氏菌,ATCC 25922)、革蘭氏陰性細菌(金黃色葡萄球菌,ATCC 6538)和真菌(酵母菌,ATCC 10231),分別檢測兩個品牌ATP 對不同菌體的檢測靈敏度。
取新鮮菌液,稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度,從兩個品牌的ATP 表面采樣拭子中取出棉簽,用移液槍準確移取20 μL 菌液滴于棉簽頭上,等待30 s,然后將棉簽插回檢測管內并按下,使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5 ~10 s,插入對應的ATP 熒光檢測儀,等待30 s,開始檢測。將得到的熒光值與菌落數一一對應。把不同濃度菌液的檢測熒光值與ATP 拭子自身陰性值進行對比,有顯著差異的最低濃度即為菌液的檢測靈敏度。
1.4.2 實際表面檢測
對桌面進行清潔消毒后,將桌面劃分為相鄰的20 塊10 cm×10 cm 的面積,分別用2 個品牌的ATP進行檢測,操作方法參照1.2。
由表1 可知,在標準品濃度為1×10-15mol 的 ATP水平上,兩個品牌ATP 仍能檢出RLU 值,且結果與陰性有顯著差異;10-15mol ATP 濃度下,品牌一檢測值約是品牌二的1.8 倍,陰性值約為1.5 倍,倍數關系基本一致,由于在10-15mol ATP 濃度的熒光值與陰性熒光值有較大差異,故二者的檢測靈敏度一致,均為10-16mol ATP。
表1 品牌一ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)靈敏度驗證結果
采用兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)檢測不同濃度ATP 標準溶液,由表2 可知,品牌一在濃度1×10-13mol 反應第5 min 時熒光值是最高熒光值的95%;在濃度1×10-15mol 反應第5 min 時,熒光值是最高熒光值的97%。品牌二在濃度1×10-13mol 反應第5 min 時熒光值是最高熒光值的94%;在濃度1×10-15mol 反應第5 min 時,熒光值是最高熒光值的89%。從數據上看,兩個品牌的衰退率都滿足實驗要求(25%以內)[5],但品牌一的衰減率表現(xiàn)更佳。
表2 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)衰退率驗證結果
在同濃度ATP 水平下,兩個品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)10 次檢測結果的RSD 均為9%,偏差值小于15%,均能滿足實驗要求,詳見表3。
表3 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)重復性驗證結果
采用金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(ATCC25922)、白色念珠菌(ATCC10231)3 種常見菌株,在不同菌株濃度下進行ATP 的驗證。結果顯示,兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)的檢測值顯示出穩(wěn)定的倍數關系,具體驗證結果見表4、表5、表6,且隨著菌株濃度的降低,檢測值均呈現(xiàn)較好的梯度關系。菌株在高濃度下,檢測值或存在偏低情況,與低濃度不完全呈線性關系,但影響較小。
表4 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)測試結果
表5 大腸桿菌(ATCC25922)測試結果
表6 白色念珠菌(ATCC10231)測試結果
選取同一桌面的相鄰區(qū)域,分別用兩個品牌的ATP 表面采樣拭子進行涂抹取樣和檢測,并計算其RSD。從表7 結果可以看出,兩個品牌的檢測值及其趨勢表現(xiàn)基本一致。
表7 兩個品牌實際表面檢測結果
通過上述驗證,兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)靈敏度一致,均為1×10-16mol,在衰減率、重復性測試上表現(xiàn)基本一致,兩個品牌在菌株檢測和實際表面樣品檢測中,檢測結果與線性趨勢基本一致,說明兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系在菌株裂解效力和檢測靈敏度上有很好的一致性。在實際驗證中,用戶可根據以上驗證方案,選擇重復性和衰減率更佳的品牌,至于靈敏度,可根據用戶對潔凈度要求情況來選擇,此外還需要結合性能和價格綜合考慮,最終篩選出最合適的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)。