發(fā)酵蔬菜中乳酸菌分離及其耐酸耐膽鹽特性分析

鄭秋霞 李自強(qiáng) 吳麗云

摘 要：為獲得優(yōu)良的耐酸耐膽鹽乳酸菌菌株，從市售發(fā)酵蔬菜樣品中分離乳酸菌，通過形態(tài)學(xué)觀察以及糖發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，并開展耐酸耐膽鹽初篩及人工胃腸液復(fù)篩試驗(yàn)。結(jié)果表明：分離出的18株乳酸菌菌株中，有11株具有較高的耐酸耐膽鹽能力；經(jīng)過人工胃腸液復(fù)篩后，存活率高于30%的有4株，其中cf12菌株在人工胃液中存活率達(dá)到95%，人工腸液處理4、8 h后的存活率分別為173%、194%，菌液濃度未有下降反而有所增加，說明該菌株對(duì)低酸性環(huán)境及高膽鹽環(huán)境均具有較強(qiáng)的耐受能力。4株乳酸菌經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定表明，菌株cf10為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，菌株cf9、cf12為短乳桿菌Lactobacillus brevis，菌株cf18為副短乳桿菌Lactobacillus parabrevis。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵蔬菜；乳酸菌；分離；耐酸；耐膽鹽

中圖分類號(hào)：TS 255? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）02-0028-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.005

Abstract： In order to obtain the lactic acid bacteria strains with excellent acid and bile salt tolerance， the lactic acid bacteria were isolated from the commercial fermented vegetable samples and preliminarily identified by using the morphological observation and sugar fermentation test. Then， the screening of acid and bile salt resistance and the rescreening test of artificial gastrointestinal juice were carried out. The results showed that 11 of the 18 strains of lactic acid bacteria had high acid and bile salt tolerance. After the rescreening of artificial gastrointestinal juice， the survival rate of 4 strains was higher than 30%， and the survival rate of the strain cf12 in artificial gastric juice reached 95%. The survival rates of the strains treated with the artificial intestinal juice for 4 h and 8 h were 173% and 194%， respectively. The concentration of bacterial suspension did not decrease but increased， indicating that the strain had strong tolerance to the low acidic environment and high bile salt environment. The 16S rDNA molecular biological identification of the four strains of lactic acid bacteria showed that the strain cf10 was Lactobacillus plantarum， the strains cf9 and cf12 were Lactobacillus brevis， and the strain cf18 was Lactobacillus parabrevis.

Key words： Fermented vegetables； Lactic acid bacteria； Isolation； Acid tolerance； Bile salt tolerance

發(fā)酵蔬菜有著悠久的歷史，是以蔬菜為原料，利用微生物進(jìn)行發(fā)酵的傳統(tǒng)食品。其不僅保留蔬菜的營養(yǎng)成分如氨基酸、膳食纖維和維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含乳酸菌、酵母、醋酸桿菌等功能微生物，其中以乳酸菌尤為多樣豐富，是分離獲得乳酸菌菌株的理想材料[1-3]。近年來，以發(fā)酵蔬菜制品為材料分離各類乳酸菌的報(bào)道屢見不鮮。聶紫玉等[4]以傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜為材料分離篩選獲得19株無溶血性、不產(chǎn)生生物胺、安全性較高的乳酸菌。張會(huì)生等[5]從泡菜中分離獲得的植物乳桿菌NCU001210、乳酸乳球菌NCU036015、腸膜明串珠菌NCU018046，在人工胃腸液中的存活率能達(dá)到85%以上。曾維友等[6]從泡菜中分離獲得的植物乳桿菌S78能夠耐受pH3.0的人工胃液和0.3%的膽鹽環(huán)境。

乳酸菌具有抑制有害微生物生長、維持腸道微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等諸多功能[7-10]。含有較高耐酸耐膽鹽能力的乳酸菌發(fā)酵食品經(jīng)人體食用后，其乳酸菌能夠在腸胃中存活，有利于發(fā)揮乳酸菌的益生特性[11-14]，因而篩選獲得具有優(yōu)良的耐酸耐膽鹽特性的乳酸菌菌株具較大的應(yīng)用前景。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察及理化特性試驗(yàn)從市售發(fā)酵蔬菜中分離乳酸菌，并對(duì)菌株開展耐酸耐膽鹽特性、人工腸胃液耐受性試驗(yàn)，以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，以期獲得性狀優(yōu)良的耐酸耐膽鹽乳酸菌菌株，為菌株后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

福州市永輝超市及沃爾瑪超市市售發(fā)酵蔬菜。

1.2 試劑和儀器

MRS培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；牛膽鹽（麥克林試劑）；胃蛋白酶（豬源）、胰蛋白酶（豬源）（上海源葉生物科技有限公司）。

BINDER恒溫培養(yǎng)箱（德國賓德公司）；759S紫外可見光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］。

1.3 培養(yǎng)基配制

（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂作為分離培養(yǎng)基。（2）耐酸試驗(yàn)培養(yǎng)基：1 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值至3.0。（3）耐膽鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加過濾除菌后的牛膽鹽，使其終濃度為0.3%。（4）人工胃液及人工腸液：參照孫寧等[15]的方法進(jìn)行配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵蔬菜中乳酸菌分離 隨機(jī)選取市售的酸菜樣品，稱取10 g樣品加入生理鹽水中，稀釋至10-8，依次涂布至MRS平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。選取適宜的濃度挑取單菌落進(jìn)行劃線純化，直至菌落大小一致，簡單染色鏡檢后菌體形態(tài)一致。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[17]對(duì)分離獲得菌株進(jìn)行形態(tài)觀察及糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.3 菌株耐酸能力初篩 根據(jù)姜美娜[18]的方法將連續(xù)活化2代的種子液以2%濃度接種至pH3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，分別取0、24 h的培養(yǎng)液測定其在600 nm波長下的吸光值，并取50 μL培養(yǎng)液涂布于MRS平板上觀察生長情況。

1.2.4 菌株耐膽鹽能力初篩 連續(xù)活化2代的種子液以2%濃度接種至含0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，分別取0、24 h的培養(yǎng)液測定其在600 nm波長下的吸光值，并取50 μL培養(yǎng)液涂布于MRS平板上觀察生長情況。

1.2.5 菌株人工胃腸液復(fù)篩 取1 mL經(jīng)耐酸耐膽鹽初篩后的菌株種子液接種至9 mL人工胃液中，37℃培養(yǎng)3 h，對(duì)0 h及3 h的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率。選擇存活率大于30%的菌株，取1 mL經(jīng)人工胃液培養(yǎng)3 h后的菌液，接種至9 mL人工腸液中，37℃培養(yǎng)8 h，對(duì)0 、4 、8 h后的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率。

1.2.6 分子鑒定 選擇生物工程（上海）有限公司試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行DNA提取，以16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物工程（上海）有限責(zé)任公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI基因庫中進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵蔬菜中乳酸菌菌株分離結(jié)果

由表1、圖1可知，從樣品中分離純化獲得18株菌株，均為革蘭氏陽性菌。將分離獲得的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)比《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可將18株菌株初步歸為乳酸菌（表2）。

2.2 分離乳酸菌菌株耐酸初篩結(jié)果

乳酸菌能夠發(fā)揮其益生作用是以在胃腸液中存活為前提條件，胃液中含有大量的胃蛋白酶和鹽酸，在空腹時(shí)pH值可低至1.5～2.0，而進(jìn)食后可升至pH3.5左右，因而菌株的耐酸能力越高，在胃液中的存活率越高。

由表3可知，在pH3.0的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，與0 h相比菌株在600 nm波長下的吸光度差值高于0.05的菌株有9株，涂布于平板后菌株仍可生長，說明這9株菌株對(duì)低酸性環(huán)境有一定的耐受能力。

2.3 分離乳酸菌菌株耐膽鹽的初篩結(jié)果

由表4可知，在含有0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，與0 h相比菌株在600 nm波長下的吸光度差值高于0.05的菌株有11株。其中菌株cf7、cf10、cf11、cf16的吸光值達(dá)到0.2以上，說明其在含有膽鹽的培養(yǎng)基中能較好地增殖，對(duì)膽鹽的耐受程度較高。cf1雖對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力較弱，但對(duì)膽鹽仍有一定的耐受能力。故共有11株菌株能夠耐受0.3%的膽鹽。

2.4 耐酸耐膽鹽乳酸菌菌株的人工胃腸液復(fù)篩

由表5可知，受試菌株中cf1、cf9、cf10、cf12、cf18的存活率在30%以上，其中cf12在人工胃液中的存活率最高，達(dá)到95%，其他菌株按照存活率大小依次為cf1、cf18、cf9、cf10。

由表6可知，11株菌株在腸液中均能存活，cf7、cf9、cf12、cf10、cf15、cf16和cf18這7株菌在人工腸液處理8 h存活率仍然大于30%。其中菌株cf7、cf9、cf12在腸液中的存活率最高，與未經(jīng)腸液處理時(shí)相比菌液濃度不變甚至有所上升，其余菌株的菌液濃度隨處理時(shí)間的延長而有所下降。菌株cf1、cf11、cf13、cf17在腸液中存活率最低。

2.5 耐酸耐膽鹽乳酸菌菌株分子鑒定結(jié)果

選取在人工胃液和人工腸液中存活率均大于30%的菌株cf9、cf10、cf12、cf18作為優(yōu)良菌株，提取DNA 并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過16S rDNA測序后，經(jīng)NCBI基因庫中比對(duì)其相似度在99%以上，經(jīng)鑒定菌株cf10為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，菌株cf9、cf12為短乳桿菌Lactobacillus brevis，菌株cf18為副短乳桿菌Lactobacillus parabrevis。

3 結(jié)論與討論

本研究從市售發(fā)酵蔬菜食品中分離出18株菌，經(jīng)菌株形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)初步鑒定為乳酸菌。通過對(duì)18株菌株的耐酸能力和耐膽鹽能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有9株菌株對(duì)低酸性環(huán)境有較好的耐受能力，有11株菌株能夠耐受高濃度的膽鹽環(huán)境。因乳酸菌在胃液中只是短暫停留，要在腸道中存活仍需經(jīng)受腸液的消化作用[19-20]，而腸道消化液的主要成分為膽鹽及胰液[18]，乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受程度越高，在腸道中的存活率越高，所以選擇11株菌株進(jìn)行人工腸胃液的復(fù)篩試驗(yàn)。結(jié)果表明有4株菌株在人工腸胃液的存活率均高于30%，其中菌株cf12在人工胃液中的存活率達(dá)到95%，在人工腸液中存活率達(dá)到173%（4 h）和194%（8 h）。最后對(duì)4株菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定及同源性比對(duì)可知，1株植物乳桿菌cf10，2株短乳桿菌cf9、cf12，1株副短乳桿菌cf18。

乳酸菌對(duì)人工胃液和人工腸液的耐受能力，能夠確保其通過胃部的高酸環(huán)境并能在腸道消化液中保持一定的活性[21]，本研究篩選獲得的乳酸菌具有耐酸耐膽鹽能力，具備研究開發(fā)的潛力，后續(xù)將對(duì)其開展進(jìn)一步的功能性研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃慧福，寧丹，楊誠睿.傳統(tǒng)富源酸菜中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選及應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（4）：197-202.

[2]CHOI A R.PATRA J K，KIM W J，et al.Antagonistic activitiesand probiotic potential of lactic acid bacteria derived from a plantbased fermented food[J].Frontiers in Microbiology，2018，9：1963.

[3]劉長根.我國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜微生物多樣性比較[D].南昌：南昌大學(xué)，2019.

[4]聶紫玉，吳艷陽，王增光，等.植物源益生乳酸菌的篩選及其特性[J].食品科學(xué)，2022，43（18）：143-151.

[5]張會(huì)生，熊濤.三株乳酸菌的鑒定及益生性能[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版），2019，43（4）：336-341.

[6]曾維友，周於強(qiáng)，池浩.泡菜中乳酸菌的分離鑒定及抗性篩選[J].中國釀造，2021，40（10）：163-167.

[7]夏勒合特·巴克爾拜，劉晶晶，賀紅軍，等.新疆傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的分離鑒定及其益生性能評(píng)價(jià)[J].保鮮與加工，2021，21（11）：87-93.

[8]李獻(xiàn)華，王許剛，高晶萍，等.乳酸菌的生物學(xué)功能及其在家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].飼料研究，2022，45（14）：121-124.

[9]田珂雪，陳雪洋.乳酸菌益生功能及其在食品中的應(yīng)用綜述[J].河南農(nóng)業(yè)，2020， 551（27）：43-45.

[10]解文利.貴州吉林傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜微生物多樣性及其乳酸菌抗氧化功能評(píng)估[D].貴陽：貴州大學(xué)，2021.

[11]柳青.具有潛在益生特性乳酸菌的篩選鑒定及其特性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[12]張琳，荊海曉.乳酸菌菌株分離及益生效果評(píng)價(jià)[J].中國調(diào)味品，2022，47（9）：68-71.

[13]趙鑫，胡蝶，張素平，等.傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的篩選鑒定及抗氧化特性分析[J].中國調(diào)味品，2022，47（2）：5-9.

[14]羅強(qiáng)，李幸洋，陳煉紅，等.傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中乳酸菌種群組成及優(yōu)良菌株產(chǎn)酸耐酸特性分析[J].食品科學(xué)，2021，42（2）：158-163.

[15]孫寧，雷敬玲，吳曉青，等.自然發(fā)酵酸筍中乳酸菌的篩選鑒定及益生特性研究[J].中國釀造，2020，39（6）：63-68.

[16]BUCHANAN R E.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[17]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[18]姜美娜.朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中耐酸乳酸菌的分離篩選及益生特性研究[D].吉林：延邊大學(xué)，2020.

[19]陳霞.具有益生功能的Bifidobacterium animalis subsp.lactisV9 的安全性評(píng)估、生理功效及其全基因組學(xué)研究[D].內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[20]劉舒展.瑞士乳桿菌NS8抗癌活性及其機(jī)制的初步探討[D].浙江：杭州師范大學(xué)，2017.

[21]馮金曉，李明珠，李翠萍，等.傳統(tǒng)泡菜中兩株耐酸性乳酸菌的分離與鑒定[J].食品與機(jī)械，2021，37（5）：22-26.

（責(zé)任編輯：柯文輝）