谷紅注射液對(duì)CYP450 酶的抑制和誘導(dǎo)作用的體內(nèi)外研究

劉凡琪，王婧媛，張露丹，李自強(qiáng)，黃宇虹

天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250

隨著中西醫(yī)結(jié)合的不斷深入及中西藥聯(lián)用的日益普遍，因中西藥相互作用而所引起的安全性風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到關(guān)注。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶是體內(nèi)參與藥物及其他外源性物質(zhì)代謝的主要酶系。CYP450 酶活性被抑制或誘導(dǎo)是藥物代謝性相互作用的主要靶點(diǎn)，尤其是CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A，其表達(dá)和功能的改變可引起藥動(dòng)學(xué)乃至藥效學(xué)的改變[1]。目前，歐美中等國(guó)家及國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）出臺(tái)的藥物相互作用研究技術(shù)指南[2-4]，強(qiáng)調(diào)了CYP450 酶在介導(dǎo)藥物相互作用中的作用，并提供了研究方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)等的指導(dǎo)，但是在中醫(yī)藥的適用性尚不強(qiáng)。

谷紅注射液由乙酰谷酰胺和紅花提取物制成，具有抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗氧自由基等作用[5]，在臨床上常與氯吡格雷、他汀類藥物等聯(lián)用治療心腦血管疾病[6-8]。但谷紅注射液藥物相互作用研究尚不完善，本研究結(jié)合中藥多成分、多靶點(diǎn)的自身特性，開(kāi)展谷紅注射液人肝微粒體體外酶抑制實(shí)驗(yàn)和人原代肝細(xì)胞體外酶活和mRNA 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，并建立大鼠血漿中7種探針底物同時(shí)測(cè)定的UPLC-MS/MS法，以比較“Cocktail”探針底物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程的變化，開(kāi)展體內(nèi)外關(guān)聯(lián)性研究。旨在為谷紅注射液與其他藥物臨床上安全、有效地聯(lián)用提供依據(jù)，為中藥注射劑代謝性相互作用研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

谷紅注射液（批號(hào)20210310，10 mL/支）購(gòu)自通化谷紅制藥有限公司；對(duì)照品非那西?。ㄅ?hào)77440，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、槲皮素（批號(hào)Q4951，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、奧美拉唑（批號(hào)O104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、利福平（批號(hào)R3501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH，批號(hào)SLCK5429，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；安非他酮（批號(hào)100671-201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、阿莫地喹（批號(hào)101217-201401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91%）、雙氯芬酸（批號(hào)100334-201803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）、氫溴酸右美沙芬（批號(hào)100201-201204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94%）、對(duì)乙酰氨基酚（批號(hào)100018-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、噻氯匹定（批號(hào)100542-201002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、酮康唑（批號(hào)100294-201904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、苯巴比妥（批號(hào)171222-201206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、咪達(dá)唑侖（批號(hào)171265-201402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、羥基紅花黃色素 A（批號(hào)111637201810，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.10%）、乙酰谷酰胺（批號(hào)100859-202003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.40%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；美芬妥英（批號(hào)21J49-F1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、6β-羥基睪酮（批號(hào)21J052-D2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）、α-萘黃酮（批號(hào)21J136-P1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、磺胺苯吡唑（批號(hào)21J122-C3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、奎尼?。ㄅ?hào)21J118-02，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；睪酮（ 批號(hào) G1088065，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer 公司；羥基安非他酮（批號(hào)FN11131910，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）、去甲右美沙芬（批號(hào)FN04251903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）購(gòu)自Cerilliant公司；N-去乙基阿莫地喹（批號(hào)2229-086A2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、4-羥基雙氯芬酸（批號(hào)2088-058A7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）購(gòu)自TLC 公司；4-羥基美芬妥英（批號(hào)107180，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；舍曲林（批號(hào)5PBO-HB，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）購(gòu)自日本TCI 公司；茶堿（批號(hào)C14045635，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、甲苯磺丁脲（批號(hào)C12652045，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、瑞格列奈（批號(hào)C12448607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、美托洛爾（批號(hào)C14110839，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海麥克林公司；羅紅霉素（批號(hào)294889，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自J&K 公司；細(xì)胞貼壁培養(yǎng)液（批號(hào)S03316）、細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)Z99009）購(gòu)自美國(guó)Bioreclamation IVT 公司；RNA 提取試劑盒（批號(hào)DP430）、cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)KR116-02）、qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)FP206-02）購(gòu)自天根生化有限公司；甲醇、乙腈、甲酸購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 體外體系與動(dòng)物

人肝微粒體（SDL，24 mg/mL）、人原代肝細(xì)胞（HVN、QBU 和MHK）購(gòu)自美國(guó)Bioreclamation IVT公司。

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)No.IRM-DWLL-2022209）。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；AB GHRAP 5500 型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司）；Rotor-Gene Q 型熒光定量PCR 儀（德國(guó)QIAGEN 公司）；5430R 型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 谷紅注射液對(duì)人肝微粒體7 種CYP450 酶的體外抑制研究

2.1.1 人肝微粒體體外抑制實(shí)驗(yàn) 肝微粒體孵育體系包括人肝微粒體（0.5 mg/mL）、NADPH（1 mmol/L）、體外探針底物（表1）混合液、谷紅注射液或陽(yáng)性抑制劑、磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）。不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%、10%）的谷紅注射液或陽(yáng)性抑制劑（表1）與人肝微粒體預(yù)孵育15 min 后，加入探針底物和NADPH，37 ℃孵育30 min。每組樣品3 個(gè)平行，孵育體系有機(jī)溶劑占比＜1%。冰甲醇（含氧氟沙星20 ng/mL）終止反應(yīng)，渦旋3 min，13 500 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用探針底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑Table 1 Probe substrates, inhibitors and inducers used in this study

2.1.2 探針底物的代謝產(chǎn)物含量測(cè)定 采用UPLC-MS/MS 方法測(cè)定上述7 種探針底物的代謝產(chǎn)物生成量[9]。

（1）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，90%～10% A；3～4 min，10% A；4～4.2 min，10%～90% A；4.2～8.0 min，90% A；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2.000 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI+模式，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描；氣簾氣275.8 kPa；碰撞氣48.265 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度450 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；碰撞出口電壓13 V；駐留時(shí)間50 ms；其他MRM參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 體外探針底物代謝產(chǎn)物的MRM 參數(shù)Table 2 MRM parameters for metabolites of in vitro probe substrates

2.1.3 數(shù)據(jù)處理 谷紅注射液臨床靜脈滴注常用劑量為10～20 mL/d，一般正常成人循環(huán)血液總量有4～5 L，可得到臨床劑量時(shí)的理論最大血藥濃度為0.5%。本研究以體積分?jǐn)?shù)作為體外孵育體系的給藥劑量及其半數(shù)抑制濃度（ half inhibitory concentration，IC50）的計(jì)算[9]。采用GraphPad 8 軟件進(jìn)行非線性擬合并計(jì)算IC50值。

2.2 谷紅注射液對(duì)人原代肝細(xì)胞CYP450 酶的體外誘導(dǎo)研究

2.2.1 人原代肝細(xì)胞的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 人原代肝細(xì)胞復(fù)蘇后，用貼壁培養(yǎng)液稀釋成7×105個(gè)/mL，按照每孔100 μL 鋪在預(yù)鋪I 型膠原的96 孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下孵育過(guò)夜，貼壁形成單層細(xì)胞，然后更換成肝細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。第2 天加入含不同體積分?jǐn)?shù)（0.005%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、5.00%）的谷紅注射液或陽(yáng)性誘導(dǎo)劑（表1）或陰性對(duì)照藥（羅紅霉素10 μmol/L）培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)液為空白對(duì)照，連續(xù)給藥2 d，取培養(yǎng)液檢測(cè)酶活性，收集細(xì)胞檢測(cè)酶mRNA 表達(dá)。采用3 個(gè)供體，每個(gè)供體平行3 份。

2.2.2 qRT-PCR 法測(cè)定CYP 酶mRNA 表達(dá) 用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)DNase I 柱消化后，用Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒從總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2～4 μL cDNA 作為模板，利用Super Real Pre Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。引物和探針序列見(jiàn)表3。

表3 CYP450 亞酶的引物和探針序列Table 3 Primers and probe sequences of CYP450 subenzymes

2.2.3 UPLC-MS/MS 法測(cè)定CYP 酶活性 采用UPLC-MS/MS 方法測(cè)定上述3 種探針底物的代謝產(chǎn)物生成量[10]。

（1）色譜條件：Phenomenex Synegi Hydro RP色譜柱（30 mm×2.1 mm，4 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～1.5 min，95%～5% A；1.5～1.7 min，5% A；1.7～1.71 min，5%～95% A；1.71～2.0 min，95% A；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI+模式，MRM 掃描；氣簾氣137.9 kPa；碰撞氣68.95 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度500 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；駐留時(shí)間30 ms；其他MRM 參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 體外探針底物代謝產(chǎn)物的MRM 參數(shù)Table 4 MRM parameters of metabolites of in vitro probe substrate

2.2.4 數(shù)據(jù)處理

（1）酶活性誘導(dǎo)評(píng)價(jià)：當(dāng)相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性≥40%時(shí)，實(shí)驗(yàn)藥對(duì)酶活性具有潛在的誘導(dǎo)作用[2-3]。

相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性＝(實(shí)驗(yàn)組樣本相對(duì)活性－陰性對(duì)照組樣本相對(duì)活性)/(陽(yáng)性對(duì)照組樣本相對(duì)活性－陰性對(duì)照組樣本相對(duì)活性)

（2）mRNA 表達(dá)誘導(dǎo)評(píng)價(jià)：當(dāng)mRNA 表達(dá)的誘導(dǎo)倍數(shù)≥空白組2 倍且呈濃度相關(guān)性增加，具有潛在的誘導(dǎo)作用[2-3]。

ΔCt＝目的基因的Ct－內(nèi)參β-actin 的Ct

ΔΔCt＝實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性對(duì)照組的ΔCt－陰性對(duì)照組的ΔCt

誘導(dǎo)倍數(shù)＝2?ΔΔCt

2.3 谷紅注射液對(duì)大鼠CYP450 酶的體內(nèi)影響研究

2.3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 24 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和谷紅注射液低、高劑量組，每組8 只。谷紅注射液低、高劑量組分別尾iv 谷紅注射液0.9、3.6 mL/kg，對(duì)照組給予生理鹽水，1 次/d，連續(xù)10 d。第10 天給藥30 min 后，給予體內(nèi)混合探針?biāo)幬铮ū?）溶液。給予探針前（0 min），后5、10、20、30、45 min和1、2、4、6、9、12、24 h，于眼內(nèi)眥取血0.25 mL，置于肝素鈉離心管，3 000 r/min 離心10 min，得到血漿。取血漿95 μL，加內(nèi)標(biāo)工作液5 μL、甲醇300 μL，渦旋3 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液稀釋5 倍，待測(cè)。

2.3.2 血漿中7 種探針底物含量測(cè)定的UPLCMS/MS 法 UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定7 種體內(nèi)探針底物在血漿中的含量。

（1）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～0.5 min，90% A；0.5～2.5 min，90%～10% A；2.5～4.1 min，10%～90% A；4.1～6.0 min，90% A；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI+模式，MRM 掃描；氣簾氣275.8 kPa；碰撞氣48.265 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度450 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；碰撞出口電壓13 V；駐留時(shí)間50 ms；其他MRM參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 體內(nèi)探針底物的MRM 參數(shù)Table 5 MRM parameters of in vivo probe substrates

2.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證 參照生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，對(duì)該方法的選擇性、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等進(jìn)行驗(yàn)證。探針?biāo)幬锊鑹A、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾和咪達(dá)唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍分別為10～10 000、1～500、1～1 000、10～10 000、1～1 000、1～500、1～500 ng/mL，最小二乘法線性回歸，權(quán)重因子1/χ2。安非他酮、美托洛爾和咪達(dá)唑侖的低、中、高質(zhì)控質(zhì)量濃度分別為2、25、250 ng/mL；瑞格列奈和奧美拉唑的低、中、高質(zhì)控質(zhì)量濃度分別為2、75、750 ng/mL；茶堿和甲苯磺丁脲唑的低、中、高質(zhì)控質(zhì)量濃度分別為20、750、7 500 ng/mL，各質(zhì)控質(zhì)量濃度分別考察精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)（n＝6）?？疾旆治鑫镌诨|(zhì)中常溫保存24 h、?80 ℃保存14 d、凍融3 次穩(wěn)定性（n＝3）。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用Phoenix WinNonlin 8.1 軟件的非房室模型法計(jì)算各探針底物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，主要包括最大血藥濃度（Cmax）、0 到最后1 個(gè)采血點(diǎn)的藥時(shí)曲線下面積（AUC0～t）、0 到∞的藥時(shí)曲線下面積（AUC0～∞）、清除率（CL）等。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8.4.3 軟件繪圖。計(jì)量資料以±s表示，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（方差齊）或采用t’檢驗(yàn)（方差不齊）。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 空白血漿、加內(nèi)標(biāo)空白血漿及血漿樣本的總離子流圖見(jiàn)圖1，血漿中茶堿、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖和苯妥英鈉保留時(shí)間分別為1.80、2.39、2.88、2.99、2.28、2.24、2.49、2.75 min，無(wú)雜峰干擾，專屬性良好。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 探針?biāo)幬镌?～500、1～1 000、10～10 000 ng/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程和定量限見(jiàn)表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和定量限Table 6 Standard curve, linear range and limit of quantification

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 各探針底物精密度和準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 各探針?biāo)幬锏木芏?、?zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 7 Precision, accuracy, extraction recovery rate and matrix effect of each probe drug

3.1.4 提取回收率 各探針?biāo)幬锏奶崛』厥章蔙SD 均＜15%，提取回收率合格，結(jié)果見(jiàn)表7。

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 各藥物濃度的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子的RSD 均＜15%，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)符合要求，結(jié)果見(jiàn)表7。

3.1.6 穩(wěn)定性考察 各探針?biāo)幬镌诟鞣N處理后質(zhì)量濃度的RSD 均＜10.0%，表明樣品在常溫下存放24 h、?80 ℃條件下存放14 d 以及凍融3 次后穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 各探針?biāo)幬锏姆€(wěn)定性Table 8 Stability of each probe drug

3.2 谷紅注射液的體外抑制作用

體外陽(yáng)性抑制劑處理后的各CYP 亞型剩余酶活性均低于50%，探針底物代謝受到明顯抑制，孵育體系合格。不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%～10%）的谷紅注射液處理后，CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 酶的IC50值分別為1.98%、7.95%、2.85%、5.39%、4.92%、7.76%和3.41%，各CYP450 酶亞型的相對(duì)活性均出現(xiàn)不同程度的降低（圖2），但是均大于臨床劑量時(shí)的理論最大血藥濃度值0.5%。

圖2 谷紅注射液對(duì)人肝微粒體CYP450 酶7 個(gè)亞型的抑制曲線 (n = 3)Fig.2 Inhibition curve of Guhong Injection on seven subtypes of human liver microsomal CYP450 enzyme (n = 3)

3.3 谷紅注射液的體外誘導(dǎo)作用

供體HVN、QBU、MHK 的人原代肝細(xì)胞與陽(yáng)性誘導(dǎo)劑共孵育后，其酶相對(duì)活性（實(shí)驗(yàn)組酶活性/空白對(duì)照組酶活性）為235.5%～4 480%，均高于200%，提示實(shí)驗(yàn)體系合格。如表9 所示，在3 個(gè)供體中，谷紅注射液在0.005%～5%對(duì)CYP2B6、CYP3A4 酶的相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性均低于40%。而在供體MHK，谷紅注射液在0.5%～5%對(duì)CYP1A2 酶相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性高于40%，推測(cè)對(duì)CYP1A2 酶活性具有一定的誘導(dǎo)作用。

表9 谷紅注射液對(duì)人原代肝細(xì)胞CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶活性的影響 (±s, n = 3)Table 9 Effect of Guhong Injection on activity of CYP1A2, CYP2B6 and CYP3A4 enzymes in human primary hepatocytes(±s, n = 3)

表9 谷紅注射液對(duì)人原代肝細(xì)胞CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶活性的影響 (±s, n = 3)Table 9 Effect of Guhong Injection on activity of CYP1A2, CYP2B6 and CYP3A4 enzymes in human primary hepatocytes(±s, n = 3)

體積分?jǐn)?shù)/% CYP1A2 相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性/% CYP2B6 相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性/% CYP3A4 相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照活性/%HVN QBU MHK HVN QBU MHK HVN QBU MHK 5.000 4.84±4.06 8.24±9.59 72.79±11.34 8.34±3.77 19.64±3.06 8.09±0.93 ＜0 ＜0 ＜0 1.000 ＜0 2.87±9.45 64.59±18.22 0.89±0.27 3.76±1.91 4.56±0.38 ＜0 ＜0 ＜0 0.500 4.58±3.52 2.14±2.27 44.75±13.00 ＜0 1.75±0.59 5.63±1.94 ＜0 ＜0 ＜0 0.100 ＜0 ＜0 8.69±6.94 ＜0 ＜0 0.15±2.18 ＜0 ＜0 ＜0 0.050 ＜0 ＜0 5.33±5.17 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 0.005 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0

HVN、QBU、MHK 為3 個(gè)供體的人原代肝細(xì)胞。HVN, QBU and MHK are three donors of human primary hepatocytes.

陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)3 個(gè)批次的人原代肝細(xì)胞的CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4誘導(dǎo)倍數(shù)均高于空白對(duì)照的2 倍，而陰性對(duì)照組均低于空白對(duì)照的2 倍，表明孵育體系合格（圖3）。谷紅注射液（0.05%～10%）使CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4酶mRNA 表達(dá)倍數(shù)分別增加最高達(dá)18.74、7.74、5.96 倍，且呈濃度相關(guān)性，說(shuō)明谷紅注射液對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4的mRNA 表達(dá)具有潛在的誘導(dǎo)作用。

圖3 谷紅注射液對(duì)人原代肝細(xì)胞CYP1A2 (A)、CYP2B6 (B)、CYP3A4 (C) 的mRNA 誘導(dǎo)倍數(shù) (n = 3)Fig.3 mRNA induction multiple of Guhong Injection on CYP1A2 (A), CYP2B6 (B) and CYP3A4 (C) in human primary hepatocytes (n = 3)

3.4 谷紅注射液對(duì)大鼠體內(nèi)CYP450 酶的影響

茶堿、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖4，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表10。與對(duì)照組比較，谷紅注射液高劑量組中茶堿的AUC0～t和AUC0～∞降低19.67%、20.33%，安非他酮的AUC0～∞降低40.41%，咪達(dá)唑侖的AUC0～t和AUC0～∞降低57.88%、57.43%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。谷紅注射液低劑量組中奧美拉唑的AUC0～t和AUC0～∞降低43.14%、41.69%，高劑量組AUC0～t和AUC0～∞降低49.53%、49.60%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。瑞格列奈、甲苯磺丁脲和美托洛爾的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯變化。谷紅注射液使大鼠體內(nèi)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19 和CYP3A4 酶活性被明顯增加，而CYP2C8、CYP2C9和CYP2D6 的酶活性無(wú)明顯變化。

圖4 各探針?biāo)幬镅帩舛?時(shí)間曲線 (±s, n = 8)Fig.4 Blood drug concentration-time curve of each probe drug (±s, n = 8)

表10 各探針?biāo)幬镏饕巹?dòng)學(xué)參數(shù) (±s, n = 8)Table 10 Main pharmacokinetic parameters of each probe drug (±s, n = 8)

探針?biāo)幬?組別 t1/2/h Cmax/(ng·mL?1) AUC0～t/(ng·h·mL?1) AUC0～∞/(ng·h·mL?1) CL/(L·h·kg?1) Vd/mL茶堿 對(duì)照 2.51±0.61 9 771.25±1 422.20 50 230.84±6 686.36 51 021.88±6 479.90 47.74±5.59 169.99±38.22低劑量 2.34±0.67 10 520.00±919.90 47 286.51±6 233.28 47 492.46±6 153.11 51.46±7.18 174.70±63.19高劑量 2.39±0.52 8 707.50±577.27 40 351.04±6 345.27* 40 647.46±6 115.31* 60.30±8.39* 207.38±55.88安非他酮 對(duì)照 0.63±0.17 28.33±8.85 20.73±5.56 23.41±6.68 28 263.34±9 484.12 25 904.78±11 552.59低劑量 0.61±0.17 17.01±7.94 13.75±7.08 17.01±7.98 44 674.97±21 679.74 35 096.24±10 271.93高劑量 0.49±0.06 18.94±9.35 14.80±8.23 13.95±6.00* 51 059.67±19 938.07* 35 320.46±11 155.52瑞格列奈 對(duì)照 5.16±1.83 532.75±111.01 942.01±234.99 970.62±232.35 328.28±83.20 2 409.88±985.36低劑量 5.97±2.82 461.50±131.93 883.99±205.74 904.26±209.78 354.02±97.79 3 142.47±2 075.29高劑量 3.82±1.06 300.63±76.78 716.52±288.82 731.57±288.08 483.28±202.59 2 755.19±1 777.02甲苯磺丁脲 對(duì)照 6.97±0.85 4 573.75±1 039.94 50 220.00±11 799.71 55 774.96±12 906.34 5.76±1.71 57.65±16.05低劑量 5.81±0.93 5 653.75±1 438.97 54 319.41±13 712.80 57 780.27±14 394.44 5.65±1.95 48.50±22.49高劑量 7.62±2.07 4 238.75±1 890.96 47 343.86±20 640.72 55 197.78±27 612.37 6.91±3.26 71.38±35.22奧美拉唑 對(duì)照 3.09±3.17 1 266.25±150.58 809.94±182.09 820.22±186.53 3 882.12±997.51 18 423.61±20 106.08低劑量 0.40±0.27 632.25±206.79* 460.55±202.96* 478.27±200.55* 7 681.77±3 839.27* 4 394.56±3 048.41高劑量 1.47±1.51 654.75±286.24* 408.77±199.51* 413.35±203.72* 9 578.44±6 105.20* 16 381.41±13 544.52美托洛爾 對(duì)照 0.87±0.30 698.63±195.29 689.64±302.94 696.72±304.40 5 032.49±1 804.60 6 148.77±2 388.02低劑量 0.62±0.13 482.00±162.05 497.88±198.08 501.47±196.97 6 876.67±2 452.76 6 045.28±2 385.21高劑量 0.62±0.06 444.00±92.82 434.25±86.62 443.94±96.37 7 053.46±1 375.27 6 288.09±1 384.48咪達(dá)唑侖 對(duì)照 1.30±0.73 264.31±125.20 261.79±153.76 267.56±153.40 13 291.24±8 138.37 19 019.76±6 084.75低劑量 0.78±0.21 149.91±86.98 196.23±131.30 233.55±124.49 14 087.75±8 059.33 16 765.89±11 093.63高劑量 0.74±0.20 103.33±29.76* 110.27±45.89* 113.90±45.64* 24 385.51±8 926.78* 26 602.93±11 943.42

與對(duì)照組比較：*P＜0.05。*P < 0.05 vs control group.

4 討論

本研究中體外抑制實(shí)驗(yàn)底物和抑制劑的選擇參考FDA 體外藥物相互作用指導(dǎo)原則[2]，抑制劑的濃度經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，還比較了7 個(gè)亞型酶抑制劑一起加入以及分成α-萘黃酮、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁、酮康唑和舍曲林、槲皮素2 組分別加入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 個(gè)抑制劑混合加入后，每種亞型酶活性可被明顯抑制。谷紅注射液對(duì)人肝微粒體7 種亞酶IC50值均大于其在人體內(nèi)最大血藥濃度（0.5%），推測(cè)其在臨床劑量范圍內(nèi)，與上述酶底物聯(lián)用時(shí)發(fā)生藥物相互作用的可能性較小。

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)以代謝酶的mRNA 表達(dá)水平作為代謝酶誘導(dǎo)的評(píng)價(jià)終點(diǎn)，與評(píng)價(jià)酶活性相比更加敏感，可以降低CYP450 酶誘導(dǎo)假陰性的概率。原代肝細(xì)胞被廣泛用于預(yù)測(cè)CYP450 藥物誘導(dǎo)的潛在作用，并已被FDA 批準(zhǔn)為該領(lǐng)域的有效工具[11]。本研究發(fā)現(xiàn)谷紅注射液可使人原代肝細(xì)胞CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的mRNA 水平均提高超過(guò)2 倍且呈濃度相關(guān)性增加，表明其對(duì)人原代肝細(xì)胞3 種主要亞酶有潛在的誘導(dǎo)作用，與CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶底物聯(lián)用時(shí)可能會(huì)降低其療效。

體內(nèi)Cocktail 探針?biāo)幬锓▽€(gè)體間差異、個(gè)體內(nèi)隨時(shí)間變化的生理影響和成本降低，可用于藥物對(duì)不同CYP450 亞型活性的研究[12]。谷紅注射液以臨床等效劑量連續(xù)給藥后，大鼠體內(nèi)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19 和CYP3A4 的酶活性被明顯誘導(dǎo)，與體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在腦血管疾病常見(jiàn)藥中，他汀類藥物如阿托伐他汀、辛伐他汀，抗凝藥物華法林，抗血小板藥物氯吡格雷，均為CYP3A4的底物。建議臨床上盡量避免谷紅注射液與上述藥物的聯(lián)用，尤其CYP3A4 底物，可能會(huì)誘導(dǎo)其代謝加快從而降低療效的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，本研究評(píng)估了谷紅注射液體外對(duì)人源CYP450 酶抑制和誘導(dǎo)作用，結(jié)果顯示谷紅注射液可誘導(dǎo)CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶的mRNA表達(dá)。體內(nèi)評(píng)估了對(duì)大鼠CYP450 酶的影響，提示體內(nèi)與體外結(jié)果一致。谷紅注射液對(duì)CYP450 酶誘導(dǎo)可能產(chǎn)生的代謝性相互作用及其臨床意義，需要進(jìn)一步通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突