基于水凝膠的核酸藥物負(fù)載策略的研究進(jìn)展

李成昊,何東升*,涂家生*

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評價中心,江蘇 南京 210009;2.國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210009)

基因治療是指通過對目標(biāo)基因進(jìn)行引入、敲除或者改變其表達(dá)等方式,以達(dá)到治療或者預(yù)防疾病的目的[1]。根據(jù)對目標(biāo)基因的操控方式,基因治療主要有以下3種形式:①用健康基因替換導(dǎo)致疾病的突變基因;②敲除或沉默導(dǎo)致疾病的突變基因;③將新基因引入細(xì)胞以預(yù)防疾病[2]。核酸藥物的類型主要包括質(zhì)粒DNA(plasmid DNA,pDNA)、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、微小RNA(micro RNA,miRNA)以及信使RNA(messenger RNA,mRNA)等[3]。隨著基因治療相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,特別是近兩年來,已有多款基因治療藥物獲批上市,如用于遺傳性甲狀旁腺素淀粉樣變性的Tegsedi、杜氏肌營養(yǎng)不良癥的Vyondys 53和家族性部分脂肪營養(yǎng)不良的Waylivra等ASO類藥物,用于原發(fā)性高草酸尿癥1型的Oxlumo和成人原發(fā)性高膽固醇血癥的Leqvio等siRNA類藥物。此外,在新冠疫情肆虐的背景下,輝瑞/BioNtech的Comirnaty以及Moderna的Spikevax這兩款mRNA疫苗也獲批上市,開啟了mRNA藥物的新篇章?；蛑委煹年P(guān)鍵在于如何實(shí)現(xiàn)將核酸藥物精準(zhǔn)遞送至靶部位,降低脫靶效應(yīng),最大程度地發(fā)揮核酸藥物的療效[4]。由于核酸藥物易受到肝臟清除和核酸酶降解等因素的影響,因此核酸藥物需要合適載體的介導(dǎo)遞送,以保證有效的基因轉(zhuǎn)染[5-6]。

1 核酸藥物遞送系統(tǒng)

根據(jù)基因遞送載體的類型,可以將其分為病毒型基因載體以及非病毒型基因載體,病毒型載體盡管具有較高的轉(zhuǎn)染效率,但其具有潛在的免疫原性、基因突變風(fēng)險[7]和致癌風(fēng)險[8]。而非病毒基因載體由于其具有較低的免疫原性、無內(nèi)源病毒重組以及在遞送較大基因時限制較少,正成為核酸藥物遞送系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。非病毒基因載體系統(tǒng)需要克服遞送過程中的諸多挑戰(zhàn):載體首先需要能夠有效包載被遞送的基因,減少或避免被核酸酶降解;然后在靶組織富集,并根據(jù)治療的需要,釋放出所攜帶的基因以發(fā)揮作用[9]。非病毒基因載體中目前應(yīng)用最為廣泛的是陽離子類基因載體,如陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體等。陽離子類基因載體可以通過靜電吸附作用包裹壓縮核酸形成納米顆粒以保護(hù)核酸不被降解,同時促進(jìn)載體內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞,最終實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)染[9-11]。然而,非病毒載體相比于病毒載體具有較低的轉(zhuǎn)染效率,同時,其在肝臟以外的靶器官中的分布較少、滯留時間短,限制了非病毒載體的應(yīng)用,常需要重復(fù)給藥才能獲得有效的基因治療效果[12]。

基于非病毒基因載體的局部給藥和長時間緩釋是解決非病毒載體治療作用相關(guān)問題的重要手段[13]。將基于非病毒基因載體的遞送系統(tǒng)通過局部給藥的方式使其定位于靶器官中,并通過特殊的載體設(shè)計使其在靶部位提供持續(xù)的基因治療,可最大限度地減少其在非靶器官中的暴露,從而顯著提高非病毒載體的安全性和基因治療的療效。另外,持續(xù)的基因治療在再生醫(yī)學(xué)和罕見病等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景,例如血管生成和軟骨生成[14]等,可持久地增強(qiáng)受損組織的修復(fù)。

因此,非病毒基因遞送系統(tǒng)的選擇應(yīng)著重關(guān)注其體內(nèi)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率、靶向性,以確?；蛑委煹挠行院桶踩?。在各類非病毒基因載體中,水凝膠系統(tǒng)由于其良好的生物相容性、高效的核酸藥物負(fù)載能力和局部定位控制釋放等優(yōu)勢,為核酸藥物的遞送提供了有效的工具。本文對近年來水凝膠系統(tǒng)作為核酸藥物載體的研究進(jìn)行探討,并重點(diǎn)探討基于水凝膠的核酸藥物負(fù)載策略。

2 基于水凝膠的藥物遞送系統(tǒng)

水凝膠是一種由聚合物在水中通過交聯(lián)所形成的親水3D網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)[15]。它可以將高劑量非特異性分布的藥物精準(zhǔn)遞送至特定部位,同時實(shí)現(xiàn)藥物分子的持續(xù)控制釋放[16]。水凝膠系統(tǒng)具備以下幾個特點(diǎn):①其結(jié)構(gòu)中含有大量水分,使其可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)或組織的物理化學(xué)特性,同時有助于生物大分子的負(fù)載以及生物穩(wěn)定性的保持[17];②水凝膠可以通過局部注射的方式對目標(biāo)部位進(jìn)行定點(diǎn)給藥,具有天然的局部靶向特性以及優(yōu)異的藥物負(fù)載能力[18],被廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤和局部炎癥等局部治療中[19],可顯著提高患者的順應(yīng)性;③水凝膠具有較好的生物相容性以及[15]機(jī)械強(qiáng)度,被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[20]。

近年來,水凝膠也被開發(fā)用于核酸藥物的局部遞送和控制釋放,來避免對其他組織的潛在副作用以提高體內(nèi)療效。由于核酸藥物表面帶正電荷,如何將其均勻地負(fù)載于水凝膠中并實(shí)現(xiàn)可控的緩慢釋放是這類局部基因遞送系統(tǒng)亟須解決的問題。目前基于水凝膠的基因遞送系統(tǒng)主要有兩種遞送策略(見圖1),一種是由水凝膠直接負(fù)載核酸藥物;另一種則是先將核酸藥物與載體形成復(fù)合物,再利用水凝膠對復(fù)合物進(jìn)行遞送。

3 水凝膠介導(dǎo)的核酸藥物負(fù)載策略

核酸藥物中大量的磷酸基團(tuán)使其攜帶負(fù)電荷,因此陽離子水凝膠最早被應(yīng)用于核酸藥物的遞送。陽離子水凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的陽離子基團(tuán)可以通過靜電吸附作用與帶負(fù)電的核酸藥物結(jié)合形成水凝膠-核酸復(fù)合物,以達(dá)到負(fù)載核酸藥物的目的,同時強(qiáng)烈的靜電吸附作用還可以實(shí)現(xiàn)核酸的緩釋[21]。除了最常用的靜電吸附作用,近年來研究者們開始探索新的核酸負(fù)載策略,如通過對核酸藥物或者水凝膠材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來賦予其新的物理化學(xué)特性,從而借助共價結(jié)合或者疏水作用等將核酸藥物裝載于水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。

3.1 靜電吸附作用 靜電相互作用是目前大多數(shù)核酸藥物遞送載體負(fù)載核酸藥物所依賴的主要作用力,具有足夠的正電荷密度的聚合物載體(如聚乙烯亞胺和殼聚糖等)可以與帶負(fù)電的核酸形成復(fù)合物[22-23]。Ma等[24]使用可注射熱敏殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠直接負(fù)載si-RANK(靶點(diǎn)為RANK的siRNA,主要用于抑制破骨細(xì)胞成熟),實(shí)現(xiàn)了si-RANK在體外長達(dá)9 d的持續(xù)釋放以及持續(xù)的基因沉默,在給藥后的第9 d基因沉默效率仍可達(dá)到90%,體內(nèi)熒光成像顯示該負(fù)載si-RANK的水凝膠可以在注射部位停留至少7 d,顯著增強(qiáng)了siRNA治療的靶向性。雖然在體外具備優(yōu)異的緩釋效果,但體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),該制劑對小鼠注射給藥后36 h內(nèi)就有80%的siRNA突釋,這意味體內(nèi)可能存在加速殼聚糖降解的物質(zhì),Lee等[25]等通過酶降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的溶菌酶會顯著促進(jìn)殼聚糖的分解,因此在選用殼聚糖進(jìn)行體內(nèi)基因遞送時應(yīng)該注意核酸在體內(nèi)外釋放行為的一致性問題。Krebs等[26]使用摻有陽離子聚合物(殼聚糖和聚乙烯亞胺等)的海藻酸鹽水凝膠遞送siRNA,體外釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖和聚乙烯亞胺均會顯著降低siRNA的釋放速率,這可能是核酸藥物與陽離子聚合物之間的強(qiáng)烈靜電相互作用所導(dǎo)致的。

因?yàn)闅ぞ厶堑忍烊魂栯x子聚合物在體內(nèi)易被降解,研究者們開始通過對非陽離子聚合物進(jìn)行陽離子化修飾,以獲得更高且可控的正電荷,從而實(shí)現(xiàn)對核酸藥物的高效負(fù)載和控釋,這一修飾策略極大地擴(kuò)展了基于水凝膠的基因遞送的材料庫。Nguyen等[27]通過酯鍵將線性聚乙烯亞胺(LPEI)共價結(jié)合到葡聚糖(DEX)水凝膠骨架結(jié)構(gòu)中,陽離子化后的葡聚糖水凝膠以靜電吸附作用直接遞送裸露siRNA并實(shí)現(xiàn)長達(dá)14 d的可控釋放(見圖2),體外釋放14 d后基因沉默效率達(dá)到88.44%。作者發(fā)現(xiàn)水凝膠中共價結(jié)合的LPEI的越多,siRNA的突釋率越小,隨著LPEI與DEX之間相連的酯鍵的斷裂,LPEI可以與siRNA形成復(fù)合物進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。

圖2 共價連接有LPEI的葡聚糖水凝膠遞送siRNA示意圖

明膠是一類具有高生物相容性的天然高分子物質(zhì),它可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞[28],以明膠為基質(zhì)的水凝膠是性能優(yōu)秀的藥物載體,但是因?yàn)槠浔砻嫒狈ψ銐虻恼姾?限制了其作為基因載體的應(yīng)用。Chun等[29]對明膠進(jìn)行了陽離子化修飾,將酪胺(Tyr)與明膠(Gtn)共軛從而起到電荷調(diào)節(jié)和交聯(lián)作用,酪胺上的帶電氨基可以中和明膠結(jié)構(gòu)中帶負(fù)電荷的羧基,通過調(diào)節(jié)共軛的酪胺的含量,可以人為地調(diào)節(jié)明膠水凝膠的表面電荷,將改性前的明膠水凝膠的表面電荷從-3.25 mV最高可提升至+6.29 mV,為明膠水凝膠基質(zhì)創(chuàng)造了帶凈正電荷的環(huán)境,實(shí)現(xiàn)對si-SPARC(靶點(diǎn)為SPARC的siRNA,主要用于治療纖維化疾病)的負(fù)載(見圖3)。酪胺改性后的明膠水凝膠(Gtn-Tyr)在降解過程中與si-SPARC通過靜電吸附作用形成復(fù)合物,進(jìn)一步增強(qiáng)了si-SPARC的細(xì)胞攝取。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示,改性后的明膠水凝膠可以實(shí)現(xiàn)長達(dá)7 d的釋放,改性后的表面電荷越高,Gtn-Tyr與si-SPARC之間的靜電吸附作用越大,其24 h突釋率越小。因此,通過調(diào)節(jié)陽離子水凝膠內(nèi)正電荷的數(shù)量可以加強(qiáng)對核酸的束縛,從而減緩核酸藥物的釋放,降低突釋率,實(shí)現(xiàn)對核酸藥物的可控緩慢釋放。

圖3 Gtn-Tyr水凝膠的合成過程及降解后細(xì)胞內(nèi)化示意圖

3.2 共價結(jié)合作用 裸露的核酸藥物在陽離子水凝膠中的釋放行為主要受到其在水凝膠中的分布、與陽離子載體的靜電吸附作用、水凝膠的降解以及核酸藥物從水凝膠孔道中的擴(kuò)散等因素的影響,上述因素都會限制基于水凝膠系統(tǒng)的核酸藥物的精確時空遞送。通過對核酸藥物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,使其可以共價結(jié)合到水凝膠的基質(zhì)結(jié)構(gòu)中,可實(shí)現(xiàn)核酸藥物在水凝膠中的均勻分布以及可控釋放。

Nguyen等[30]對si-GFP末端進(jìn)行巰基化修飾,將其通過β-硫醚酯鍵共價連接到葡聚糖水凝膠中。在最初的24 h里,物理包埋si-GFP的葡聚糖水凝膠實(shí)驗(yàn)組體外累積釋放率即超過85%,而與si-GFP共價結(jié)合的葡聚糖水凝膠實(shí)驗(yàn)組的體外累積釋放率僅為30%,并且實(shí)現(xiàn)了長達(dá)14 d的緩慢釋放。共價鍵對核酸藥物的高束縛力大大降低了其在水凝膠中突釋效應(yīng),其釋放行為主要由共價鍵的斷裂速率所影響。然而作者發(fā)現(xiàn),釋放出的si-GFP很難轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,這可能是因?yàn)楹怂崤c水凝膠之間的共價鍵斷裂后形成了末端帶羧基的si-GFP,影響了si-GFP的生物活性。因此作者將si-GFP通過二硫鍵以及酯鍵連接到葡聚糖水凝膠中,使si-GFP以末端攜帶巰基或者羥基的形式釋放,但基因沉默效率仍僅能達(dá)到化學(xué)修飾前的20%～70%。隨后,Kim等[31]同樣將si-noggin(靶點(diǎn)為noggin的siRNA,主要用于增強(qiáng)成骨能力)通過二硫鍵及酯鍵共價結(jié)合到將殼聚糖水凝膠的骨架結(jié)構(gòu)中(見圖4),體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示該策略顯著降低了si-noggin在三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的突釋率,實(shí)現(xiàn)了si-noggin長達(dá)14 d的可控緩慢釋放,同時釋放出的si-noggin具備足夠的生物活性,14 d內(nèi)均觀察到足夠的基因沉默效率。

圖4 共價結(jié)合有siRNA的殼聚糖水凝膠合成示意圖

將核酸共價結(jié)合到水凝膠的基質(zhì)結(jié)構(gòu)中,可以顯著增強(qiáng)水凝膠對核酸的負(fù)載能力,使核酸均勻分布于水凝膠的基質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)中,核酸的釋放主要通過核酸和水凝膠骨架聚合物之間共價鍵的斷裂來控制的,因此,這種負(fù)載策略可以實(shí)現(xiàn)核酸藥物的可預(yù)測的緩慢釋放。然而,該策略需要對核酸進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,共價結(jié)合在水凝膠結(jié)構(gòu)中的核酸在共價鍵斷裂后是否具備足夠的生物活性是限制該策略的主要障礙。

3.3 疏水相互作用 由于大量磷酸基團(tuán)的存在,核酸通常是親水的,若要將核酸以疏水相互作用的形式負(fù)載于水凝膠基質(zhì)中,則需要對核酸進(jìn)行疏水化修飾。對核酸末端進(jìn)行膽固醇化修飾是一種常見的疏水化策略,經(jīng)膽固醇修飾后的核酸可以在體內(nèi)外被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[32-35],同時也可以顯著提高核酸在體內(nèi)的循環(huán)半衰期,提高核酸藥物的療效。近年來,已有多項(xiàng)研究將這類疏水化修飾后的核酸通過疏水作用力包埋于含有疏水腔的水凝膠中以達(dá)到緩釋的目的。

環(huán)糊精(CDs)是一類由6、7或者8個葡萄糖單元分子相連接的環(huán)狀寡糖,分別被稱為α-、β-和γ-環(huán)糊精[36]。由于其具有表面親水,內(nèi)部空腔疏水的特性,被廣泛用于藥物遞送系統(tǒng)中以克服諸如藥物溶解性、生物利用度和穩(wěn)定性等問題[37],因此可以將膽固醇化的核酸藥物以客體疏水相互作用的方式負(fù)載于環(huán)糊精中來實(shí)現(xiàn)基因遞送。Wang等[38]設(shè)計了一種由環(huán)糊精和金剛烷修飾的透明質(zhì)酸水凝膠,發(fā)現(xiàn)經(jīng)膽固醇修飾的miRNA-302(一種可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的miRNA)對CD表現(xiàn)出了較強(qiáng)的親和力(Ka=2×103M-1),因此它可以在疏水力的作用下結(jié)合到水凝膠基質(zhì)中廣泛存在的疏水空腔中(見圖5)。從體外釋放實(shí)驗(yàn)來看,這種疏水作用力可以大大減緩miRNA的釋放,使其釋放周期達(dá)到3周,而在體內(nèi)負(fù)載miRNA-302的水凝膠在給藥14 d內(nèi)均觀察到了小鼠心肌細(xì)胞的強(qiáng)勁增殖。

圖5 環(huán)糊精及金剛烷修飾的透明質(zhì)酸水凝膠通過主客體疏水相互作用遞送膽固醇修飾的miRNA示意圖

除了利用環(huán)糊精的疏水空腔來負(fù)載膽固醇化的核酸之外,Bakker等[39]還設(shè)計了一種由末端脲基嘧啶酮功能化的聚乙二醇(UPy-PEG)構(gòu)成的水凝膠,UPy單元可以通過4個氫鍵在水中二聚,導(dǎo)致UPy和PEG鏈中間的烷基間隔形成一個“疏水性口袋”,通過疏水作用力負(fù)載末端膽固醇化的siRNA(見圖6)。經(jīng)體外釋放實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)膽固醇修飾siRNA(siRNA-chol)的釋放周期可以長達(dá)45 d,負(fù)載低濃度siRNA-chol的水凝膠在第1天出現(xiàn)了20%的突釋,而在負(fù)載高濃度的siRNA-chol的水凝膠第1天的突釋率則降至了10%,這說明末端疏水化的siRNA-chol分子對水凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水口袋具有非常強(qiáng)的親和力,從而展現(xiàn)了較強(qiáng)的緩釋能力。從水凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)中釋放出來的siRNA-chol由于末端膽固醇化仍然具有足夠的生物活性,可以在沒有轉(zhuǎn)染試劑的幫助下自行進(jìn)入細(xì)胞,維持足夠的轉(zhuǎn)染能力。在這種水凝膠-核酸復(fù)合物中,siRNA-chol的釋放動力學(xué)主要取決于siRNA-chol與水凝膠網(wǎng)絡(luò)之間的疏水結(jié)合力而不是siRNA-chol在水凝膠中的擴(kuò)散行為。

圖6 具有“疏水口袋”的Upy-PEG水凝膠通過疏水相互作用遞送膽固醇修飾的siRNA

表1 基于水凝膠的核酸藥物負(fù)載策略總結(jié)

核酸末端的膽固醇化可以使核酸部分疏水化,由此可以利用疏水力將其結(jié)合到含有疏水空間的水凝膠網(wǎng)絡(luò)中,以實(shí)現(xiàn)長時間的緩釋。核酸的膽固醇化還加強(qiáng)了核酸本身進(jìn)入細(xì)胞的能力,避免了陽離子轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性。這種無需陽離子轉(zhuǎn)染試劑即可在水凝膠中實(shí)現(xiàn)超長時間緩釋的策略可以顯著提高核酸藥物臨床應(yīng)用的安全性。

4 總結(jié)與展望

水凝膠在需要多次給藥的基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景,如何將核酸藥物均勻且可響應(yīng)性的負(fù)載于水凝膠中是研究的難點(diǎn)。將核酸藥物通過靜電吸附、共價結(jié)合或疏水相互作用等直接負(fù)載于水凝膠體系中為基于水凝膠系統(tǒng)的基因遞送提供了解決方案,表1總結(jié)了常見的基于水凝膠的核酸藥物負(fù)載策略。然而,研究表明將核酸藥物直接負(fù)載于水凝膠中可能無法保證其轉(zhuǎn)染效率,從而影響治療效果。因此,近年來研究者們開始廣泛研究利用水凝膠系統(tǒng)負(fù)載核酸載體復(fù)合物。相比直接遞送核酸藥物,這類復(fù)合遞送系統(tǒng)為核酸藥物提供了良好的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞攝取能力以及更可控的緩釋能力,為基于水凝膠體系的核酸藥物的負(fù)載提供了新的解決方案。但該類復(fù)合遞送系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化仍面臨一些亟待解決的問題,比如:負(fù)載核酸的載體使整個水凝膠系統(tǒng)處方組成更加復(fù)雜,制備難度加大;受水凝膠和核酸載體復(fù)合物的降解行為的雙重影響,使得核酸藥物的釋放行為難以預(yù)測和控制;核酸載體復(fù)合物在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的分布不均一等。因此,在未來的研究中,還需要重點(diǎn)在以下幾個方面進(jìn)行探索:繼續(xù)尋找低毒且能高效轉(zhuǎn)染的核酸載體材料;充分利用核酸載體復(fù)合物,以及該復(fù)合物與水凝膠系統(tǒng)的相互作用,從而避免其在水凝膠中聚集而分布不均的問題;開發(fā)更多可智能響應(yīng)的載體納米載體,以實(shí)現(xiàn)核酸藥物在水凝膠系統(tǒng)中更為可控和可預(yù)測的緩慢釋放,最終實(shí)現(xiàn)更高效精確的局部靶向治療。水凝膠是目前進(jìn)行局部基因治療最理想的工具之一,對基于水凝膠的基因遞送系統(tǒng)進(jìn)行更深入的研究,有望在疾病預(yù)防、實(shí)體瘤治療以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面取得突破,促進(jìn)基因治療更進(jìn)一步的發(fā)展。