五味子揮發(fā)油改善皮膚老化作用研究①

韓鑫垚, 王金鑫, 張欣夢(mèng), 閆森博, 王 磊, 陳雨欣, 袁 敏

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

全球老齡化形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻,使得人們對(duì)于提升生活品質(zhì)和追求美感的愿景更加迫切,全民“抗氧化”、“抗衰老”時(shí)代正在到來(lái)。為迎合這一需求,市場(chǎng)上抗衰老護(hù)膚品的種類日益繁多,而受眾在關(guān)注產(chǎn)品功效性的同時(shí),開始考慮成分的安全性。天然草本植物提取物因毒副作用小、溫和、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)頗受消費(fèi)者喜愛,使得研究者將開發(fā)抗衰老添加劑的目光集中在天然植物提取物上[1]。

五味子,為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí),是可用于保健食品的中藥。五味子果實(shí)中富含多種有效成分物質(zhì),如木脂素類、多糖、揮發(fā)油等,在疾病治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。五味子揮發(fā)油是從五味子的藤莖、葉、果實(shí)和種子中提取出的具有揮發(fā)性油狀液體芳香混合物,主要以為萜類成分為主,具有鎮(zhèn)咳、消除疲勞、抵抗衰老等功效[3]。近年來(lái),五味子揮發(fā)油因優(yōu)越的天然抗氧化性、生物相容性和安全等優(yōu)勢(shì),使其成為潛在的功能性化妝品添加劑,這為滿足人們精神生活和附加產(chǎn)值資源化利用方面提供研究活力。

將五味子果實(shí)粉碎,采用水蒸氣蒸餾法收集揮發(fā)油,測(cè)定其DPPH·清除率,對(duì)透明質(zhì)酸酶、膠原蛋白酶和彈性蛋白酶的抑制率,分析其在抵抗皮膚衰老過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

試劑:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·,上海麥克林公司);抗壞血酸(Vc, 上海麥克林公司);下述試劑均來(lái)自天津大茂化學(xué)試劑廠:甲醇;磷酸二氫鈉;磷酸氫二鈉;下述試劑均來(lái)自美國(guó)Sigma 公司:彈性蛋白酶;膠原蛋白酶;N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰)-亮氨酰-甘氨酰-脯氨酰-丙氨酸(FALGPA);牛血清白蛋白(BSA);沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG);N-琥珀酰基-三-丙氨酸-對(duì)硝基苯胺(SANA);透明質(zhì)酸酶;透明質(zhì)酸。

儀器:FC型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司);超聲清洗儀(上海豫明儀器有限公司);79-1磁力加熱攪拌器(山東鄴城華魯電熱儀器有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京儀器廠)。

1.2 五味子揮發(fā)油的提取

取100 g干燥的五味子果實(shí)經(jīng)粉碎機(jī)打碎成粉末狀,量取 1500 mL蒸餾水,置于圓底燒瓶中。浸泡1h后,連接蒸餾裝置,啟動(dòng)加熱套,使得混合液保持微沸狀態(tài),注意觀測(cè)提取器中的液面狀態(tài)和高度。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3.5 h后,關(guān)閉加熱裝置。提取器中油水兩相分層,上層油相接入揮發(fā)油瓶。使用無(wú)水硫酸鈉去除水分,混合物離心后吸取上層液體即為五味子揮發(fā)油。

揮發(fā)油產(chǎn)率 =m1/m

式中:m1為五味子揮發(fā)油質(zhì)量g;m為五味子粗粉質(zhì)量g。

1.3 DPPH·清除實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Manzocco等人的實(shí)驗(yàn)操作方法,加以改進(jìn)[4]。在96孔板中依次加入100μL不同濃度的五味子揮發(fā)油,100μL DPPH·試劑(0.2mmol/L),混合均勻,25℃ 靜置避光30 min后,再次混合均勻于酶標(biāo)儀下518nm測(cè)吸光度值。Vc作為陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)三次。按如下公式計(jì)算DPPH·清除率:

清除率(%)=(Ai-Aj/A0)×100%

式中:Ai為樣品混合溶液的吸光度值;Aj為樣品與甲醇混合溶液的吸光度值;A0為甲醇與DPPH·的混合溶液的吸光度值。

1.4 抑制透明質(zhì)酸酶活性實(shí)驗(yàn)

在Kass等人的實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)[5]。在96孔板中,分別加入50 μL五味子揮發(fā)油的乙醇溶液與50 μL透明質(zhì)酸酶溶液(4～10U/mL),再加入 12 μL磷酸緩沖液(0.3mol/L,pH=5.35),50 μL透明質(zhì)酸鈉溶液(0.3 mg/mL),震蕩混勻,37℃孵育45 min,加入100 μL酸性白蛋白溶液(含0.1%BSA)。震蕩混勻后在600nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.5 抑制膠原蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)

依據(jù)Widowati等人建立的實(shí)驗(yàn)方法,在此基礎(chǔ)上加以修改[6]。在96孔板中,依次加入50 μL五味子揮發(fā)油的乙醇溶液、膠原蛋白酶溶液(3 mg/mL)和Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH=7.5),震蕩混勻后,37℃孵育15 min,加入50 μL FALGPA (0.48mg/mL)溶液。37℃反應(yīng)20min,于345nm處測(cè)定吸光度。

1.6 抑制彈性蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)

參考Mathen等人建立的實(shí)驗(yàn)方法[7]。在96孔板中,分別加入50 μL五味子揮發(fā)油的乙醇溶液、彈性蛋白酶溶液(0.5 U/mL)和Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH=8),震蕩混勻,在37℃預(yù)孵育15 min;加入50 μL SANA(1 mmol/L),37℃孵育20 min,震蕩混勻后在410 nm處測(cè)定吸光度。

以上抑制酶實(shí)驗(yàn)均以EGCG為陽(yáng)性對(duì)照,所有樣品重復(fù)三次。

上述酶的抑制率根據(jù)如下公式進(jìn)行計(jì)算:

抑制率(%)=(1-A空白/A樣品)×100%

式中:A樣品為全部物質(zhì)混合后溶液的吸光度;A空白為不加樣品剩余物質(zhì)混合后溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 五味子揮發(fā)油的DPPH·清除效果

Vc是公認(rèn)的、應(yīng)用較為廣泛的抗氧化活性物質(zhì),因此選用Vc作為陽(yáng)性對(duì)照,來(lái)評(píng)價(jià)五味子揮發(fā)油的抗氧化能力。五味子揮發(fā)油和Vc對(duì)DPPH·的清除效果如圖1所示,隨著濃度的增大,DPPH·清除能力增強(qiáng),呈正相關(guān)。當(dāng)揮發(fā)油濃度達(dá)到6.25%以上時(shí),DPPH·的清除效果趨于平穩(wěn);濃度為25%時(shí),清除率最大為67.81%?？傮w來(lái)看,五味子揮發(fā)油具有良好的DPPH·清除能力,但略低于陽(yáng)性對(duì)照Vc。五味子揮發(fā)油中主要成分為萜烯類化合物,它們具有抗氧化性、抗病毒及鎮(zhèn)痛活性[8],由此推測(cè)其在DPPH·清除過(guò)程中能發(fā)揮重要的作用。

圖1 五味子揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除活性

2.2 五味子揮發(fā)油抑制透明質(zhì)酸酶活性分析

生物體衰老是生命進(jìn)程中必經(jīng)的環(huán)節(jié),皮膚衰老尤為明顯。皮膚分為表皮,真皮和皮下組織。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是皮膚最外層,由成纖維細(xì)胞和蛋白質(zhì)組成,其中蛋白質(zhì)包括膠原蛋白和彈性蛋白[9]。ECM的降解與涉及皮膚衰老相關(guān)酶的活性密切相關(guān),這些酶包括透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶和膠原蛋白酶。

透明質(zhì)酸酶能夠降解面部透明質(zhì)酸水平,透明質(zhì)酸對(duì)皮膚起到避免水分流失、參與ECM生成的作用,因此,有效抑制透明質(zhì)酸酶活性至關(guān)重要。選用“天然的人體保鮮劑”EGCG作為陽(yáng)性對(duì)照,評(píng)價(jià)五味子揮發(fā)油的皮膚抗衰老活性。由圖2可知隨著濃度增大,五味子揮發(fā)油和EGCG對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用不斷增強(qiáng)。在濃度為0.75 mg/mL時(shí),揮發(fā)油和EGCG對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率相當(dāng),分別為80.83%和81.15%。其余濃度下,揮發(fā)油對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率甚至大于EGCG。為了更直觀地比較兩者對(duì)酶的抑制效果,用SPSS 16計(jì)算得到它們的IC50值,IC50值越小,對(duì)酶活性的抑制能力越強(qiáng)。表 1中顯示IC50(五味子揮發(fā)油,184.586±5.218μg/mL)

圖2 五味子揮發(fā)油對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

2.3 五味子揮發(fā)油抑制膠原蛋白酶活性分析

膠原蛋白酶能夠降解面部膠原蛋白水平,膠原蛋白加快皮膚細(xì)胞的新陳代謝速度,修復(fù)斷裂、老化的彈力纖維。五味子揮發(fā)油和EGCG對(duì)膠原蛋白酶的抑制作用如圖3所示。在0 ～ 2 mg/mL濃度范圍內(nèi),揮發(fā)油的抑制活性均小于EGCG,且揮發(fā)油的最大抑制率為68.98%,EGCG為81.26%。表1中IC50(五味子揮發(fā)油,366.425±5.904μg/mL)> IC50(EGCG,265.482±5.582μg/mL)。當(dāng)濃度小于1mg/mL時(shí),揮發(fā)油和EGCG對(duì)膠原蛋白酶的抑制活性相當(dāng),濃度繼續(xù)增大,揮發(fā)油的抑制率增長(zhǎng)趨于平穩(wěn),變化區(qū)間在66.10%-68.98%之間,說(shuō)明低劑量的五味子揮發(fā)油可實(shí)現(xiàn)較大程度的抑制效果,有效保證面部膠原蛋白水平,使肌膚緊致富有光澤。

圖3 五味子揮發(fā)油對(duì)膠原蛋白酶的抑制作用

圖4 五味子揮發(fā)油對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用

2.4 五味子揮發(fā)油抑制彈性蛋白酶活性分析

彈性蛋白酶能夠降解面部彈性蛋白水平,彈性蛋白負(fù)責(zé)皮膚的彈性和強(qiáng)度,保持皮膚的柔韌性。五味子揮發(fā)油和EGCG對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用如圖4所示。隨著濃度的增大,兩者的抑制率均顯示為增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)濃度為0.75 mg/mL,揮發(fā)油的抑制率增長(zhǎng)趨于平緩,變化區(qū)間為91.79%-96.34%,而EGCG的抑制率依增長(zhǎng)幅度略大于揮發(fā)油。與EGCG相比,揮發(fā)油對(duì)彈性蛋白酶抑制作用明顯較大,揮發(fā)油的最大抑制率可達(dá)96.34%,EGCG為75.39%,表1中IC50(五味子揮發(fā)油,103.710±4.642μg/mL)

表1 五味子揮發(fā)油和EGCG抑制酶活性的IC50值

3 結(jié) 論

采用水蒸氣蒸餾法提取五味子揮發(fā)油,并研究了其DPPH·清除能力和與皮膚衰老相關(guān)酶的抑制作用。結(jié)果表明五味子揮發(fā)油具有一定DPPH·清除能力和抑制膠原蛋白酶的作用。重要的是,其表現(xiàn)出顯著的透明質(zhì)酸酶和彈性蛋白酶的抑制作用,甚至強(qiáng)于EGCG,這表示五味子揮發(fā)油在改善皮膚老化現(xiàn)象有潛在研究?jī)r(jià)值。五味子作為原料,來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉,再加上提取方法簡(jiǎn)單,將來(lái)有望在化妝品和保健品領(lǐng)域投入使用。