基于ATR-FTIR研究藥食同源植物多花黃精的產(chǎn)地分布

蔣芙蓉　江星明　黃良輝　夏新斌　何雄　袁志鷹

〔摘要〕 目的 基于傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（attenuated total reflection-flourier transformed infrared spectroscopy， ATR-FTIR）研究藥食同源植物多花黃精的產(chǎn)地分布。方法 采用 ATR-FTIR 技術(shù)采集不同產(chǎn)地多花黃精粉末樣本的紅外光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)紅外譜圖的波數(shù)分析其對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)，并進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的方法學(xué)考察試驗(yàn)。譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，建立主成分分析（principal components analysis， PCA）模型和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA）模型，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 不同產(chǎn)地多花黃精ATR-FTIR圖譜的峰形、峰位差異微小。運(yùn)用PCA和OPLS-DA可視化處理不同產(chǎn)地多花黃精的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)7種不同產(chǎn)地多花黃精代謝輪廓差異明顯，可對(duì)不同產(chǎn)地的多花黃精進(jìn)行輔助鑒別。結(jié)論? ATR-FTIR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，環(huán)保經(jīng)濟(jì)，可為多花黃精質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

〔關(guān)鍵詞〕 多花黃精；傅里葉變換衰減全反射紅外光譜；正交偏最小二乘判別分析；產(chǎn)地；質(zhì)量控制

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.015

Geographical distribution of the medicinal and edible plant Polygonatum cyrtonema Hua

based on ATR-FTIR

JIANG Furong JIANG Xingming HUANG Lianghui XIA Xinbin HE Xiong YUAN Zhiying

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Kelun Pharmaceutical Co.， Ltd， Yueyang， Hunan 414100， China; 3. Key Laboratory of TCM Heart and Lung Pattern Differentiation， Medicated Diet & Dietotherapy， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Hunan Center for Drug Evaluation & ADR Monitoring， Changsha， Hunan 410013， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the geographical distribution of the medicinal and edible plant Polygonatum cyrtonema Hua based on attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy （ATR-FTIR）. Methods The infrared spectrum data of Polygonatum cyrtonema Hua powder samples from different places of origin were collected by ATR-FTIR technology. Moreover， the corresponding functional groups were analyzed by the wave number of the infrared spectrum， and the methodological investigation test of the precision， repeatability and stability was carried out. After preprocessing the spectral data， the orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） model and the principal component analysis （PCA） model were established for multivariate statistical data analysis. Results The peak shape and position of the ATR-FTIR spectra of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin were slightly different. The PCA and OPLS-DA were adopted to visualize the data of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin. It was found that the metabolic profiles of Polygonatum cyrtonema Hua from 7 different places of origin were significantly different， which could assist in the identification of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin. Conclusion ATR-FTIR technology is simple to operate， environmental friendly and economic， which can provide technical reference for the quality control of Polygonatum cyrtonema Hua.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Polygonatum cyrtonema Hua; attenuated total reflection-flourier transformed infrared spectroscopy; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; places of origin; quality control

黃精為我國(guó)傳統(tǒng)藥食同源植物，性味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效，《中華人民共和國(guó)藥典》2020版中收載的黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[1]。我國(guó)黃精資源豐富，其中多花黃精主要分布在湖南、湖北、陜西以及江西等地[2]。黃精含有多糖、酚類成分、氨基酸和礦質(zhì)元素，具有抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)免疫的功效，是多種功能性食品的主要原料[3-7]。藥食同源用藥材產(chǎn)地講究道地，不同地區(qū)所產(chǎn)多花黃精的有效成分會(huì)有一定差異，目前市場(chǎng)中以次充好的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。當(dāng)前，鑒別黃精真?zhèn)蔚闹髁鞣椒ǘ嗖捎眯誀?、薄層色譜法、顯微觀察等鑒別方法，但這些方法囿于樣本形態(tài)、鑒別人員等因素，難以識(shí)別產(chǎn)地來(lái)源。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，采用分子鑒定技術(shù)也可以對(duì)藥用植物進(jìn)行鑒別，而且鑒別結(jié)果更加準(zhǔn)確，但目前此方法鑒別成本較高，其操作也相對(duì)復(fù)雜[8]。傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（attenuated

total reflection-fourier transform infrared spectroscopy， ATR-FTIR），由于其具有無(wú)損、快速、簡(jiǎn)便、成本低、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[9]，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于生藥學(xué)、食品、生物、環(huán)境、塑料、紡織、農(nóng)業(yè)等多領(lǐng)域的分析與檢測(cè)[10-12]。在藥食同源領(lǐng)域，姚沖等人利用 ATR-FTIR對(duì)不同產(chǎn)地西紅花進(jìn)行判別；李秀麗等基于ATR-FTIR和1H NMR發(fā)現(xiàn)高溫可改變牡丹籽油脂肪酸、酸值等品質(zhì)指標(biāo)[13-14]。

主成分分析（principal component analysis， PCA）根據(jù)主成分的得分，可以描繪n個(gè)樣本在二維或三維圖上的分布情況，由此可以直觀的對(duì)樣本進(jìn)行分類處理。正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial latent squares-discriminant analysis， OPLS-DA）是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，可以去除自變量X中與分類變量Y無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使得模型變得簡(jiǎn)單和易于解釋，該方法在代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域已廣泛使用[15]。

本文采用ATR-FTIR 技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)多元統(tǒng)計(jì)分析策略開(kāi)展了7個(gè)不同產(chǎn)地共70批次多花黃精樣本中的代謝輪廓差異研究，可對(duì)不同產(chǎn)地的多花黃精進(jìn)行輔助鑒別。ATR-FTIR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，環(huán)保經(jīng)濟(jì)，作為食品藥品領(lǐng)域分析研究的技術(shù)平臺(tái)，可為藥食同源大品種-多花黃精質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 儀器與材料

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W100）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，Nicolet iS5）。

試驗(yàn)選用7個(gè)不同產(chǎn)地黃精，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖。每個(gè)產(chǎn)地10 批次樣本，共70批次樣本作為本試驗(yàn)研究對(duì)象，具體信息見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 圖譜數(shù)據(jù)采集

將干燥的多花黃精樣品粉碎，過(guò) 200 目篩得到極細(xì)粉。取樣品粉末約0.05 g均勻平鋪在ATR附件上，調(diào)節(jié)壓力塔，使樣品粉末與ATR附件緊密接觸。設(shè)置紅外采集條件：分辨率4 cm^-1，光譜掃描波數(shù)范圍600～5500 cm^-1，空白背景光譜掃描32次，自動(dòng)扣除大氣背景CO₂、H₂O的影響，樣本掃描16次。所得圖譜均經(jīng)過(guò)OMNIC-9.2軟件中的“自動(dòng)基線校正”和“透過(guò)率%”轉(zhuǎn)換處理。

2.2? 方法學(xué)考察

按“2.1”方法采集譜圖，OMNIC自動(dòng)標(biāo)峰6個(gè)吸收強(qiáng)度最大的特征峰波數(shù)，如樣本Anhui 02（見(jiàn)圖1），特征峰波數(shù)分別是3339.33、2939.87、1623.71、1 415.58、1032.51、932.10 cm^-1，以此6個(gè)特征峰波數(shù)分別計(jì)算RSD值，并考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性。

2.3? 多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析

將ATR-FTIR導(dǎo)出的數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入 SIMCA-14.1軟件（瑞典Umetrics公司），進(jìn)行PCA和OPLS-DA多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1? 方法學(xué)考察

3.1.1? 精密度? 取樣本Anhui 01連續(xù)測(cè)定6次，得紅外光譜圖，標(biāo)峰，記錄6個(gè)特征峰波數(shù)，計(jì)算對(duì)應(yīng)的RSD值，結(jié)果分別是0.24%、0.03%、0.03%、0.01%、0.03%、0.04%，表明本實(shí)驗(yàn)所用光譜儀的儀器精密度良好。

3.1.2? 重復(fù)性? 取樣本Anhui 01分為6份，平行測(cè)定6次，得紅外光譜圖，標(biāo)峰，記錄6個(gè)特征峰波數(shù)，計(jì)算對(duì)應(yīng)的RSD值，結(jié)果分別是0.24%、0.06%、0.02%、0.02%、0.13%、0.09%，表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.1.3? 穩(wěn)定性? 取樣本Anhui 01分別在0、1、2、4、6 h進(jìn)行測(cè)定，得紅外光譜圖，標(biāo)峰，記錄6個(gè)特征峰波數(shù)，計(jì)算對(duì)應(yīng)的RSD值，結(jié)果分別是0.14%、0.09%、0.19%、0.02%、0.12%、0.06%，表明該樣本在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2? 譜圖分析

通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料對(duì)多花黃精主要特征峰波數(shù)進(jìn)行歸屬，并推斷其可能的貢獻(xiàn)物。特征峰波數(shù)3339 cm^-1主要?dú)w屬為N-H伸縮振動(dòng)、-OH伸縮振動(dòng)，可能貢獻(xiàn)物為蛋白質(zhì)、生物堿類[16-17]；2939 cm^-1主要?dú)w屬為飽和C-H伸縮振動(dòng)，可能貢獻(xiàn)物為脂肪酸化合物[18]；1623 cm^-1主要?dú)w屬為C=C伸縮振動(dòng)，可能貢獻(xiàn)物為烯類化合物[19]；1415 cm-1主要?dú)w屬為-OH彎曲振動(dòng)，可能貢獻(xiàn)物為多糖類化合物[16-17]；900～1200 cm^-1主要?dú)w屬為C-O、C-OH伸縮振動(dòng)，可能貢獻(xiàn)物為單糖類、多糖類化合物[16-17]。

由此推斷多花黃精紅外光譜圖主要由多糖類、蛋白質(zhì)類、生物堿類、脂類等吸收帶組成。將70批次多花黃精紅外光譜圖疊加（見(jiàn)圖1），由圖1可看出，不同批次樣本總體上峰形相似，峰位基本相同，但仍然具有細(xì)微差別，為此需要建立PCA、OPLS-DA模型來(lái)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

3.3? 多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3.3.1? PCA? 將ATR-FTIR導(dǎo)出的數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入 SIMCA-14.1軟件，設(shè)置model-type為PCA-X，Autofit進(jìn)行擬合，點(diǎn)擊scores得到主成分分析得分圖（見(jiàn)圖2A），將數(shù)據(jù)可視化后能觀察到7個(gè)不同產(chǎn)地多花黃精能夠很好的分類。設(shè)置Hotelling's T2，篩選極少數(shù)離群樣本，通過(guò)SIMCA軟件中離群（Outlier）圖（見(jiàn)圖2B）分析可知，樣本Anhui 03、Guangxi 01為離群樣本，去除離群值后，再重新擬合。離群樣本出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因有很多，藥用植物的品質(zhì)受產(chǎn)地環(huán)境、產(chǎn)地初加工、種養(yǎng)條件、藥材年齡差異等多種因素的影響[20]。

將離群樣本合理去除后，提取了3個(gè)主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.27%。其中第一主成分PC1貢獻(xiàn)率為76.76%，第二主成分PC2貢獻(xiàn)率為11.17%，第三主成分PC3貢獻(xiàn)率為6.34%，模型中R²X（累計(jì)解釋參數(shù)能力）值為0.943，Q²（預(yù)測(cè)能力參數(shù)）值為0.938，均高于0.5，說(shuō)明該模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性良好，能較為全面的反映樣品間的差異。從圖2中能清晰看到同一產(chǎn)地更趨向于聚在一起，不同產(chǎn)地會(huì)有所區(qū)分。其中懷化、新化、新邵這3個(gè)產(chǎn)地都是在湖南省內(nèi)，地理位置相對(duì)較近。雖然這3個(gè)產(chǎn)地兩兩之間也能明顯區(qū)分，但從圖中整體來(lái)看，這3個(gè)產(chǎn)地的多花黃精有一定的靠近的趨勢(shì)，一定程度上說(shuō)明產(chǎn)地相近的多花黃精，其成分差異可能更小。

3.3.2? OPLS-DA? OPLS-DA二維得分圖在兩兩分析中具有更好的區(qū)分性，因此對(duì)樣本類型兩兩一組，設(shè)置model-type為OPLS-DA，進(jìn)行模型擬合（部分樣本見(jiàn)圖2C—F）。OPLS-DA能夠進(jìn)一步對(duì)2個(gè)不同產(chǎn)地樣本間進(jìn)行判別分析，提取出3個(gè)主成分，模型中質(zhì)量參數(shù)R²X_cum（反映X矩陣的解釋率）、R²Y_cum（反映模型的穩(wěn)定性）和Q²_cum（反應(yīng)模型的預(yù)測(cè)性）三者值分別為0.980、0.921和0.840，均大于0.5，表明所建立的模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性均良好。利用OPLS-DA圖能夠更加直觀準(zhǔn)確的區(qū)分兩個(gè)不同產(chǎn)地的多花黃精。

最后檢驗(yàn)OPLS-DA有無(wú)過(guò)擬合，對(duì)Y矩陣變量進(jìn)行隨機(jī)分組200次的置換檢驗(yàn)（見(jiàn)圖3）。模型驗(yàn)證結(jié)果顯示置換參數(shù)擬合截距（R²intercepts）為0.265（應(yīng)小于0.4），預(yù)測(cè)截距（Q²intercepts）為-0.674（應(yīng)小于0），表明所建的模型具有較高的可靠性，不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象。

4 結(jié)論

多花黃精作為我國(guó)一種傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥材，且能藥食兩用，在各大中藥材及食品原材料市場(chǎng)十分常見(jiàn)。湖南新化、懷化等湘中地區(qū)和安徽九華地區(qū)等地生產(chǎn)的黃精品質(zhì)優(yōu)良，如新化黃精獲得中國(guó)地理標(biāo)志證明商標(biāo)，黔陽(yáng)黃精、安化黃精和九華黃精分別獲得國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志。黃精的產(chǎn)地主要依賴外觀性狀和經(jīng)驗(yàn)來(lái)鑒定，但是打粉后的黃精藥材產(chǎn)地難以識(shí)別。目前，隨著中藥代謝組學(xué)研究的興起，基于高通量數(shù)據(jù)研究可以輔助對(duì)中藥的道地性進(jìn)行評(píng)價(jià)，而國(guó)內(nèi)外中藥代謝組學(xué)研究主要采用LC/MS、GC/MS、1H-NMR、GC/IMS、ATR-FTIR等技術(shù)[21-22]，在這些技術(shù)平臺(tái)中，ATR-FTIR技術(shù)具有儀器價(jià)格相對(duì)低廉、操作簡(jiǎn)便、無(wú)損檢測(cè)、原位測(cè)試等優(yōu)點(diǎn)。周曄等[23]利用傅里葉紅外光譜法對(duì)部分黃精屬生藥進(jìn)行鑒別，研究過(guò)程中確定了共有峰和變異峰，通過(guò)共有峰率和變異峰率的高低對(duì)不同種屬黃精的親緣關(guān)系和成分差異做關(guān)聯(lián)性研究，并用來(lái)判斷藥食兩用植物的親緣關(guān)系，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用ATR-FTIR 技術(shù)對(duì)70批次不同產(chǎn)地多花黃精紅外光譜圖分析發(fā)現(xiàn)，多花黃精光譜可能主要由多糖類、蛋白質(zhì)類、生物堿類、脂類等物質(zhì)吸收帶等組成。樣本間圖譜大致相同，但仍然存在細(xì)微差異，通過(guò)SIMCA軟件的 PCA、OPLS-DA模型能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地的多花黃精進(jìn)行代謝輪廓差異分析，證實(shí)了不同產(chǎn)地的多花黃精存在著差異，而產(chǎn)地相近的多花黃精，其差異可能會(huì)更小，此種差異可能是由多花黃精中化合物的種類或含量引起的，這也為藥食兩用中藥的“道地性”提供了一定的理論依據(jù)。而樣本中出現(xiàn)的離群樣本，其原因可能是多樣的：如個(gè)別多花黃精的質(zhì)量問(wèn)題或者多花黃精的產(chǎn)地加工等多種因素有關(guān)，今后還需要進(jìn)一步探究。綜上，ATR-FTIR 技術(shù)以其綠色、便捷、不損耗樣本的特點(diǎn)，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，能夠更準(zhǔn)確、有效地將數(shù)據(jù)可視化，對(duì)藥食兩用類藥材粉末的鑒別和質(zhì)量控制具有十分重要的意義。

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