先天性動(dòng)脈導(dǎo)管未閉致病基因MESP2新突變的發(fā)現(xiàn)與功能分析

嚴(yán)梓 陳春英 楊奕清 劉興元

先天性心臟?。–HD）作為最常見的出生缺陷可分為20 種以上不同的臨床類型，包括室間隔缺損、房間隔缺損和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉（PDA）等，可引發(fā)中樞神經(jīng)發(fā)育障礙或腦組織損傷、血栓栓塞性腦中風(fēng)、肺動(dòng)脈高壓、心力衰竭、室性心律失常甚至死亡[1-2]。遺傳流行病學(xué)研究結(jié)果表明，CHD主要由遺傳缺陷導(dǎo)致，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100 多個(gè)CHD致病基因，包括MESP1基因[3-6]。鑒于MESP2與MESP1的表達(dá)與功能特點(diǎn)部分重疊，有一定的相互代償功能[7-8]，因此，MESP2基因作為重要的CHD候選基因，有必要明確部分CHD 是否由MESP2基因突變所致。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016 年2 月至2019 年11 月間，選取同濟(jì)醫(yī)院兒科208 例CHD 患病兒童（病例組），其中男性110 例，女性98 例，年齡為（5±3）歲，范圍1～13 歲。對(duì)照組為232 名無先天性心臟病兒童，其中男性125 名，女性107 名，年齡（5±3）歲，范圍1～13 歲。2 組入選者皆為中國(guó)漢族人，均經(jīng)過臨床檢測(cè)，包括病史和家族史回顧、體檢、超聲心動(dòng)圖檢查。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果或心臟手術(shù)記錄診斷CHD[1]。病例組中有16 例患兒CHD 家族史陽性（約8%），對(duì)照組中無CHD 家族史陽性者，2 組均無CHD的非遺傳環(huán)境因素。研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）綜合征型CHD 或分子病因已明確的CHD 患者；（2）不同意參與研究。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情同意后，收集外周全血標(biāo)本，常規(guī)純化基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1MESP2的體外擴(kuò)增 借助軟件 Primer3web（https://primer3.ut.ee/）輔助設(shè)計(jì)擴(kuò)增MESP2基因2 個(gè)編碼外顯子的引物（由于編碼外顯子1 較大，分成2 段進(jìn)行擴(kuò)增）：編碼外顯子1 第1 段正向引物為5'-TGTCCCTCCCATACTTCCCG-3'，編碼外顯子1 第1 段反向引物為5'-GGCACTGCAGACT CTCCTCG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)685 bp；編碼外顯子1第2 段正向引物為5'-GACCAAGATCGAGACGCT GC-3'，編碼外顯子1 第2 段反向引物為5'-CCTT CCATTCTCCCCTCCGT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)683 bp；編碼外顯子2 正向引物為5'-TAGCAGAGTGTCT CCCGAGC-3'，編碼外顯子反向引物為5'-GCACC CAAGCTACAGGACTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)491 bp。以每位研究對(duì)象的基因組DNA 為模板，應(yīng)用化學(xué)合成的上述擴(kuò)增MESP2基因的引物和DNA 聚合酶試劑盒（美國(guó)NEB 公司），在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上對(duì)MESP2進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 混合物的總體積定為25 μL，包括10×PCR 緩沖液2.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、基因組DNA（40 ng/μL）2 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，雙蒸水18.875 μL。PCR的條件設(shè)定：95 ℃預(yù)變性30 s，接著進(jìn)行35 個(gè)熱循環(huán)，每1 個(gè)熱循環(huán)包括95 ℃變性30 s、62 ℃ 退火45 s 和68 ℃ 延伸1 min，最后68 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收后，用凝膠DNA 純化試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）純化備用。

1.2.2MESP2的PCR 測(cè)序分析 以純化后的MESP2的PCR 產(chǎn)物為模板，用1 條MESP2的擴(kuò)增引物和DNA 測(cè)序試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）在PCR 儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)混合物的體積定為20 μL，包括預(yù)混合液8 μL、雙蒸水8 μL、正向引物（2 μmol/L）2 μL和MESP2基因片段DNA（10 ng/μL）2 μL。測(cè)序反應(yīng)的條件設(shè)定[9]：共30 次循環(huán)，每1 次循環(huán)包括95 ℃變性20 s、50 ℃退火15 s 和60 ℃延伸l min。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化回收后在DNA 分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行測(cè)序。通過分析所測(cè)的MESP2序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中的MESP2序列（登陸號(hào)：NM_001039958.2）比對(duì)以識(shí)別MESP2變異。一旦發(fā)現(xiàn)MESP2變異，則測(cè)序分析232 名對(duì)照者的MESP2，同時(shí)檢索 SNP（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）和PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)以明確所檢測(cè)出的MESP2變異的新穎性。

1.2.3MESP2變異的致病性預(yù)測(cè) 借助軟件MutationTaster2021（https://www.mutationtaster.org/）預(yù)測(cè)MESP2變異的致病性。

1.2.4 構(gòu)建MESP2等的真核表達(dá)質(zhì)粒 以人心肌cDNA 為模板，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增MESP2全長(zhǎng)cDNA的引物（正向引物5'-CAGGAATTCAGCCTCCCAG AGCCTGCAGC-3'，反向引物5'-CTGCTCGAGG AAAGAGGGAAGCCGAGGCC-3'），通過PCR 獲得MESP2全長(zhǎng)cDNA。PCR 混合物的總體積定為50 μL，包括5×PCR 緩沖液10 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、cDNA（10 ng/μL）2 μL、DNA 聚合酶（2 U/μL）0.5 μL、雙蒸水31.5 μL。PCR條件：98℃預(yù)變性30 s，然后30 個(gè)熱循環(huán)，每1 個(gè)熱循環(huán)包括98℃變性10 s、62℃ 退火30 s 和72℃ 延伸1 min，最后72℃ 延伸8 min。用核酸內(nèi)切酶 EcoRⅠ和XhoⅠ分別消化純化后的MESP2全長(zhǎng)cDNA 和空質(zhì)粒pcDNA3.1，借助T4 DNA 連接酶將MESP2全長(zhǎng)cDNA 亞克隆入pcDNA3.1 質(zhì)粒，構(gòu)建野生型MESP2表達(dá)質(zhì)粒MESP2-pcDNA3.1 并測(cè)序證實(shí)。以野生型MESP2-pcDNA3.1 為模板，用1 對(duì)以突變點(diǎn)為中心、長(zhǎng)各為31 個(gè)核苷酸堿基的互補(bǔ)引物和定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校绹?guó)Agilent 公司），定點(diǎn)誘變PCR 獲得突變型MESP2-pcDNA3.1。用Dpn Ⅰ（美國(guó)NEB 公司）切除野生型MESP2-pcDNA3.1以獲得突變型MESP2-pcDNA3.1 并測(cè)序證實(shí)。NKX2.5 基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)的質(zhì)粒（NKX2.5-luc）構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.5MESP2突變的效應(yīng)分析 HEK 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法見參考文獻(xiàn)[10]。每次細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)用 600 ng 的 pcDNA3.1 空質(zhì)?；?600 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)?；?00 ng 的 Glu90*-突變型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)?；?300 ng 的 pcDNA3.1 空質(zhì)粒+300 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)?；?300 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)粒+300 ng 的 Glu90*-突變型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)粒，同時(shí)共轉(zhuǎn)染 1.0 μg 的NKX2.5-luc 質(zhì)粒和 10 ng 的pGL4.75 質(zhì)粒（美國(guó)Promega公司）。共轉(zhuǎn)染表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pGL4.75 旨在平衡轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48 h 收集并裂解HEK-293T 細(xì)胞。應(yīng)用雙報(bào)告基因分析試劑（美國(guó)Promega 公司）在熒光分析儀（美國(guó)Promega公司）上分析細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性之比表示靶基因NKX2.5 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

連續(xù)變量如研究對(duì)象的年齡、靶基因NKX2.5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性等用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；分類變量如研究對(duì)象的性別、種族等用例數(shù)（百分比）表示。兩組連續(xù)變量的比較用非配對(duì)Studentt檢驗(yàn)；兩組分類變量的比較選用Fisher 精確檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)值P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)MESP2新突變

本研究病例組（n＝208）與對(duì)照組（n＝232）均為漢族人，2 組間的性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)Fisher 檢驗(yàn)P＞0.05），年齡構(gòu)成差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)Studentt檢驗(yàn)P＞0.05）。通過對(duì)208 例CHD 患病兒童的MESP2的全部編碼外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，在1 例家族史陰性的6 歲PDA 女患兒中發(fā)現(xiàn)了1 種MESP2雜合突變，即NM_001039958.2: c.268G＞T（p.Glu90*）突變。對(duì)232 名對(duì)照組兒童的MESP2基因進(jìn)行測(cè)序分析沒有檢出該無義突變。該突變也不存在于SNP 或PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)，表明該MESP2突變是新突變。該例先天性PDA 患者的MESP2基因c.268G＞T 雜合突變及其野生型對(duì)照堿基序列見圖1。

圖1 MESP2 基因c.268G＞T雜合突變及其野生型對(duì)照堿基序列

2.2 MESP2新突變c.268G＞T為致病性突變

MESP2新突變c.268G＞T 被MutationTaster 2021 預(yù)測(cè)有致病性，該預(yù)測(cè)正確的概率接近于1（＞0.999 9）。

2.3 Glu90*-突變型MESP2 對(duì)靶基因NKX2.5 的轉(zhuǎn)錄激活作用消失

在轉(zhuǎn)染了多種基因表達(dá)質(zhì)粒的HEK-293T 細(xì)胞，600 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)粒和等量（600 ng）的Glu90*-突變型MESP2-pcDNA3.1 質(zhì)粒對(duì)靶基因NKX2.5 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)分別約為237 倍（237.04±20.94）和83 倍（82.97±11.72），兩組間的NKX2.5 啟動(dòng)子活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝11.12,P＜0.01）；而在同時(shí)轉(zhuǎn)染 300 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 和等量（300 ng）的Glu90*-突變型MESP2-pcDNA3.1 時(shí)，所產(chǎn)生的NKX2.5啟動(dòng)子活性約為127 倍（126.57±11.39），顯著低于600 ng 的野生型MESP2-pcDNA3.1 對(duì)靶基因NKX2.5 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)即237 倍左右，兩組間的NKX2.5 啟動(dòng)子活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.03,P＜0.01）。

3 討論

本研究在1 例女性PDA 患兒鑒定出1 個(gè)新的MESP2雜合突變即NM_001039958.2: c.268G＞T（p.Glu90*）突變。該MESP2無義突變不存在于232 名無CHD 兒童。功能研究揭示Glu90*-突變型MESP2對(duì)靶基因NKX2.5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活功能完全喪失，而NKX2.5基因功能缺失性變異已被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致多種類型的CHD，包括PDA[11-13]。因此，MESP2的新突變c.268G＞T 即 Glu90* 極可能是該例PDA 患兒的分子病因。

人類MESP2定位于15q26.1，編碼1種由397個(gè)氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄因子[10]。MESP2在人和小鼠胚胎發(fā)育期間大量表達(dá)于心臟，包括心房、心室和心臟流出道[10]，主要通過調(diào)控對(duì)心血管發(fā)育具有重要影響的靶基因如NKX2.5和GATA4等的表達(dá)，而對(duì)心血管的正常發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。不僅如此，NKX2.5和GATA4基因功能缺失性突變均已被證實(shí)可導(dǎo)致CHD[11-15]。本研究發(fā)現(xiàn)MESP2功能缺失性突變可導(dǎo)致PDA，提示MESP2基因單倍型不足可能是人類PDA 發(fā)生的罕見分子機(jī)制之一。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究表明，與MESP1類似，MESP2基因也與心血管發(fā)育有關(guān)[16]。在小鼠，MESP1和MESP2均大量表達(dá)于中胚層，而中胚層細(xì)胞發(fā)育成心臟、血管等組織結(jié)構(gòu)[16]。MESP1基因敲除可導(dǎo)致小鼠胚胎心臟發(fā)育畸形（心臟二分叉），表明MESP1基因是心臟正常發(fā)育所必須的[17]。盡管MESP2基因敲除小鼠心臟發(fā)育未見明顯畸形，但MESP1和MESP2雙基因敲除小鼠心臟發(fā)育畸形更加嚴(yán)重（未分化中胚層細(xì)胞聚集），而且MESP1和MESP2基因可以拯救彼此敲除所引起的一些發(fā)育異常，表明MESP1和MESP2基因功能上互相代償[7-8]。對(duì)基于基因編輯技術(shù)建立的遺傳工程小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，僅敲除MESP1或MESP2任何1 個(gè)基因未見心臟發(fā)育畸形，但同時(shí)敲除MESP1和MESP2雙基因可導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟發(fā)育畸形，而且補(bǔ)充MESP2可以完全糾正MESP1基因敲除所導(dǎo)致的異常[16]。這提示MESP2基因功能障礙可以導(dǎo)致人類心血管發(fā)育畸形。

值得一提的是，有報(bào)道MESP2基因突變可導(dǎo)致多種不同臨床類型的CHD，包括右心室雙流出道、法洛四聯(lián)癥、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、肺動(dòng)脈閉鎖、室間隔缺損、單心房、單心室和主動(dòng)脈離斷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)MESP2功能缺失性新突變可導(dǎo)致PDA，從而擴(kuò)大了MESP2基因突變的表型譜。