基于免核酸提取可視化RT-LAMP快速檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒

尹新穎 曹際娟 李鑫 楊莉莉 樸永哲

摘要 本文基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 （RT-LAMP） 技術(shù)建立葫蘆科作物中黃瓜綠斑駁花葉病毒 （CGMMV） 免核酸提取的可視化快速檢測(cè)方法。根據(jù)CGMMV全基因組序列，篩選保守區(qū)域并設(shè)計(jì)特異性RT-LAMP檢測(cè)引物。通過(guò)熒光擴(kuò)增方法 （加SYTO-9） 和可視化方法 （加鈣黃綠素），開展RT-LMAP特異性、靈敏度和重現(xiàn)性試驗(yàn)分析。結(jié)果表明，優(yōu)化篩選的引物組可以特異性地檢測(cè)CGMMV，檢測(cè)靈敏度達(dá)到4.21×103 ?fg/μL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%，重現(xiàn)性好。對(duì)瓜類作物田間種苗、植株葉片及市售種子等103份樣品進(jìn)行檢測(cè)及一致性分析，表明該方法與基于RNA提取RT-LAMP、熒光RT-qPCR及免疫測(cè)試條檢測(cè)結(jié)果之間的Kappa值均為1.0 （1～1， 95%置信區(qū)間），具有很好的一致性?；诿夂怂崽崛〉目梢暬疪T-LAMP快檢方法成為適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的理想選擇，對(duì)于CGMMV危害葫蘆科作物的田間監(jiān)測(cè)以及疫情防控具有廣泛的推廣應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 黃瓜綠斑駁花葉病毒;?逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）;?可視化;?免核酸提取

中圖分類號(hào)： S 436.421

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021663

Abstract To realize the rapid detection of cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）， a visual detection method of CGMMV in Cucurbitaceae crops was established based on RT-LAMP without nucleic acid extraction. According to the complete genome sequence of CGMMV， the conserved regions were screened and specific RT-LAMP detection primers were designed. Specificity， sensitivity and repeatability were analyzed by RT-LAMP fluorescence amplification （SYTO-9） and visual RT-LAMP method （calcein）. Results showed that the optimized primers for this method can detect CGMMV specifically， and the detection sensitivity is 4.21×103 fg/μL total RNA. The coefficient of variation （CV） within and between groups were less 5%， with good repeatability. The 103 samples of field seedlings， plant leaves and commercial seeds of melon crops were monitored， detected and analyzed. The results showed that the Kappa value between this method and RT-LAMP based on RNA extraction， fluorescent RT-qPCR and immunoassay strip were 1.0 （1-1， 95% confidence interval）， and indicated an excellent test agreement. The visual RT-LAMP method has become an ideal choice for field rapid detection. It has a wide application prospect for field monitoring， preventing and controlling the epidemic of CGMMV.

Key words cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）;?RT-LAMP;?visualization;?free nucleic acid extraction

黃瓜綠斑駁花葉病毒病是一種毀滅性的植物病害［1］，主要危害黃瓜、西葫蘆、西瓜和甜瓜等葫蘆科作物，導(dǎo)致葉片斑駁、果實(shí)變形和植株發(fā)育遲緩，產(chǎn)量顯著下降［2］，嚴(yán)重威脅著葫蘆科作物的生產(chǎn)［3］。1935年，英國(guó)Ainsworth［4］首次報(bào)道黃瓜綠斑駁花葉病毒 （cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）在黃瓜上的危害，此后，該病毒陸續(xù)傳播到加拿大［5］、美國(guó)［6］、波蘭［7］、西班牙［8］、印度［9］、巴基斯坦［10］、日本［11］、韓國(guó)［12］、緬甸［13］等20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。2003年我國(guó)首次在廣西觀賞南瓜上發(fā)現(xiàn)該病毒［14］，之后又陸續(xù)在廣東、湖南、江蘇、海南、遼寧等地發(fā)現(xiàn)疫情［15-16］。該病毒已被許多國(guó)家和地區(qū)列為重點(diǎn)關(guān)注的檢疫性有害生物。CGMMV的主要傳播途徑是機(jī)械傳播，以及植物花粉及種子傳播［17-18］。葫蘆科作物是世界上最重要的食用植物之一，也是最重要的園藝植物之一［19］，更是農(nóng)民增收的重要作物［20］。從CGMMV傳播狀況來(lái)看，實(shí)施作物田間監(jiān)測(cè)，極早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)阻斷感染源，對(duì)于葫蘆科作物的健康培育極其重要。

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的診斷方法已廣泛應(yīng)用于CGMMV檢測(cè)，具有較高的靈敏度和特異性［21-22］。Chen等［23］報(bào)道的TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR方法檢測(cè)CGMMV，已成為CGMMV檢疫鑒定方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［24］。實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR需要專業(yè)化的設(shè)備，不適合在資源有限的實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。Shang等［25］和Torre等［26］報(bào)道免疫血清學(xué)方法包括抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ACP-ELISA）、免疫捕獲逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （IC-RT-PCR）、雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （DAS-ELISA） 等可以檢測(cè)CGMMV，然而，免疫血清學(xué)方法依賴于抗體制備或商業(yè)化免疫測(cè)試盒，檢測(cè)成本高，并且研究表明RT-qPCR檢測(cè)靈敏度比免疫測(cè)定高10 000 倍［26］。近幾年，不需要復(fù)雜儀器設(shè)備的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展迅速，已被廣泛用于各種植物病原體的檢測(cè)［27-28］。Li等［29］報(bào)道RT-LAMP方法可快速檢測(cè)CGMMV，但需要核酸提取以及用于熒光擴(kuò)增曲線觀察的實(shí)時(shí)熒光分析儀。CGMMV侵染植物造成的病情呈逐年加重趨勢(shì)，目前尚缺乏簡(jiǎn)單、可靠和靈敏度高的適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的有效方法，對(duì)作物開展田間監(jiān)測(cè)仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

本文基于RT-LAMP技術(shù)，以CGMMV的移動(dòng)蛋白基因保守區(qū)為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)篩選5組引物，利用鈣黃綠素為熒光顯色指示劑，建立了一種免核酸提取的可視化RT-LAMP快速檢測(cè)方法，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備，使用簡(jiǎn)便的恒溫器，便可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的精準(zhǔn)檢測(cè)，具有廣泛的田間監(jiān)測(cè)推廣應(yīng)用前景。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試材

CGMMV陽(yáng)性西瓜葉片樣品、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV） 陽(yáng)性煙草葉片樣品、甜瓜黃斑病毒（melon yellow spot virus， MYSV） 陽(yáng)性西瓜葉片樣品由廈門海關(guān)技術(shù)中心提供;小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus， ZYMV） 陽(yáng)性葉片樣品 （C2300） 購(gòu)于Agdia （美國(guó)） 公司。實(shí)際測(cè)試樣品，包括收集于遼寧省營(yíng)口市某西瓜種苗基地、大連市金普新區(qū)某企業(yè)出口葫蘆科植物制種基地的田間西瓜幼苗疑似感病樣品35份、黃瓜幼苗及植株葉片監(jiān)測(cè)樣品40份，以及在遼寧地區(qū)收集和采購(gòu)的黃瓜種子樣品3份、西葫蘆種子樣品25份。

1.1.2?主要試劑與儀器

基因組RNA提取試劑 （Code No.9766），裂解試劑 （Code No.9182），寶生物工程 （大連） 有限公司;RNA恒溫?cái)U(kuò)增試劑和SYTO-9熒光染料，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司;熒光目視檢測(cè)試劑 （鈣黃綠素，SLP221），榮研生物科技 （中國(guó)） 有限公司;超微量分光光度計(jì) （Micro Drop），上海寶予德科學(xué)儀器有限公司;實(shí)時(shí)熒光PCR儀 （CFX96），BIO-DL公司。

1.2?方法

1.2.1?樣品處理及基因組RNA提取

取待測(cè)植物組織在研缽中加入液氮進(jìn)行研磨。取研磨后的試材10 mg加入100 μL的裂解液中，振蕩混合，95℃煮沸10 min;12 000 r/min離心2 min，取上清液，直接用于RT-LAMP反應(yīng)。同時(shí)，采用植物基因組RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，與直接煮沸裂解方法進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)免核酸提取直接用于RT-LAMP的效果。采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定直接煮沸裂解所獲得的上清液和試劑盒提取的基因組RNA的吸收值，并計(jì)算A260/A280比值的核酸純度和濃度。

1.2.2?引物設(shè)計(jì)

選取GenBank上公布的22個(gè)CGMMV分離物基因信息 （表1），使用軟件DNAstar對(duì)22個(gè)CGMMV分離物進(jìn)行CGMMV全基因組靶序列相似性比對(duì)分析，篩選高度保守的基因序列用來(lái)設(shè)計(jì)引物。采用LAMP Primer Explorer 5軟件設(shè)計(jì)5組引物 （表2），每組有5～6條引物，包括2個(gè)外引物 （OF和OB）、2個(gè)內(nèi)引物 （IF和IB）和1個(gè)或2個(gè)環(huán)引物 （LB和/或LF），并使用 Primer blast （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）進(jìn)行評(píng)估。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.3?RT-LAMP反應(yīng)

RT-LAMP反應(yīng)體系為2×RM反應(yīng)液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，AMV酶0.2 μL，SYTO-9熒光染料0.5 μL （或可視化的鈣黃綠素1.0 μL），引物1.0 μL （內(nèi)引物終濃度0.4～1.6 μmol/L，外引物終濃度0.1～0.2 μmol/L，環(huán)引物終濃度0.1～0.8 μmol/L），裂解上清液或提取的植物基因組RNA 2 μL，超純水補(bǔ)齊至總體積25 μL。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀或者LAMP實(shí)時(shí)濁度儀觀察熒光擴(kuò)增曲線 （加SYTO-9）：將上述 25 μL 反應(yīng)液管置于儀器中，設(shè)置反應(yīng)條件為63℃ 1 min作為1個(gè)循環(huán)，于63℃ 1 min處收集熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果。

通過(guò)可視化觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化 （加鈣黃綠素）：將上述25 μL反應(yīng)液管置于恒溫加熱器63℃保溫30 min，95℃ 2 min （或者冰上10 min） 終止反應(yīng)，然后在紫外光下 （波長(zhǎng)350～370 nm） 觀察呈現(xiàn)渾濁綠色熒光為陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)渾濁則為陰性結(jié)果。

1.2.4?特異性分析

為評(píng)價(jià)本研究所建立的可視化RT-LAMP檢測(cè)CGMMV的特異性，使用黃瓜花葉病毒 （CMV）、甜瓜黃斑病毒 （MYSV）、小西葫蘆黃花葉病毒 （ZYMV） 基因組RNA進(jìn)行評(píng)估。采用健康番茄種子作為陰性對(duì)照，超純水作為空白對(duì)照。

1.2.5?靈敏度分析

使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定CGMMV陽(yáng)性葉片樣品免核酸提取的裂解上清液濃度，將陽(yáng)性葉片樣品提取液分別按照10倍稀釋成以下系列濃度：4.21×107 、4.21×106 、4.21×105 、4.21×104 、4.21×103 、4.21×102 、4.21×101 、4.21×100 fg/μL。每個(gè)濃度至少重復(fù)3次，使用超純水和健康植物總RNA作為陰性對(duì)照，按照RT-LAMP反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程，確定本方法的靈敏度。

1.2.6?重現(xiàn)性分析

分別取等量的3份CGMMV陽(yáng)性葉片樣品，采用同一批次裂解試劑和同一批次RNA恒溫?cái)U(kuò)增試劑進(jìn)行免核酸提取的熒光RT-LAMP試驗(yàn)，記錄Ct值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差 （SD） 和組內(nèi)變異系數(shù) （CV）。另取等量的3份CGMMV陽(yáng)性葉片樣品，采用3組不同批次的裂解試劑和RNA恒溫?cái)U(kuò)增試劑進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，記錄Ct 值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差 （SD） 和組間變異系數(shù) （CV）。每組測(cè)試至少重復(fù)3次。

1.2.7?實(shí)際樣品中的檢測(cè)應(yīng)用

為了評(píng)估免核酸提取RT-LAMP分析在實(shí)際樣品檢測(cè)中的適用性，本研究在2019年5月到2020年10月期間在遼寧地區(qū)收集了103份樣品，包括田間西瓜幼苗疑似感病樣品35份、黃瓜幼苗及植株葉片監(jiān)測(cè)樣品40份，以及收集和采購(gòu)黃瓜種子樣品3份、西葫蘆種子樣品25份。采用基于免核酸提取的可視化RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用基于RNA提取的RT-LAMP、GB/T 28071-2011標(biāo)準(zhǔn)中熒光RT-qPCR方法［24］、免疫試紙條［24］進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。使用IBM SPSS Statistics分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)（Kappa系數(shù)）來(lái)分析本研究建立的基于免核酸提取RT-LAMP方法與上述其他方法的檢測(cè)結(jié)果之間的一致程度。

2?結(jié)果與分析

2.1?RT-LAMP引物的優(yōu)化篩選結(jié)果

通過(guò)RT-LAMP熒光擴(kuò)增曲線分析 （加SYTO-9），本研究設(shè)計(jì)的5組CGMMV檢測(cè)引物 （表2） 的篩選結(jié)果表明，第1、2、3、4、5組引物檢測(cè)CGMMV陽(yáng)性樣品分別在47、26、20、8 min和16 min時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。前4組陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線，但第5組在反應(yīng)31 min時(shí)陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。由此可見(jiàn)，本研究所設(shè)計(jì)的第4組引物檢測(cè)CGMMV的所需時(shí)間最短，擴(kuò)增效率最高。因此，選擇第4組引物用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2?植物組織免核酸提取液的測(cè)定分析及比較結(jié)果

2.2.1?免核酸提取液的純度測(cè)定及比較結(jié)果

選取感染CGMMV的西瓜葉片樣品，分別采用免核酸提取處理樣品及試劑盒提取基因組RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值并計(jì)算濃度。采取直接煮沸裂解方法獲取的上清液的A260/A280為1.91±0.05，采取試劑盒提取基因組RNA的A260/A280為1.47±0.05，2種方法所獲得的基因組提取液均能滿足正常的核酸檢測(cè)需求。

2.2.2?免核酸提取液的RT-LAMP分析及比較結(jié)果

通過(guò)RT-LAMP熒光擴(kuò)增曲線 （加SYTO-9） 和紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化 （加鈣黃綠素） 來(lái)分析1.2.1節(jié)所述2種方法所獲得的基因組提取液的檢測(cè)效果。RT-LAMP熒光擴(kuò)增 （加SYTO-9） 曲線分析結(jié)果如圖1所示，通過(guò)紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化 （加鈣黃綠素） 結(jié)果如圖2所示。由圖1和圖2結(jié)果可見(jiàn)，采用2種不同方法的基因組提取液，經(jīng)RT-LAMP擴(kuò)增均能檢出典型的陽(yáng)性熒光擴(kuò)增曲線 （圖1）;通過(guò)紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化 （加鈣黃綠素），也均可以產(chǎn)生典型的渾濁綠色熒光的陽(yáng)性結(jié)果 （圖2）。綜合分析，免核酸提取方法可以達(dá)到與商業(yè)化試劑盒提取基因組的同等檢測(cè)效果，能夠滿足可視化RT-LAMP檢測(cè)植物組織中的CGMMV。

2.3?特異性檢測(cè)結(jié)果

采用優(yōu)化篩選后的RT-LAMP引物 （第4組引物） 進(jìn)行特異性試驗(yàn)，對(duì)CGMMV、黃瓜花葉病毒 （CMV）、甜瓜黃斑病毒 （MYSV）、小西葫蘆黃花葉病毒 （ZYMV） 的基因組RNA進(jìn)行RT-LAMP分析，分別通過(guò)熒光擴(kuò)增曲線 （加SYTO-9）和紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化 （加鈣黃綠素），分析檢測(cè)特異性。由圖3可見(jiàn)，經(jīng)RT-LAMP檢測(cè) （加SYTO-9），僅CGMMV檢出典型陽(yáng)性的熒光擴(kuò)增曲線，其他樣品均為陰性。由圖4可見(jiàn)，經(jīng)RT-LAMP檢測(cè) （加鈣黃綠素），紫外光下擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色濁度變化，僅觀察到CGMMV呈現(xiàn)出陽(yáng)性的渾濁熒光結(jié)果，其他樣品均為陰性?？梢?jiàn)，本研究設(shè)計(jì)的第4組CGMMV引物具有良好的特異性，可以特異性檢測(cè)植物組織中感染的CGMMV。

2.4?靈敏度檢測(cè)結(jié)果

取CGMMV免核酸提取液8個(gè)不同濃度的10倍稀釋液作為模板，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，分別通過(guò)熒光擴(kuò)增曲線 （加SYTO-9） 和紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化 （加鈣黃綠素），分析檢測(cè)靈敏度，結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5a可見(jiàn)，當(dāng)CGMMV免核酸提取液濃度在4.21×103 fg/μL及以上時(shí)，均出現(xiàn)典型的陽(yáng)性熒光擴(kuò)增曲線，經(jīng)線性曲線分析 （圖5b），擬合度R2=0.999 3，線性關(guān)系良好。由圖6可見(jiàn)，在紫外光下也觀察到上述相同濃度的CGMMV免核酸提取液呈現(xiàn)典型的陽(yáng)性渾濁綠色熒光，結(jié)果非常穩(wěn)定。綜上結(jié)果，本研究建立的基于免核酸提取可視化RT-LAMP方法檢測(cè)植物中CGMMV靈敏度達(dá)到4.21×103 fg/μL。

2.5?重現(xiàn)性分析

重現(xiàn)性試驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)和組間變異試驗(yàn)分析結(jié)果如表3所示。組內(nèi)變異試驗(yàn)結(jié)果顯示，RT-LAMP熒光擴(kuò)增曲線 （加SYTO-9） 檢測(cè)CGMMV的變異系數(shù)在0.32%～2.51%之間;組間變異試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的變異系數(shù)在1.08%～2.69%之間。由此可見(jiàn)，無(wú)論組內(nèi)還是組間，變異系數(shù)均小于5%，表明本研究所建立的方法具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.6?在實(shí)際樣品中的檢測(cè)應(yīng)用

2019年5月到2020年10月期間，收集遼寧省營(yíng)口市某西瓜種苗基地、大連市金普新區(qū)某企業(yè)出口葫蘆科植物制種基地的田間西瓜幼苗疑似樣品35份、黃瓜幼苗及植株葉片40份監(jiān)測(cè)樣品;并在遼寧地區(qū)收集和采購(gòu)黃瓜種子樣品3份、西葫蘆種子樣品25份。經(jīng)檢測(cè) （表4），采用本研究建立的基于免核酸提取的可視化RT-LAMP方法檢出5份西瓜幼苗疑似樣品、2份西葫蘆種子樣品為CGMMV陽(yáng)性結(jié)果，與其他方法進(jìn)行驗(yàn)證比對(duì)，基于實(shí)際樣品檢測(cè)的一致性分析表明，本研究建立的方法與基于RNA提取的RT-LAMP、熒光RT-qPCR、免疫試紙條之間的Kappa值均為1.0 （1～1， 95%置信區(qū)間）。表明本研究建立的基于免核酸提取的可視化RT-LAMP方法在檢測(cè)實(shí)際樣品中的CGMMV時(shí)與基于核酸提取的RT-LAMP方法、實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR方法及免疫試紙條檢測(cè)方法具有良好的一致性。從對(duì)西瓜幼苗葉片樣品和市售種子的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGMMV感染依然存在暴發(fā)的隱患，有新突發(fā)疫點(diǎn)的潛在可能性，開展瓜類作物及種苗、種子田間監(jiān)測(cè)仍然非常重要。

3?結(jié)論與討論

古勤生等［30］根據(jù)近幾年來(lái)對(duì)于西瓜病毒病害的跟蹤監(jiān)測(cè)，推測(cè)幾乎所有嫁接西瓜產(chǎn)區(qū)都存在CGMMV發(fā)生或暴發(fā)的隱患。建立低成本的可視化的植物中CGMMV快速檢測(cè)方法開展田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可以及時(shí)有效地防止CGMMV傳播危害，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究基于RT-LAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)篩選了CGMMV最佳引物，摸索了植物組織免核酸提取的前處理，建立了一種基于免核酸提取的可視化快速檢測(cè)植物中CGMMV方法，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%，方法穩(wěn)定。本方法的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到4.21×103 fg/μL，且不需要昂貴的熒光檢測(cè)設(shè)備以及復(fù)雜的試驗(yàn)操作過(guò)程。經(jīng)實(shí)際樣品的比對(duì)驗(yàn)證，與采用基于RNA提取的RT-LAMP檢測(cè)及GB/T 28071國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果相一致，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)田間作物及其種子中微量CGMMV感染樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)可以在植株、葉片、種子等不同感染基體的檢測(cè)靈敏度上做進(jìn)一步的深入研究，為制定合理的取樣批次、制備試樣批次提供理論基礎(chǔ)，更有效地服務(wù)于CGMMV防控的快速檢測(cè)仍然是研究人員需要不斷努力的方向。

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（責(zé)任編輯：田?喆）