擬南芥GOX1基因的克隆和表達(dá)分析

田蜜蜜, 穆秀杰, 張瑞含, 韓 毅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

光合作用是綠色植物吸收光能將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為有機(jī)物同時釋放氧氣的過程。光合作用為植物的生長發(fā)育提供物質(zhì)和能量[1]。光呼吸作用伴隨著光合作用同時進(jìn)行,是綠色植物在光照條件下消耗氧氣同時釋放二氧化碳的過程[2]。研究表明,光呼吸和光合作用不僅在代謝途徑上彼此相關(guān),在代謝調(diào)節(jié)上也相互制約[3]。光呼吸作用始于核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)所催化的反應(yīng)[4]。在葉綠體內(nèi),Rubisco催化的加氧反應(yīng)產(chǎn)生1分子的2-磷酸乙醇酸和3-磷酸甘油酸,2-磷酸乙醇酸在2-磷酸乙醇酸磷酸酶催化作用下,去磷酸化生成乙醇酸[5]。乙醇酸在乙醇酸甘油酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和膽汁酸鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用下運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),然后通過未知的孔蛋白或通道進(jìn)入過氧化物酶體[6]。在過氧化物酶體中,乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)催化乙醇酸生成乙醛酸并產(chǎn)生過氧化氫[7]。GOX是植物光呼吸過程中的關(guān)鍵酶之一,不僅在光呼吸過程中發(fā)揮了重要的作用,還參與到植物的各種脅迫響應(yīng)過程中,并且其活性也受到多種脅迫的誘導(dǎo)。例如豌豆在干旱脅迫條件下其GOX活性顯著上調(diào)[8];病原菌入侵的條件下,大麥的GOX活性也大幅上升[9]。此外,GOX催化乙醇酸產(chǎn)生的過氧化氫參與到植物的脅迫響應(yīng)過程中,從而激活一系列的下游防御反應(yīng)[10]。

擬南芥GOX基因家族中有GOX1(At3g14420)、GOX2(At3g14415)、GOX3(At4g18360)、HAOX1(At3g14130)和HAOX2(At3g14150)5個成員[11]。相對于其他4個成員而言,缺乏GOX1的擬南芥體內(nèi)表現(xiàn)出更高水平的乙醇酸的積累,表明GOX1是代謝乙醇酸并產(chǎn)生過氧化氫的主要異構(gòu)體,并且在光呼吸進(jìn)程中起主要的作用[12]。因此GOX1對于研究植物抵抗逆境脅迫機(jī)制有重要意義。本研究從野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)中克隆GOX1基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為探索該基因的蛋白功能提供了理論依據(jù),為進(jìn)一步研究其抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

野生型擬南芥、原核表達(dá)載體PET28a(+)、大腸桿菌DH5α克隆菌株、大腸桿菌BL21表達(dá)菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑與儀器

反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP聚合物、限制性內(nèi)切酶(NheⅠ、HindⅢ)、Taq酶、T4DNA連接酶、咪唑(C3H4N2)、His標(biāo)簽鎳柱、質(zhì)粒提取試劑盒、切膠純化試劑盒、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、卡納霉素(Kana,使用終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)。

主要儀器有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、凝膠成像儀器分析系統(tǒng)、電泳儀、高溫高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、真空泵等恒溫培養(yǎng)震蕩器、紫外分光光度計、冷柜等。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

用ExPASy-ProtParam 工具(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對GOX1基因編碼的氨基酸進(jìn)行基本理化性質(zhì)的分析;采用ProtScale在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)對 GOX1蛋白進(jìn)行親/疏水性分析;采用PSORT Prediction (http://psort1.hgc.jp/form.html)在線軟件分析GOX1蛋白的亞細(xì)胞定位;采用 NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件對GOX1蛋白進(jìn)行磷酸化位點分析;利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLUST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析GOX1蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域;采用 NPS@: SOPMA secondary structure prediction 和SWISS-MODEL預(yù)測GOX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 引物設(shè)計與合成

從tair網(wǎng)站搜索目的基因GOX1的CDS序列(GOX1的基因登錄號為AT3G14420),再使用Primer5.0設(shè)計引物。上游引物GOX1-F:5’-CATGCTAGCATGGAGATCACTAACGTTAC CGA-3’(下劃線部分為NheⅠ酶切位點);下游引物GOX1-R:5’-CCCAAGCTTCTATAACCTGG CTGAAGGACGT-3’(下劃線部分為HindⅢ酶切位點)。

1.2.3 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

采用Trizol法對總RNA進(jìn)行提取,利用反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription,RT)得到cDNA,反應(yīng)體系(10 μL)如下:2 μL 5×PrimeScript RT Mix;2 μg Total RNA;RNase Free ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為:25 ℃、10 min;42 ℃、30 min;85 ℃、5 min;4 ℃、3 min。

1.2.4GOX1基因的擴(kuò)增和純化

以擬南芥cDNA為模板,擴(kuò)增GOX1基因的CDS序列。PCR(50 μL)反應(yīng)體系如下:5.0 μL 10×buffer;4.0 μL dNTP;2.0 μL GOX1-F;2.0 μLGOX1-R;0.6 μLTaq酶;2.0 μLTemplate DNA;34.4 μL ddH2O。

PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

使用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒按步驟純化目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.5 重組載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

利用NheⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切載體質(zhì)粒和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物,膠回收酶切后的基因片段和載體片段,使用T4連接酶16 ℃中過夜連接。連接體系(10 μL)如下:2 μL 5×buffer;1 μL T4 DNA 連接酶;2 μL雙酶切純化GOX1基因片段;4 μL雙酶切PET28a(+)載體片段;1 μL ddH2O。

將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用卡納霉素瓊脂平板篩選陽性克隆,37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆進(jìn)行PCR和雙酶切(NheⅠ/HindⅢ)鑒定,結(jié)果為陽性重組質(zhì)粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,測序正確后,將重組載體命名為PET28a(+)-GOX1。將重組載體PET28a(+)-GOX1轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行 PCR鑒定,確認(rèn)陽性菌落。

1.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21的陽性單菌落接種在4只含有50 μg/mL Kana的400 mL液體培養(yǎng)基中,在200 r/min、37 ℃的條件下?lián)u至菌的OD600為0.6～0.8即可,在每只錐形瓶中加入IPTG 120 μL(終濃度0.2 mmol/L),20 ℃的條件下表達(dá)16～24 h。

采用solution1(0.3 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH值為7.6)重懸菌液沉淀,破細(xì)胞30 min,收集上清真空抽濾,用鎳柱純化誘導(dǎo)蛋白。分別用solution1、solution2(20 mmol/LTris-HCl,0.3 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑,pH 值為7.6)洗脫雜蛋白,然后用solution3(20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,0.3 mol/L咪唑,pH值為7.6)洗脫目的蛋白。利用透析法除去咪唑,將GOX1蛋白保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 目的蛋白質(zhì)量濃度和酶活的檢測

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將目的蛋白稀釋合適的倍數(shù)后,使用紫外分光光度計在595 nm波長下測吸光度,再計算蛋白質(zhì)量濃度。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化成乙醛酸,生成的乙醛酸與苯肼反應(yīng)生成苯腙。苯腙在324 nm處有強(qiáng)烈的吸收,使用紫外分光光度計測定樣品在324 nm處吸光度的變化,測定時間[11]為5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOX1基因的基本理化性質(zhì)分析

GOX1基因編碼一條含367個氨基酸的肽鏈,分子式為C1 795H2 893N501O529S12,相對分子質(zhì)量為40 341.48,理論等電點為9.16,脂溶性指數(shù)為94.14。該蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為34.03,屬于穩(wěn)定性蛋白(小于40為穩(wěn)定)。在氨基酸殘基的組成上,丙氨酸(Ala)占比最高,達(dá)到11.2%。,使用NCBI Concserved Domain軟件對GOX1蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果如圖1a所示。由圖1a可知,該蛋白屬于PLN02493超級家族。采用ExPASy-ProtScale對親疏水性進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1b所示,由圖1b可知,GOX1蛋白為親水性蛋白。對GOX1蛋白進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測分析,結(jié)果如圖1c所示,由圖1c可知,該蛋白含有31個磷酸化位點,分別為14個絲氨酸(Ser)、12個蘇氨酸 (Thr)、5個酪氨酸(Tyr)。

圖1 GOX1蛋白一級結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析

2.2 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

GOX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)運(yùn)用SOPMA在線軟件進(jìn)行分析,如圖2a所示。由圖2a可知,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件包括α-螺旋(41.14%)、無規(guī)則卷曲(37.06%)、伸展鏈(15.80%)和β-轉(zhuǎn)角(5.99%),α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。運(yùn)用 SWISS-MODEL建模軟件對GOX1蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析,模型是以同源建模的方式模擬而出,是在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上盤繞、折疊產(chǎn)生的特定空間結(jié)構(gòu),如圖2b所示。

圖2 GOX1蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)分析

2.3 GOX1的PCR擴(kuò)增分析

以擬南芥野生型CDS為模板,以GOX1-F和GOX1-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增,核酸瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 PCR擴(kuò)增GOX1基因片段核酸瓊脂糖凝膠電泳圖

從圖3可以看出,擴(kuò)增產(chǎn)物有一條特異性帶,與擬南芥GOX1基因的大小相符(GOX1大小為1 104 bp)。

2.4 PET28a(+)-GOX1原核表達(dá)載體的鑒定

提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行測序,結(jié)果顯示質(zhì)粒中連接的目的基因與GOX1基因片段完全相符,未發(fā)生任何突變,將送去測序的菌落進(jìn)行擴(kuò)搖,提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21,挑取單克隆進(jìn)行菌落鑒定。利用Primer 5軟件在PET28a(+)載體上設(shè)計引物PET28a(+)-F(TAGTTATTGCTCAGCGGTGG)和PET28a(+)-R(TCATGAGCGCTTGTTTCGGC),利用PCR擴(kuò)增確認(rèn)GOX1與載體是否成功連接,其電泳圖如圖4所示,從圖4可以看出,條帶在1 00～2 000 bp中間的位置,與實際大小1 500 bp相符,選取含目的基因的單克隆作為誘導(dǎo)菌種。

圖4 菌落PET28a(+)-GOX1/BL21 PCR電泳圖

2.5 GOX1蛋白的誘導(dǎo)及純化

在22 ℃條件下,0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12～16 h,誘導(dǎo)后的蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖5所示。圖5中:M代表Marker;泳道1代表PET28a(+)空載;泳道2代表PET28a(+)-GOX1誘導(dǎo)前蛋白表達(dá)情況;泳道3代表PET28a(+)-GOX1誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況;泳道4代表PET28a(+)-GOX1誘導(dǎo)后經(jīng)破細(xì)胞處理后的上清;泳道5代表PET28a(+)-GOX1誘導(dǎo)后經(jīng)破細(xì)胞處理后的沉淀。

圖5 GOX1蛋白誘導(dǎo)后的SDS-PAGE電泳圖

此外,誘導(dǎo)的粗蛋白利用鎳柱純化,在蛋白上樣后,帶有His標(biāo)簽的融合蛋白特異性結(jié)合到柱子里,其他的雜蛋白隨之流出。鎳與咪唑發(fā)生競爭性結(jié)合,目的蛋白則被洗脫下來,即GOX1與雜蛋白成功分離,SDS-PAGE電泳檢測不同時段的洗脫液,如圖6所示。圖6中:M代表Marker;泳道1～3代表雜蛋白的洗脫;泳道4～6代表目的蛋白洗脫的結(jié)果,泳道4的洗脫液含大量的目的蛋白,利用透析袋將該洗脫液的咪唑脫去后,將目的蛋白置于-80 ℃保存。

圖6 GOX1蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖

2.6 GOX1蛋白的質(zhì)量濃度及酶活檢測分析

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出表達(dá)的GOX1蛋白質(zhì)量濃度為0.17 μg/μL。以乙醇酸為底物,測得酶活約為2.14 μmol/(mg·min)。

3 討 論

由于受到天氣、區(qū)域環(huán)境和其他因素的影響,植物通常會在各種逆境脅迫下生長; 不斷變化的環(huán)境通常給植物帶來一定脅迫。例如干旱、低溫、鹽堿地以及二氧化碳濃度的增加等都會影響植物的生長發(fā)育,對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成越來越嚴(yán)重的威脅。

在植物的細(xì)胞代謝過程中,有多種產(chǎn)生過氧化氫的方式,例如線粒體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移,葉綠體中發(fā)生的梅勒反應(yīng)和過氧化物酶體中發(fā)生的光呼吸作用。而光呼吸途徑產(chǎn)生的過氧化氫主要來源于GOX催化乙醇酸氧化的過程,因此人們認(rèn)為GOX在植物抗逆防御反應(yīng)過程中起著至關(guān)重要的作用,然而大多數(shù)情況下其響應(yīng)脅迫的機(jī)制和信號途徑還不清楚,有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

擬南芥因為其具有植株小、結(jié)實多、生命周期短;形態(tài)特征分明,突變表型易于觀察;自交繁殖,易于保持遺傳穩(wěn)定性;基因組簡單、遺傳操作簡便、適宜在實驗室培養(yǎng)等優(yōu)點,所以被認(rèn)為是全球應(yīng)用最廣泛的模式生物。本研究通過 RT和PCR技術(shù),從野生型擬南芥克隆了GOX1基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果表明,該基因的CDS 序列為1 104 bp,編碼一個由367個氨基酸組成的非分泌蛋白,主要由α-螺旋(41.14%)、無規(guī)則卷曲(37.06%)、少量的延伸鏈(15.80%)和β-轉(zhuǎn)角(5.99%)構(gòu)成。

在未來的工作中,將會進(jìn)一步研究蛋白的體外功能以及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證擬南芥GOX1基因調(diào)控生長發(fā)育的機(jī)理,更深層次地解釋GOX1基因參與脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。