Rap1GAP 激酶通過 AMPK 信號通路影響宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的研究

李金秋，王玲，秦祥川，阿仙姑·哈斯木

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 836001

子宮頸癌(cervical cancer，CC)是常見的女性惡性腫瘤之一，同時子宮頸癌作為新疆地區(qū)的高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率正在逐年增加并趨向年輕化[1-2]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種機(jī)制，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是目前已知的引起宮頸癌的主要原因，除此之外，CC 的發(fā)生與免疫機(jī)制、家族遺傳、性生活紊亂等因素有關(guān)[3]。目前，手術(shù)、放療、化療等治療CC 的技術(shù)取得了很大進(jìn)展，新的治療方法也逐漸應(yīng)用于臨床，但無法控制淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移仍是疾病進(jìn)展、治療失敗的主要原因[4]。腫瘤細(xì)胞快速增殖和難以控制的盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成晚期宮頸癌患者死亡的主要原因[5]。

Rap1 GTP 酶激活蛋白(Rap1 GTPase-activating protein，Rap1GAP)是Rap1 的GTP 酶激活蛋白，可以使與Rap1 結(jié)合的GTP 水解為GDP，從而促進(jìn)蛋白失活[6]。Rap1GAP 家族作為腫瘤抑癌基因，近些年被研究者們逐漸認(rèn)識。Rap1 是Ras 家族的成員之一，是一種小分子G 蛋白，可影響細(xì)胞的增殖、黏附和血管生成等生理過程[7]。Rap1存在兩種構(gòu)象，與GDP 結(jié)合后使其失活，與GTP結(jié)合后可發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Rap1 活性失調(diào)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，故調(diào)控Rap1 活性的Rap1GAP也參與腫瘤的惡性進(jìn)展。已有研究顯示，Rap1GAP抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而顯著抑制胃癌的進(jìn)展[8]。在腦膠質(zhì)瘤中，Rap1GAP 表達(dá)較低，其低表達(dá)導(dǎo)致患者不良預(yù)后[9]。本研究旨在探索Rap1GAP 對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響以及可能的分子機(jī)制，為宮頸癌的發(fā)病機(jī)制研究及提高患者預(yù)后提供一定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌SiHa 細(xì)胞、C33a 細(xì)胞購于武漢普諾賽公司，正常宮頸上皮H8 細(xì)胞購于上海細(xì)胞庫。慢病毒由上海吉凱公司負(fù)責(zé)構(gòu)建；一抗：Rap1GAP (19174-1-AP)、E-cadherin (20874-1-AP)、N-cadherin (22018-1-AP)和 β-actin (20536-1-AP)購于美國ProteintechGroup 公司；AMPK (2532S)和p-AMPK (50081S)抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；DMEM 和MEM (NEAA)培養(yǎng)基購于武漢普諾賽公司；Trizol 試劑和逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒購于美國Themo 公司；實(shí)時熒光定量TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)的試劑盒購于日本的TaKaRa 公司；(356234) Matrigel膠購于美國的BD 公司。

2 生物信息學(xué)分析 從UCSC (https://xenabrow ser.net)數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的泛癌數(shù)據(jù)集：TCGA TARGET GTEx (PANCAN，N=19 131，G=60 499)，從中提取ENSG00000076864 (RAP1GAP)基因在宮頸癌樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，對每一個表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2 (x+0.001)變換，獲得該基因在宮頸癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

3 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌SiHa (HPV16 陽性)細(xì)胞系與正常宮頸上皮H8 細(xì)胞系使用DMEM 完全培養(yǎng)基，宮頸癌C33a (HPV16 陰性)細(xì)胞系使用MEM(NEAA)完全培養(yǎng)基，上述兩種細(xì)胞所用的完全培養(yǎng)基均包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

4 qRT-PCR檢測細(xì)胞Rap1GAP、E-cadherin 和N-cadherin 的基因表達(dá)水平 使用Trizol 法從細(xì)胞中提取總RNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA 。采用試劑實(shí)時熒光定量TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒對cDNA 擴(kuò)增分析。應(yīng)用β-actin 為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理后得到對應(yīng)基因的對表達(dá)量。Rap1GAP、E-cadherin、N-cadherin 和β-actin 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes detected by qRT-PCR

5 慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 OE-Rap1GAP、sh-Rap1GAP慢病毒及其對照慢病毒(NC-Rap1GAP)由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司負(fù)責(zé)構(gòu)建。按照公司提供的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將對數(shù)生長的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并制成(5～ 6) × 104/mL 的細(xì)胞懸液，分別吸取1 mL 細(xì)胞懸液置于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到50%時，棄去完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，24 h 后棄去無血清培養(yǎng)基并換成含血清培養(yǎng)基依據(jù)轉(zhuǎn)染手冊加入對應(yīng)慢病毒，轉(zhuǎn)染72 h后，用1 mg/mL 嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的宮頸癌SiHa、C33a 細(xì)胞，持續(xù)篩選時間為5～ 7 d 。將篩選存活下來的細(xì)胞使用2.5 μg/mL 嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)。

6 Western blot 檢測細(xì)胞Rap1GAP、E-cadherin、N-cadherin、AMPK 和p-AMPK 的蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞沉淀于細(xì)胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物中裂解30 min，將提取的蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶常溫封閉1.5 h，室溫一抗孵育1 h 40 min，隨后室溫二抗(稀釋比1∶10 000)避光孵育1 h，并通過ECL 化學(xué)發(fā)光儀顯影?？贵w稀釋如下：Rap1GAP (1∶800)，AMPK(1∶1 000)，p-AMPK (1∶1 500)，E-cadherin (1∶5 000)，E-cadherin (1∶4 500)，β-actin (1∶10 000)。

7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲與遷移能力Transwell 侵襲檢測：上室加入8～ 12 mg/mL 的Matrigel 60 μL，培養(yǎng)箱中放置2 h，隨后向上室中加入5 × 104/200 μL 的無血清細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基；Transwell 遷移測定：按照上述方法將2.5 × 105個細(xì)胞置于1 mL 不含血清的培養(yǎng)基內(nèi)，吹打混勻，吸取200 μL 的無血清細(xì)胞懸液接種于Transwell 的上室內(nèi)，下室為600 μL 完全培養(yǎng)基(含有血清)。24 h 后取出24 孔板，使用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，PBS 沖洗3次，每次5 min，使用1%結(jié)晶紫工作液室溫染色10 min，用PBS 清洗，倒置顯微鏡下觀察上室底面細(xì)胞數(shù)。

8 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力 使用6 孔板進(jìn)行克隆形成試驗(yàn)。將不同分組的細(xì)胞以2 × 103/孔的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7～ 10 d 觀察集落大小和數(shù)量。

9 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù) 結(jié)果 以±s表示，使 用GraphPad Prism 7 軟件和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)評估，兩組變量進(jìn)行比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組組間變量進(jìn)行比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 利用數(shù)據(jù)庫觀察到Rap1GAP 在宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常宮頸上皮組織相比，宮頸癌組織中Rap1GAP的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05，圖1A)。Western blot 技術(shù)在蛋白水平驗(yàn)證Rap1GAP 在子宮頸癌細(xì)胞(C33a、SiHa 細(xì)胞)和正常子宮頸上皮細(xì)胞(H8 細(xì)胞)中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與H8 細(xì)胞相比，Rap1GAP 在子宮頸癌C33a 細(xì)胞中高表達(dá)，在SiHa 細(xì)胞中低表達(dá)(P＜0.05；C33avsSiHavsH8：1.407 ± 0.149vs0.667 ± 0.092vs1.013 ± 0.132，F(xiàn)=25.236，P=0.001。圖1B)。

圖1 Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)A:數(shù)據(jù)庫中子宮頸癌組織和癌旁組織Rap1GAP 的表達(dá)水平(aP＜0.05，vs N 組)；B: Western blot 檢測Rap1GAP 蛋白在宮頸癌C33a 和SiHa 細(xì)胞以及正常宮頸上皮細(xì)胞H8 細(xì)胞中的相對表達(dá)水平(aP＜0.05，vs H8)Fig.1 Expression of Rap1GAP in cervical cancer tissues and cellsA: Expression level of Rap1GAP in cervical cancer tissues and adjacent tissues (aP＜0.05,vs N group);B: Western blotting was used to detect the relative expression levels of Rap1GAP protein in cervical cancer C33a and SiHa cells and normal cervical epithelial cells H8 cells (aP＜0.05,vs H8)

2 Western blot 驗(yàn)證宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Rap1GAP 載體及對應(yīng)空載體慢病毒感染C33a 和SiHa 細(xì)胞系，其中SiHa 細(xì)胞系構(gòu)建OE-Rap1GAP組(Rap1GAP 高表達(dá))與相應(yīng)NC-Rap1GAP 組(空載)；C33a 細(xì)胞系構(gòu)建sh-Rap1GAP 組(Rap1GAP低表達(dá))與相應(yīng)NC-Rap1GAP 組(空載)，Western blot 驗(yàn)證各組細(xì)胞Rap1GAP 蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，在SiHa 細(xì)胞系中，OE-Rap1GAP 組Rap1GAP表達(dá)量較SiHa 組顯著增加(1.664 ± 0.081vs1.051 ±0.124vs1.047 ± 0.06，F(xiàn)=44.110，P=0.001)；在C33a細(xì)胞系中，sh-Rap1GAP 組Rap1GAP 表達(dá)量較C33a組降低(0.396 ± 0.042vs1.058 ± 0.112vs1.103 ±0.091，F(xiàn)=62.614，P=0.001)(圖2A)。qRT-PCR 檢測結(jié)果與Western blot 結(jié)果一致(P＜0.01，圖2B)。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染SiHa、C33a 細(xì)胞后各組細(xì)胞Rap1GAP 蛋白及mRNA 表達(dá)情況A：Western blot 檢測Rap1GAP 蛋白表達(dá)情況(aP＜0.01，vs SiHa)；B：qRT-PCR 檢測Rap1GAP mRNA 相對表達(dá)水平(aP＜0.01，vs C33a)Fig.2 Protein and mRNA expression of Rap1GAP in SiHa and C33a cells after lentivirus transfection in each groupA: Rap1GAP protein expression was detected by Western blot (aP＜0.01,vs SiHa);B: Rap1GAP mRNA relative expression level detected by qRT-PCR (aP＜0.01,vs C33a)

3 Rap1GAP 表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SiHa 組相比，過表達(dá)Rap1GAP 的OE-Rap1GAP 組細(xì)胞集落形成顯著減弱(圖3A)。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP 組細(xì)胞侵襲和遷移能力降低(圖3B)。在C33a 細(xì)胞系中，與C33a 組相比，sh-Rap1GAP 組細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力增強(qiáng)。結(jié)果表明，上調(diào)Rap1GAP 表達(dá)可減弱SiHa 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

圖3 Rap1GAP1 的表達(dá)變化對宮頸癌細(xì)胞SiHa、C33a 惡性生物學(xué)行為的影響A：細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(上側(cè))和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(下側(cè))Fig.3 Effect of Rap1GAP1 expression on malignant biological behavior of cervical cancer cells SiHa and C33aA: Results of cell plate cloning experiment;B: Invasion test results (upper side) and migration test results (lower side)

4 Rap1GAP 通過AMPK 通路調(diào)控宮頸癌細(xì)胞EMT 途徑 Western blot 和qRT-PCR 檢測上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)標(biāo)記物相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP 組細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)升高，而N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)降低(圖4A，圖4C)。qRTPCR 檢測結(jié)果與Western blot 結(jié)果一致(P＜0.01，圖4B)。Western blot 檢測AMPK 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP組細(xì)胞內(nèi)p-AMPK 的表達(dá)降低(P＜0.01，圖4A，圖4C)，而非磷酸化AMPK 表達(dá)無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，C33a 細(xì)胞系各組結(jié)果與其相反。

圖4 Rap1GAP 表達(dá)變化對宮頸C33a、SiHa 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的影響A：Western blot 檢測AMPK 通路中p-AMPK、AMPK 和EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；B：qRT-PCR 檢測各個目的基因的相對表達(dá)水平(aP＜0.01,vs SiHa、C33a)；C：各個目的蛋白的相對表達(dá)水平(aP＜0.01，vs SiHa、C33a)Fig.4 Effect of Rap1Gap expression on EMT-related proteins and genes in cervical C33a and SiHa cellsA: Western blotting was used to detect the expression of P-AMPK,AMPK and EMT related proteins in AMPK pathway;B: Relative expression level of each target gene detected by qRT-PCR (aP＜0.01,vs SiHa,C33a);C: Relative expression level of each target protein(aP＜0.01,vs SiHa,C33a)

討論

2020年宮頸癌已成為全球發(fā)病率較高的婦科生殖道惡性腫瘤，在中國女性中，其發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[10]。隨著宮頸癌篩查方法、HPV 疫苗的普及和治療水平的不斷提升，我國宮頸癌患者5 年生存率相比以前有所提高[11]。對于宮頸癌患者而言，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)是治療不良的主要原因。因此，探究宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制，對于尋找新的治療靶點(diǎn)，提高患者的生存率具有重要的意義。

如前文所提到Rap1GAP 作為腫瘤抑癌基因，Rap1GAP 是Rap1 的GTP 酶激活蛋白，可促使與Rap1 結(jié)合的GTP 水解為GDP，從而促進(jìn)該蛋白失活。Rap1 作為小分子G 蛋白，可調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，如增殖、分化和細(xì)胞黏附等[12-13]。已有研究證實(shí)，Rap1GAP 作為抑癌蛋白在甲狀腺癌中呈低表達(dá)趨勢，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種周期蛋白，從而抑制細(xì)胞增殖，具體機(jī)制尚不清楚[14]。另一項研究中Rap1GAP 可抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展，降低Rap1GAP 表達(dá)可上調(diào)Rap1 活性，增強(qiáng)EAC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力[15]。本研究利用數(shù)據(jù)庫從中提取ENSG00000076864 (RAP1GAP)基因在宮頸癌樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Rap1GAP 在宮頸癌組織中呈高表達(dá)趨勢，這與上述研究結(jié)果不一致，故進(jìn)一步檢測Rap1GAP 蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常宮頸上皮細(xì)胞H8相比，Rap1GAP 在宮頸癌HPV16 陽性的SiHa 細(xì)胞中表達(dá)相對較低，在HPV 陰性的C33a 細(xì)胞中表達(dá)相對較高，提示Rap1GAP 的表達(dá)與HPV 病毒感染有關(guān)。

已有研究證明，Rap1GAP 在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)與HPV 感染有關(guān)。在人類乳頭瘤病毒感染的細(xì)胞中，E6TP1 作為與HPV16 E6 相互作用的靶蛋白，其羧基末端存在40 個氨基酸殘基與HPV16 E6 結(jié)合，發(fā)生泛素化，蛋白酶降解，激活Rap1 通路，導(dǎo)致腫瘤形成[16-17]。文獻(xiàn)指出，Rap1GAP 在宮頸癌Hela 細(xì)胞中表達(dá)相對較低，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力[18]。在本研究中，通過上調(diào)Rap1GAP 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞中與EMT 相關(guān)的蛋白E-cadherin 表達(dá)升高，N-cadherin 表達(dá)降低，抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，提示上調(diào)Rap1GAP 表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，但具體機(jī)制尚不清楚。AMPK 作為經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其異?；罨瘜?dǎo)致腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)改變，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。研究顯示，子宮頸癌GJB2 高表達(dá)通過抑制AMPK 的磷酸化促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移[19]。細(xì)胞因子Irisin 可通過激活A(yù)MPK 緩解高糖誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生[20]。三羥基異黃酮通過激活A(yù)MPK 信號通路導(dǎo)致宮頸癌Caski細(xì)胞周期G1 期阻滯，并誘導(dǎo)其凋亡[21]?？梢娔[瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移與AMPK 通路異常激活密切相關(guān)。然而，Rap1GAP 對宮頸癌EMT 的具體調(diào)控機(jī)制鮮有報道。本研究中，上調(diào)Rap1GAP的表達(dá)后，Western blot 結(jié)果顯示p-AMPK 表達(dá)顯著降低；下調(diào)Rap1GAP 表達(dá)后，p-AMPK 表達(dá)顯著上升，AMPK 無變化。因此推測Rap1GAP 通過改變EMT 途徑影響宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，該過程與異常的AMPK 信號通路有關(guān)。

綜上所述，Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)趨勢，過表達(dá)Rap1GAP 通過抑制AMPK 的磷酸化而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。但本研究仍存在不足之處，缺少體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和AMPK 通路中的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，因此后續(xù)會進(jìn)一步分析Rap1GAP 調(diào)控AMPK 通路的具體分子機(jī)制，為Rap1GAP 作為宮頸癌生物學(xué)行為的潛在分子標(biāo)志物提供醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)。

致謝 感謝UCSC (https://xenabrowser.net)數(shù)據(jù)庫宮頸癌數(shù)據(jù)共享。

作者貢獻(xiàn)阿仙姑·哈斯木：總體構(gòu)思，整體設(shè)計，審讀和修正；李金秋：研究構(gòu)思，實(shí)驗(yàn)實(shí)施，分析數(shù)據(jù)，論文撰寫；王玲、秦祥川：查閱部分文獻(xiàn)，數(shù)據(jù)收集和整理。

利益沖突本文作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明原始數(shù)據(jù)可通過Email：axia ngu75@126.com 向通信作者申請。