基于ISSR分子標記的44種山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

陳陽 周先治 馬麗娜 蘭準柄

摘 要：為探討不同地區(qū)山藥種質(zhì)資源類型及遺傳多樣性親緣關(guān)系，為山藥品種選育、種質(zhì)資源的保護利用提供參考。采用ISSR標記技術(shù)對44份山藥種質(zhì)資源進行遺傳多樣性及聚類分析。結(jié)果表明：從100條隨機引物中篩選出8條隨機引物，8條引物擴增獲得的總譜帶數(shù)為87條，多態(tài)性譜帶數(shù)為87條，多態(tài)性譜帶比例為100%。聚類分析將44份種質(zhì)資源分成 4 個類群，從結(jié)果看ISSR標記技術(shù)聚類分析與植物分類學(xué)進行的基原分類結(jié)果基本一致，44份山藥種質(zhì)資源的遺傳距離在0.0313～0.7216，以遺傳距離為0.5618進行劃分，可以將44份山藥種質(zhì)資源劃分為5類，其中薯蕷與褐苞薯蕷親緣關(guān)系最近，與山薯較遠，與參薯距離最遠。

關(guān)鍵詞：山藥；種質(zhì)資源；ISSR標記技術(shù)；遺傳多樣性

中圖分類號：S 632.1? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）02-0001-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.001

Abstract： In order to explore the types of yam germplasm resources and the genetic relationship of their genetic diversity in different regions， and provide reference for the breeding of Chinese yam varieties and the protection and utilization of germplasm resources， the genetic diversity and cluster analysis of 44 germplasm resources of Chinese yam were carried out by ISSR marker technique. The results showed that the 8 arbitrary primers were screened from 100 arbitrary primers， and the total number of bands amplified by 8 primers was 87， the number of polymorphic bands was 87， and the proportion of polymorphic bands was 100%. The cluster analysis divided the 44 germplasm resources into four class groups. The results of the cluster analysis by ISSR marker technique were basically consistent with the original classification results of plant taxonomy. The genetic distance of the 44 yam germplasm resources ranged from 0.0313 to 0.7216. According to the genetic distance of 0.5618， the 44 germplasm resources of yam could be divided into 5 categories. Among them， the genetic relationship between Dioscorea opposita and Dioscorea persimilis was the closest， which was far from Dioscorea opposita and the farthest from Dioscorea opposita.

Key words： Yam； Germplasm resource； ISSR marker technique； Genetic diversity

山藥Dioscoreaopposita為薯蕷科Dioscoreaceae、薯蕷屬DioscoreaL.植物，一年或多年生纏繞性藤本植物[1-3]。山藥肉質(zhì)細膩，風(fēng)味鮮美，既可供人們食用，又具有增強人體免疫能力、健脾益胃、延緩衰老、抑制腫瘤、抗氧化活性等作用，是藥、菜、糧兼用的特色農(nóng)產(chǎn)品[4-13]。山藥種類繁多，裴鑒[14]在《中國植物志》中將山藥及其相近種分為薯蕷、參薯、山薯、褐苞薯蕷、日本薯蕷。目前在我國大面積栽培種主要有薯蕷、參薯、褐苞薯蕷、山薯等4種薯蕷屬植物，其中薯蕷主產(chǎn)在我國北方地區(qū)，參薯、褐苞薯蕷、山薯主產(chǎn)在我國南方地區(qū)。由于各地區(qū)山藥種質(zhì)資源在品種特性及地域分布存在較大差異，導(dǎo)致當前生產(chǎn)上種植的山藥品種較為雜亂，不利于引種及品種遺傳改良。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA 分子標記已廣泛應(yīng)用于山藥遺傳多樣性和品種選育研究。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者利用各種手段對山藥種質(zhì)資源進行了收集、保存、分類、鑒定和保護利用，其中形態(tài)學(xué)標記和DNA分子標記是研究山藥遺傳多樣性和品種分類的主要方法[15]。周延清等[16]利用ISSR標記技術(shù)分析了28個山藥品種的遺傳多樣性，多態(tài)性比率為 83.01%，將28個山藥品種劃分為4組。華樹妹等[17]采用 RAPD標記技術(shù)將福建山藥資源聚類分為4類，通過分子標記能將參薯和普通山藥分開。我國山藥種質(zhì)資源分布廣泛，地理分布存在較大差異，分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，DNA分子標記應(yīng)用于山藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，顯示出強大的優(yōu)勢。為了更準確地了解山藥種質(zhì)資源類型及親緣關(guān)系，本研究采用ISSR標記技術(shù)對來自全國不同地區(qū)的44份山藥資源進行遺傳多樣性聚類分析，探討山藥栽培種薯蕷、參薯、褐苞薯蕷、山薯之間親緣關(guān)系的遠近，以期為山藥資源分類鑒定、新品種的選育、種質(zhì)資源的保護利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2022年收集河北省、河南省、湖南省、湖北省、廣東省、福建省等地區(qū)的地方主栽山藥種質(zhì)資源，共 44 份。其中包括 9份薯蕷Dioscoreaopposita Thunb、 9 份褐苞薯蕷Dioscoreapersimilis Prain et Burkill、2份山薯DioscoreafordiiPrain et Burkill和 24 份參薯Dioscoreaalata L.。材料的編號及來源地見表1。

1.2 主要試劑

本試驗所用的100條隨機引物（編號為S801～S900）和M5CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司，瓊脂糖、Rnase酶、PremixTaq酶等試劑均購自鼎國生物。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計 試驗于2022年4月在德化縣龍潯鎮(zhèn)英山村山藥基地進行。 44份山藥種質(zhì)資源按當?shù)爻Ｒ?guī)立架栽培進行種植管理，定期觀察記載。

1.3.2 山藥種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀調(diào)查 每個山藥種質(zhì)資源在伸蔓期采摘植株嫩葉部位作為DNA提取材料。在生長旺盛期，調(diào)查不同類別山藥種質(zhì)資源生長勢、葉形、葉色、莖蔓形狀、零余子、開花情況；收獲時調(diào)查不同類別山藥種質(zhì)資源塊莖形狀、薯皮顏色、薯塊肉色。

1.4 山藥種質(zhì)資源基因組總DNA的提取

按照基因組試劑盒說明方法提取總DNA。ISSRPCR反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，30～60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，10℃保存30 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像并保存。

1.5 擴增產(chǎn)物的分離與記錄

根據(jù)凝膠電泳顯示結(jié)果，按照擴增產(chǎn)物條帶的有無進行統(tǒng)計，在同一位置上有擴增條帶的記為“1”，無擴增條帶為“0”，把所有樣品共有的位點記為無多態(tài)性位點，其余的均為多態(tài)性位點，將各引物的擴增結(jié)果進行記錄，建立所有位點的二元數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計分析

聚類分析采用DPS 7.05軟件進行，種質(zhì)間遺傳距離采用UPGMA法聚類分析，構(gòu)建遺傳關(guān)系系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 44份山藥種質(zhì)資源形態(tài)特征分析

由表2可知，同一山藥資源類群基本上具有相同性狀特征，其中薯蕷類群山藥種質(zhì)資源主要特征為：植株生長勢中等或較弱，葉片較小，葉形為戟形，具零余子，大多開花，地下塊莖為長圓柱形，肉色為白色，表皮較光滑，單株塊莖質(zhì)量較??；褐苞薯蕷類群山藥種質(zhì)資源主要特征為：植株生長勢較強或中等，葉片中等大小，葉形為心形，葉脈顏色較深，基本無零余子，部分開花，地下塊莖為圓柱形，薯皮顏色呈黑褐色或黃褐色，薯肉顏色為白色；山薯類群山藥種質(zhì)資源主要特征為：植株生長勢較強，葉片中大型，葉形卵形或心形，具零余子，不開花，地下塊莖為圓柱形或棒狀，薯皮顏色呈褐色或灰褐色，薯肉顏色為白色；參薯類群山藥種質(zhì)資源主要特征為：植株生長勢普遍較強，葉片較大，葉形為卵形或心形，無零子，基本不開花，莖蔓有棱翼，薯皮顏色為褐色、黃褐色、紫紅色，薯肉顏色較豐富，有紫色、紫紅色、紫白色、白色等，塊莖形狀各異，有圓柱、腳板狀、扁平狀等諸多形狀，塊莖質(zhì)量普遍較大。

2.2 44份山藥種質(zhì)資源ISSR引物擴增結(jié)果

由表3可知，采用ISSRPCR反應(yīng)體系對100條隨機引物進行了擴增反應(yīng)，篩選出條帶清晰，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性較高的引物8條，各引物擴增出8～14條帶，其中S817擴增的條帶數(shù)最多，為14條，8條引物的總擴增條帶數(shù)為87條，多態(tài)性條帶數(shù)為87條，多態(tài)比例達100%。

2.3 44份山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

根據(jù)44個山藥資源ISSRPCR擴增結(jié)果，其中引物S807對44個山藥品種的ISSR擴增結(jié)果見圖1。利用DPS軟件各山藥資源遺傳距離用UPGMA法聚類分析，統(tǒng)計各山藥資源間的遺傳相似系數(shù)，建立44份山藥種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系樹狀見圖2。

由圖2可知，44份山藥種質(zhì)資源的遺傳距離在0.0313～0.7216，當遺傳距離越近，表明種質(zhì)資源親緣關(guān)系越近，遺傳距離越遠，表明種質(zhì)資源親緣關(guān)系越遠。本研究遺傳距離最遠為0.7216，說明44份山藥種質(zhì)資源遺傳差異較大，其中編號23和24的山藥遺傳距離為0，說明這兩種山藥種質(zhì)資源很有可能為同物異名。

以遺傳距離為0.5618進行劃分，可以將44份山藥種質(zhì)資源劃分為5類，第1類有30個品種，編號為1、4、31、2、23、24、33、36、37、40、44、43、41、8、10、19、20、22、6、9、11、13、27、12、21、18，28、34、35、29，這30個品種主要來自河北、河南、山東、福建、廣西和廣東等地，從植物學(xué)分類看包含所有類別的山藥種質(zhì)資源；第2類包括1個品種，編號為16，這個品種來自廣西南寧；第3類包括9個品種，編號為3、5、14、15、17、25、26、32、38，9個品種主要來自廣西、湖南、福建等地；第4類包括3個品種30、39、42，這3個品種分別來自廣西、廣東和福建；第5類包括1個品種，編號為7，這個品種來自湖南邵陽。從植物學(xué)分類看，第2類至第5類均為參薯類群。

以遺傳距離為0.3646進行劃分，第一大類可劃分成為5個亞類，其中第1、2亞類含1、4、31、2等在內(nèi)的18份山藥種質(zhì)資源，這些山藥種質(zhì)資源全部為薯蕷類群及褐苞薯蕷類群，從遺傳距離看薯蕷類群遺傳距離在0.0313～0.2353，褐苞薯蕷類群遺傳距離在0.1111～0.2536；第3、4、5亞類含6、9、11、13等在內(nèi)12份山藥種質(zhì)資源，這些山藥種質(zhì)資源為山薯類群及參薯類群。從試驗結(jié)果可以看出，ISSR聚類分析將44份山藥資源分成 4 個類群，即薯蕷類群、褐苞薯蕷類群、山薯類群、參薯類群，聚類分析結(jié)果與植物分類學(xué)進行的基原分類結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

ISSR分子技術(shù)具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、操作方便及成本低等優(yōu)點[18]。本研究采用ISSRPCR反應(yīng)體系，對100條隨機引物進行了擴增反應(yīng)。從篩選的結(jié)果來看，篩選出條帶清晰，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性較高的引物8條，各引物擴增出8～14條帶，說明山藥各種質(zhì)資源間具有相當高的ISSR位點，篩選44個山藥種質(zhì)資源DNA標記多態(tài)性比例都為100%。44份山藥資源中有9份資源為薯蕷類，分布在河南、河北、山東等3個省區(qū)，可以看出北方地區(qū)栽培的山藥類群主要以為薯蕷類群為主；9份資源為褐苞薯蕷、2份資源為山薯，全部分布在福建，24份資源為參薯類，分布在福建、湖南、江西、廣東、廣西等地，可以看出南方地區(qū)栽培的山藥類群主要為參薯類群、褐苞薯蕷類群、山薯類群。

本研究結(jié)果顯示ISSR聚類分析將44份山藥種質(zhì)資源分成 4 個類群，即薯蕷類群，褐苞薯蕷類群、山薯類群、參薯類群，聚類分析結(jié)果與植物分類學(xué)進行的基原分類結(jié)果基本一致。44份山藥種質(zhì)資源的遺傳距離在0.0313～0.7200，說明山藥種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系較為復(fù)雜。其中薯蕷類資源遺傳距離在0.0313～0.2353，褐苞薯蕷資源遺傳距離在0.1111～0.2536，山薯資源遺傳距離在0.2929～0.3475，參薯資源遺傳距離在0.2861～0.7216，說明薯蕷與褐苞薯蕷親緣關(guān)系最近，與山薯較遠，與參薯距離最遠。從植物學(xué)形態(tài)特征上看，薯蕷與褐苞薯蕷具有許多共同點，山藥塊莖都為長棒形，肉色白色，塊莖外觀較為相似；薯蕷、褐苞薯蕷在植物學(xué)形態(tài)特征上與參薯差異較大。試驗結(jié)果說明ISSR聚類分析能將具有相近親緣關(guān)系、相似形態(tài)類型的山藥種質(zhì)資源聚在一起，能反映不同種質(zhì)資源遺傳類型的差異。

本結(jié)論與李麗紅等[19]的研究結(jié)果參薯類群與山薯類群較近，與薯蕷類群和褐苞薯蕷類群較遠結(jié)論吻合，與張武君等[20]的研究中薯蕷和山薯先聚為一類，再和褐苞薯蕷聚為一類，參薯的遺傳距離最遠，有所差異，而與黃玉仙等[21]的研究山薯與褐苞薯蕷親緣關(guān)系最近，與薯蕷較遠，與參薯最遠結(jié)論有較大差別。今后本研究還將繼續(xù)收集不同地區(qū)山藥資源，對不同類群山藥親緣關(guān)系做進一步的研究，以求獲得更全面、更準確的分析結(jié)果。

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