K+和Ca2+通透性離子通道調(diào)控血管干細胞作用的研究進展

馬穎，李鵬云

西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，醫(yī)學電生理教育部重點實驗室，四川省醫(yī)學電生理重點實驗室，四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川瀘州 646000

傳統(tǒng)觀點認為成體血管內(nèi)的細胞是終末分化的，近年來研究發(fā)現(xiàn)血管上存在多種類型的干細胞，包括內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)、平滑肌祖細胞(smooth muscle progenitor cells，SMPCs)、髓系祖細胞、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和周細胞等[1-4]。這些干細胞具有自我更新和多向分化潛能，在受損組織和器官的修復過程中發(fā)揮重要作用，在組織工程和再生醫(yī)學領域有廣闊的應用前景。正常生理條件下，干細胞參與調(diào)控和維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當血管受到損傷時，相關損傷信號可動員干細胞到機體受損區(qū)域并分化為成熟的血管細胞，參與調(diào)控血管的發(fā)育、修復和重塑等過程[5-6]。血管壁為血管干細胞提供了微環(huán)境，具有調(diào)節(jié)血管干細胞的發(fā)育及其與周圍細胞和細胞外基質(zhì)之間信號傳遞的能力。

血管干細胞的生物學特性受很多因素影響。近年來，離子通道對干細胞生物學行為的調(diào)控引起了人們的廣泛關注。離子通道是細胞膜上具有特殊親水性的一類疏水膜蛋白，可選擇性通透不同離子，是血管、神經(jīng)、肌肉等細胞電生理活動的物質(zhì)基礎。離子通道的正常結(jié)構(gòu)和功能是維持細胞生物活性的基礎，其結(jié)構(gòu)異常和功能障礙與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。血管上的離子通道，如鉀通道、鈣通道和瞬時受體電位通道等，幾乎在所有的血管細胞中都有表達[8-9]。多個離子通道協(xié)同維持正常血管功能，血管細胞離子通道功能紊亂是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[10-11]。目前已經(jīng)證實，不同類型的干細胞中都存在著多種離子通道[12]。離子通道的表達和生理特性隨干細胞的增殖、遷移和分化等過程發(fā)生改變，細胞內(nèi)外機械信號、生物化學刺激等可激活或抑制細胞膜上的離子通道電流，引起細胞膜電位改變進而影響干細胞的生物學活性[13]。目前關于血管干細胞離子通道的研究相對較少，離子通道產(chǎn)生的生物電信號在血管干細胞增殖、分化和遷移過程中的作用機制有待進一步深入研究。細胞內(nèi)K+和Ca2+之間的動態(tài)平衡對血管功能的調(diào)控至關重要。介導K+外流和Ca2+內(nèi)流的離子通道在血管的功能調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。本文將對血管上主要分布的可通透K+和Ca2+的離子通道在調(diào)控血管干細胞生物活性中作用的研究進展進行綜述，旨在為進一步揭示生理和病理狀態(tài)下離子通道的電活動對血管干細胞生物學活性的調(diào)控機制，為臨床心血管疾病的靶向防治提供新的思路。

1 鉀通道

關于干細胞鉀通道的研究主要集中于鈣激活鉀通道(Ca2+activated-K+channels，KCa)和內(nèi)向整流鉀通道(inward rectifier K+channels，Kir)等。鉀通道由胞內(nèi)配體(如Ca2+或ATP)調(diào)控，是溝通質(zhì)膜生理特性和胞內(nèi)代謝活動之間的橋梁。近年來，有研究認為K+可能與多功能信號調(diào)控有關。K+作為細胞內(nèi)的主要離子，鉀通道的功能狀態(tài)可作為評估干細胞生物學活性的一種指標[14]。見圖1。

圖1 血管上主要分布的鉀通道和鈣通道參與調(diào)控細胞的增殖、遷移和分化

1.1 鈣激活鉀通道 KCa通道作為鉀通道家族中的重要成員，主要參與維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、負反饋調(diào)節(jié)細胞膜電位、平滑肌收縮等，在血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)與功能調(diào)控研究方面具有重要意義。KCa通道依其單通道電導大小，分為大電導鈣激活鉀通道(big conductance KCa，BKCa)、中電導鈣激活鉀通道(imtermediate conductance KCa，IKCa)和小電導鈣激活鉀通道(small conductance KCa，SKCa)。

(1) BKCa通道：BKCa通道廣泛分布于各種組織的細胞膜，甚至線粒體內(nèi)膜。在可興奮細胞中主要通過調(diào)節(jié)細胞膜電位和細胞內(nèi)鈣信號，影響血管舒縮和神經(jīng)興奮性[15]。近年來，BKCa在干細胞功能調(diào)控中的作用日益受到關注。Echeverry等[16]報道5%的血小板裂解液(platelet lysate，PL)可通過激活BKCa通道促進大鼠MSCs 的遷移。另外，在MSCs 細胞周期的G2/M期，細胞膜上BKCa通道的表達顯著減少，提示BKCa通道的表達具有一定的周期依賴性，靶向BKCa通道對人子宮內(nèi)源性MSCs 的增殖具有促進作用[17]。Ayad等[18]首次發(fā)現(xiàn)BKCa通道存在于W8B2 陽性的成體心臟干細胞群，BKCa通道阻滯劑Paxilline 可使細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞的增殖。以上研究提示BKCa通道激活在促進血管干細胞的遷移和增殖過程中發(fā)揮重要作用，在不同類別干細胞功能調(diào)控中的具體機制還需要進一步研究。

(2) IKCa通道：IKCa通道(又稱KCa3.1，IK)由KCNN4 基因編碼，通道的激活具有鈣離子敏感度而不依賴電壓，在血管組織中廣泛表達，參與血管舒縮、炎性增生和組織纖維化等過程[19]。有研究表明，成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子可誘導IKCa表達上調(diào)，促進內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)增殖和血管生成[20]。此外，Vigneault等[21]報道骨髓MSCs 從G1期增殖到S期，KCa3.1 通道的表達顯著增加，采用RNA 干擾KCa3.1 通道的表達則可抑制細胞的增殖。在小鼠MSCs中，KCa3.1 通道、Kir 通道以及容量調(diào)控的氯通道CLCN3 的激活共同促進細胞周期蛋白Cyclin D1 和Cyclin E 的表達[22]。以上研究結(jié)果提示IKCa通道激活可促進干細胞周期蛋白的表達，靶向調(diào)控IKCa通道影響血管干細胞的增殖。

(3) SKCa通道：SKCa通道同樣對膜電位變化不敏感，僅由細胞內(nèi)Ca2+激活[23]。SKCa(SK)通道家族由3 個成員組成，即SK1(KCa2.1，KCNN1)、SK2(KCa2.2，KCNN2)和SK3(KCa2.3，KCNN3)。SK1～SK3 在神經(jīng)組織中表達豐富，參與調(diào)控神經(jīng)細胞膜電位以及后除極等，進而影響動作電位的頻率和時程。SK3 通道主要表達在未分化的神經(jīng)干細胞中，SK3 通道的激活可促進神經(jīng)干細胞絲狀偽足出芽和蛋白的轉(zhuǎn)運，進而促進細胞的增殖和遷移[24]。有研究表明，特異性敲除內(nèi)皮細胞SKCa可引起小鼠血管舒張反應下降，血壓升高，提示ECs中SKCa通道有望成為高血壓防治的新靶點[25]。此外，SKCa通道激動劑1-乙基-2-苯并咪唑啉酮可促進胚胎干細胞向心肌細胞的分化，誘導Ras-MEKERK 信號級聯(lián)反應的激活，進而引起心臟起搏細胞增多[26]。而SKCa通道的表達和功能改變是否參與血管干細胞生物學活性的調(diào)控則需要進一步的研究。

1.2 Kir 通道 Kir 通道在多種組織中廣泛分布。目前發(fā)現(xiàn)Kir 通道超家族有7 個亞家族(Kir1.x～Kir7.x)，盡管Kir 通道亞家族在功能上存在差異，但其都具有內(nèi)向整流特性，因而在保持血鉀平衡、維持細胞靜息電位等方面發(fā)揮重要作用[27-28]。此外，一些Kir 通道亞型，如G 蛋白激活的內(nèi)向整流K+通道(Kir3.x)和ATP 敏感K+通道(Kir6.x)是由細胞外配體和細胞內(nèi)ATP 觸發(fā)的，可調(diào)節(jié)多種細胞活動和信號級聯(lián)反應[29]。

近來研究發(fā)現(xiàn)，EPCs 中存在Kir2.1 通道，將Kir2.1 基因敲除的EPCs 移植到大鼠損傷股動脈段可促進損傷動脈的再內(nèi)皮化，并抑制新生內(nèi)膜的形成。用ML133 抑制Kir2.1 或Kir2.1 基因敲除可促進大鼠骨髓來源EPCs 的遷移和黏附以及向ECs 的分化，增加EPCs 中NO 的產(chǎn)生并促進ECs成管[30]。此外，阻斷Kir2.1 或敲除Kir2.1 會導致EPCs 適度去極化，細胞內(nèi)Ca2+和活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度增加，增強EPCs 功能和血管新生，最終促進動脈粥樣硬化損傷血管的修復[30]。另有文獻報道，Kir 基因敲除可顯著抑制SMCs 的增殖和遷移[31]。以上研究表明，內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1 通過促進干細胞的增殖、遷移和分化來調(diào)控血管的結(jié)構(gòu)和功能。因此，靶向調(diào)控干細胞Kir2.1 通道有助于促進疾病狀態(tài)下?lián)p傷血管的修復。

2 鈣通道

Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)控細胞的收縮、分泌、代謝、基因表達和細胞凋亡等過程。細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加主要有兩個來源，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)或肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)鈣庫Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流[32]。Ca2+內(nèi)流通過質(zhì)膜Ca2+通道(L型鈣通道、T型鈣通道、瞬時受體電位通道和CRAC通道等)調(diào)控細胞的增殖、遷移、分化和細胞黏附等過程。這些鈣通道不僅是Ca2+信號的主要貢獻者，也是Ca2+信號調(diào)控的重要靶點[33]。見圖1。

2.1 CRAC 通道 細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣庫Ca2+釋放激活的Ca2+內(nèi)流(Ca2+release-activated Ca2+，CRAC)通道調(diào)控細胞內(nèi)的Ca2+震蕩，與生理和病理狀態(tài)下細胞的增殖、遷移、分化、凋亡等生物學活性息息相關[34]。CRAC 通道具有極低的電導(在fS 范圍內(nèi)，大多數(shù)Ca2+通道的電導在pS 級)和極高的Ca2+選擇性(PCa/PNa＞1 000)[35]。CRAC 通道主要由STIM(STIM1 和STIM2)和ORAI(ORAI1、ORAI2 和ORAI3)組成[36-37]，CRAC 通道開放激活多個下游信號通路，調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生、基因表達以及細胞的增殖、分化、凋亡。有研究表明，ORAI1 介導的CRAC 通道對血管損傷后新生內(nèi)膜的形成至關重要。在血管損傷時VSMCs 中ORAI1 表達上調(diào)，CRAC 通道介導的胞外Ca2+內(nèi)流增加激活下游的NFAT 信號通路，促進VSMCs增殖和大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成[38]。高脂飲食16 周后，ApoE-/-小鼠血管EPCs 中STIM1和ORAI1 表達下調(diào)，自發(fā)的或VEGF 誘導的鈣庫操縱的鈣內(nèi)流(store operated calcium entry，SOCE)減少，EPCs 的增殖和遷移受到抑制，進而導致動脈粥樣硬化斑塊顯著增加[39]。此外，經(jīng)CRAC 通道的外Ca2+內(nèi)流可激活NF-κB 轉(zhuǎn)位入核，激活下游信號通路調(diào)控MSCs 的活性，而CRAC 通道抑制劑(SKF96365)則可抑制NF-κB 的核轉(zhuǎn)位，進而干擾MSCs 的增殖[40]。以上研究提示CRAC 通道介導的鈣信號在細胞周期調(diào)控中具有重要意義，靶向調(diào)控血管干細胞CRAC 通道將為再生醫(yī)學研究提供新思路。

2.2 L-型鈣通道 L-型鈣通道(L-type voltagegated calcium channels，L-VGCCs)廣泛分布于不同的組織和細胞中，在維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中起重要作用。L-VGCCs 主要由構(gòu)成孔道的α1 亞單位、輔助亞單位α2/δ、β 亞單位和γ 亞單位構(gòu)成。根據(jù)α1 亞單位，L-VGCCs 可分為Cav1.1～ Cav1.4 四個亞型，具有獨特的藥理學和生物物理學特性[41]。L-VGCCs 可被BayK8644 和FPL64176 激活，被尼伐地平(nifedipine)和尼莫地平(nimodipine)阻斷。

以往研究證實L-VGCCs 主要參與興奮性細胞的信號調(diào)控，如興奮收縮耦聯(lián)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌、基因轉(zhuǎn)錄等。近年來越來越多的研究表明，其在非興奮細胞如MSCs 的增殖和分化過程中也發(fā)揮重要作用[42-43]。然而，采用L-VGCCs 抑制劑可促進小鼠MSCs 分化成成骨細胞，但卻抑制大鼠MSCs 的分化。研究結(jié)果的差異可能與尼伐地平的非特異性阻斷有關，另外不同種屬組織來源的細胞L-VGCCs 亞型的表達差異也是原因之一[42]。人脂肪衍生的間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)具有分化成為多種細胞類型的能力。在TGF-β1 誘導分化的hASCs中，血管SMCs 中表達的L-VGCCs(Cav1.2)隨著Cavβ1 和Cavβ3 亞型的增 加而顯著增加。此外，L-VGCCs 激活可促進骨髓MSCs 增殖和向成骨細胞分化[44]，極低頻率的電磁場可促進L-VGCCs 介導的鈣內(nèi)流，激活FAK/Rho GTPase 信號通路進而促進MSCs 骨架重排和細胞遷移[44]。以上研究表明，進一步明確L-VGCCs 對不同組織來源干細胞增殖、遷移和分化的影響，將為組織工程學中以L-VGCCs 通道為靶點的研究帶來新的應用方向。

2.3 T-型鈣通道 T-型鈣通道(T-type voltagegated calcium channels，T-VGCCs)是一類激活電位較低、失活速度快、電導相對較小的電壓依賴性鈣通道[45]。T-VGCCs 家族包括Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3 三種亞型[46]。T-VGCCs 在血管ECs 中表達，血管緊張素Ⅱ可通過調(diào)控T-VGCCs 介導的鈣內(nèi)流進而促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移，這對于血管生成至關重要[46]。有研究發(fā)現(xiàn)Cav3.1 是新生內(nèi)膜形成過程中VSMCs 增殖所必需的，阻斷Cav3.1 有助于預防血管再狹窄，選擇性T-VGCCs阻滯劑能夠抑制野生型小鼠新生內(nèi)膜的形成[47]。此外，目前關于T-VGCCs 對干細胞生物活性的研究主要集中在神經(jīng)干細胞方面[48-49]，對T-VGCCs調(diào)控血管干細胞的作用和機制的研究相對較少。有限的研究表明阻斷CaV3.2 可抑制MSCs 胞內(nèi)鈣增加和細胞遷移。高遷移率族蛋白1 可通過PKA/β-catenin/γ-cystathionase 途徑促進T-VGCCs 介導的鈣內(nèi)流，從而促使MSCs 遷移和歸巢至損傷部位參與調(diào)控新生內(nèi)膜的形成[50]。由于T-VGCCs在血管等多種組織中廣泛表達，以及對生理和病理狀態(tài)下血管功能調(diào)控的重要作用[51-52]，研究TVGCCs 在血管干細胞功能調(diào)控中的作用和機制具有重要意義。

3 瞬時受體電位通道

瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)通道是在血管中廣泛表達的非選擇性陽離子通道，體內(nèi)外化學和物理刺激可激活血管內(nèi)皮和平滑肌細胞的TRP 通道引起胞內(nèi)Ca2+增加[53]。根據(jù)功能和遺傳相似性，TRP 通道可分為TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPML 和TRPP[53-54]。TRP通道具有較高的Ca2+選擇性。G 蛋白耦聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶途徑介導的信號可激活TRP 通道，引起細胞膜去極化和胞內(nèi)鈣濃度增加，進而調(diào)控生理和病理狀態(tài)下細胞的功能[55]。TRPC 和TRPV 亞型功能和(或)表達的失調(diào)參與調(diào)控血管平滑肌細胞從收縮表型轉(zhuǎn)換為合成表型，在肺動脈高壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[56]。目前關于血管干細胞TRP 通道的研究以TRPC 通道為主，主要集中于TRPC1 和TRPC3。

3.1 瞬時受體電位通道1 瞬時受體電位通道1(TRPC1)在EPCs 的功能調(diào)控中起重要作用。有研究表明，敲除TRPC1 可通過下調(diào)Calmodulin/eNOS 信號通路抑制EPCs 的增殖、遷移和成管，從而抑制小鼠體內(nèi)的血管生成[57]。TRPC1 基因敲除顯著抑制EPCs 外鈣內(nèi)流，導致細胞周期阻滯在G1期[58]。新近研究發(fā)現(xiàn)，TRPC1/ORAI1/ORAI3/STIM1 介導的Ca2+內(nèi)流可促進老年MSCs 的增殖以及發(fā)育為年輕的干細胞譜系，提示在再生醫(yī)學的研究中具有重要意義[59]。以上這些研究結(jié)果提示干細胞TRPC1 有望成為促進血管損傷后修復的新治療靶點。

3.2 瞬時受體電位通道3 目前研究表明瞬時受體電位通道3(TRPC3)對神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元網(wǎng)絡的形成至關重要。Hao等[60]研究表明，特異性敲除TRPC3 可顯著抑制小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)細胞的分化。最近有研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素可通過與TRPC3結(jié)合促進脂肪來源MSCs 分化為米色脂肪細胞，米色脂肪也具有產(chǎn)熱功能，這為肥胖等代謝病的防治提供了新的靶點[61]。此外，敲低MSCs 中TRPC3 可顯著降低NF-κB 的活化，并抑制MSCs分化來的CAF 細胞(MT-CAFs)的生長、遷移和侵襲，提示激活TRPC3/NF-κB 軸可促進MSCs 的分化，加速結(jié)腸癌的進展[62]。以上研究提示TRPC3在干細胞功能調(diào)控中起著重要作用，但其是否參與調(diào)控血管干細胞的功能活性進而影響血管的功能還需要進一步研究。

4 機械敏感的離子通道

機械門控Piezo 通道是進化保守的大分子跨膜蛋白，是機械敏感度陽離子通道家族中的一員，包括Piezo1 和Piezo2 兩個亞型[63-64]。相對于其他機械敏感通道，Piezo 具有離子非選擇性，并且在各種機械敏感細胞中廣泛表達。細胞微環(huán)境的機械刺激可激活Piezo 蛋白介導胞外Ca2+內(nèi)流，將機械信號轉(zhuǎn)化為生物化學信號，調(diào)控細胞的增殖和分化[65]。由于血管壁無時無刻不接受著血流剪切力刺激，因此機械信號可能通過激活Piezo 通道調(diào)控干細胞的增殖、遷移和分化等過程，進而影響血管細胞的骨架重排和血管發(fā)育[66-67]。應激誘導的Piezo 通道的開放也會激活分解素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域蛋白10(ADAM10)釋放酶，并激活Notch1信號通路進而促進祖/干細胞的分化和增殖[68-69]。依賴于ADAM10 的Notch 信號對早期血管的發(fā)育和新生至關重要，Notch1 和Notch4 已被證明可以調(diào)控小鼠血管床的發(fā)育，Notch 信號失活會抑制小鼠血管的生成[70]。以上研究均揭示Piezo 通道在干細胞的分化和發(fā)育中具有重要調(diào)控作用。

5 干細胞離子通道與血管疾病

研究表明，離子通道與心血管系統(tǒng)的生理功能和病理生理改變密切相關。動物模型和疾病相關實驗研究都表明離子通道在動脈粥樣硬化、高血壓、血管再狹窄等血管損傷后重塑中具有重要的調(diào)控作用[71]。通道功能、通道數(shù)量、通道電導和(或)開放概率的變化，以及通道亞單位或通道復合體之間時空效應的變化，都參與調(diào)控血管疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者與正常血壓者腸系膜動脈平滑肌細胞中BKCa通道的差異，首次證實VSMCs 中BKCa通道的活性在高血壓期間降低，并與通道β1 亞基基因和蛋白表達下調(diào)有關[15]。此外，過表達TRPC3 通道可增強VEGF 觸發(fā)的EPCs 外鈣內(nèi)流，促進細胞增殖和成管[72]。Miao等[58]報道，SOCE 降低可引起EPCs 功能障礙，阻礙動脈粥樣硬化過程中損傷內(nèi)皮細胞的修復?？傊?，關于血管疾病中干細胞離子通道的研究還比較有限，研究血管細胞間的離子通道信號網(wǎng)絡以及離子通道在血管干細胞中的作用將為臨床上相關疾病的防治提供新的思路。

6 結(jié)語

近年來，血管干細胞的研究取得了重大進展，尤其是在血管修復和重構(gòu)中對干細胞的激活、歸巢和分化機制的研究。離子通道被認為是生物電信號產(chǎn)生的基礎，影響各種干細胞的增殖、遷移和分化等生物學功能。然而目前血管干細胞中各種離子通道的作用和機制研究相對不足。雖然在不同類型的干細胞中發(fā)現(xiàn)了多種離子通道，但離子通道的異質(zhì)性表達是否與不同的細胞亞群和(或)細胞周期的不同階段有關尚不清楚。不同離子通道之間的相互調(diào)控機制、上下游信號通路等尚需要進一步的探討。因此，血管干細胞離子通道的研究將為心血管疾病的防治提供新思路，為再生醫(yī)學拓展新的研究領域。

目前，以干細胞離子通道為調(diào)控靶點的心血管疾病的治療尚無臨床報道。干細胞對血管功能的調(diào)控還有很多未解之謎需要進一步深入研究。首先，需要明確血管干細胞的異質(zhì)性，干細胞亞群在生理和病理狀態(tài)下的表征和功能特性，以及干細胞的發(fā)育和分化在轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組水平的變化與心血管疾病之間的關系。其次，疾病狀態(tài)下血管干細胞離子通道的異常表達和功能障礙對體內(nèi)干細胞生物學活性的影響，以及與血管功能障礙或損傷后修復之間的相關性及其調(diào)控機制等也是懸而未決的問題。

致謝感謝國家自然科學基金委的資助(82070502)和四川省科技創(chuàng)新苗子工程項目的資助(2022067)；感謝楊艷研究員對文章撰寫的指導和建議。

作者貢獻馬穎：撰寫文章初稿，查閱文獻和做圖；李鵬云：科研項目申請、文章撰寫的指導、修改以及投稿和校對。

利益沖突不存在任何利益沖突。