氣相色譜法同時(shí)測(cè)定白酒中丁酸等7種酸酯成分的含量

張國(guó)宇，向麗萍，侯睿，張琴，梁光月，張季

（1.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州遵義 563099；2.國(guó)家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，貴州遵義 563099）

白酒是一種傳統(tǒng)的中國(guó)蒸餾酒，由高粱或其他谷物制成，距今已有2000 多年的歷史[1]。20 世紀(jì)80年代，由于釀造工藝的區(qū)別，醬香型、清香型、濃香型、米香型成為白酒的四大基本類型，芝麻香型、馥郁香型等其他香型在此基礎(chǔ)上衍生而成，不同類型的白酒中關(guān)鍵呈香呈味物質(zhì)不盡相同[2]。

作為評(píng)價(jià)濃香型白酒品質(zhì)好壞的關(guān)鍵化合物——己酸，它既是己酸乙酯（濃香型白酒的主體香味物質(zhì)）的重要前體物質(zhì)，也與己酸乙酯的含量呈正比[3]。最新的白酒產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求 第1 部分：濃香型白酒》[4]的附錄B中規(guī)定了己酸的測(cè)定方法。白樂(lè)宜等[5]以液液萃取作為前處理，結(jié)合GC-MS 分析了4種芝麻香白酒，定量結(jié)果表明乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯含量均較高。GB/T 10781.9—2021《白酒質(zhì)量要求 第9部分：芝麻香型白酒》中附錄B 規(guī)定了乙酸測(cè)定方法[6]。喬翠紅[7]采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜結(jié)合直接進(jìn)樣法，對(duì)兼香型白酒的風(fēng)味成分進(jìn)行了測(cè)定分析，氣味活度值及香氣強(qiáng)度值的分析表明，乙酸、丁酸、己酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯為兼香型白酒的主體香氣成分。李其書[8]對(duì)貯存三年半的董香型白酒使用氣相色譜儀測(cè)定酒體中總酯中的乙酯時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯整體趨勢(shì)升高8.6%左右，己酸乙酯整體趨勢(shì)升高24.8%左右，丁酸乙酯整體趨勢(shì)升高100 %左右，乳酸乙酯整體趨勢(shì)升高22.5 %左右，再結(jié)合T/GZSX 066—2020《董香型白酒》[9]附錄中規(guī)定的丁酸檢測(cè)方法，說(shuō)明丁酸和丁酸乙酯是其主體香味物質(zhì)。

綜上所述，在不同香型白酒中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸和己酸共7種酸酯是主要的主體香味物質(zhì)。然而，目前尚無(wú)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測(cè)定白酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸和己酸的含量，本研究在T/GZSX 066—2020《董香型白酒》附錄中丁酸檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，參考GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求第1 部分：濃香型白酒》附錄中己酸的含量測(cè)定、GB/T 10781.9—2021《白酒質(zhì)量要求 第9部分：芝麻香型白酒》附錄B 中乙酸測(cè)定方法等標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，確定了本方法的基本框架，包括內(nèi)標(biāo)物、檢出限、定量限、重復(fù)性和回收率等內(nèi)容。

通過(guò)對(duì)氣相色譜儀的儀器條件進(jìn)行充分優(yōu)化，進(jìn)行方法學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，建立了白酒中丁酸等7種酸酯含量同時(shí)檢測(cè)的氣相色譜儀測(cè)定方法。本方法采用直接進(jìn)樣法，不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。氣相色譜法以試樣峰的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法的建立為快速、準(zhǔn)確測(cè)定白酒中7種主要酸酯成分及白酒的質(zhì)量控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售某品牌白酒。

試劑及耗材：乙醇，天津科密歐公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水；乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2-乙基丁酸、醋酸戊酯內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Bepure 公司；正己烷（分析純）、無(wú)水硫酸鈉（分析純），科密歐公司；微孔濾頭孔徑0.22 μ m，安譜公司。乙醇-水溶液（60+40,體積比）：量取120 mL 乙醇加入80 mL 超純水中，充分混勻。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀（GC,8890），美國(guó)安捷倫公司；Milli-Q Reference 超純水發(fā)生器，美國(guó)Milli‐pore 公司；ALC-210.4 型電子天平，德國(guó)Sartorius 公司。分析天平：感量0.1 mg 和0.01 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別取0.10 g 標(biāo)準(zhǔn)品乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸于10 mL的容量瓶中，用60 %的乙醇水溶液定容至刻度線，混勻，得濃度為10.00 g/L 乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：取該混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL 和0.10 g 標(biāo)準(zhǔn)品乙酸于10 mL 的容量瓶中，用60 %的乙醇水溶液定容至刻度線，混勻，得濃度為5.00 g/L乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸和10.00 g/L 的乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取上述標(biāo)準(zhǔn)中間液0.2 mL于10 mL容量瓶中，用60 %的乙醇水溶液定容至刻度，混勻。配制成乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸濃度為0.1 g/L 和乙酸濃度為0.2 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取標(biāo)準(zhǔn)品醋酸戊酯2.287 g 和標(biāo)準(zhǔn)品2-乙基丁酸1.893 g 于100 mL 的容量瓶中，用60 %的乙醇水溶液定容至刻度線，混勻，得濃度為22.87 g/L 醋酸戊酯和18.93 g/L 2-乙基丁酸混合內(nèi)標(biāo)溶液。

標(biāo)液工作曲線：分別取乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸濃度為0.1 g/L 和乙酸濃度為0.2 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL、5.0 mL，再取乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸濃度為5.0 g/L 和乙酸濃度為10.0 g/L 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.2 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.1 mL 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用60 %的乙醇水溶液定容至刻度，混勻，配制成乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸濃度均為0.01 g/L、0.05 g/L、0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L、1.50 g/L，乙酸濃度為0.02 g/L、0.10 g/L、0.20 g/L、1.00 g/L、2.00 g/L、3.00 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

吸取樣品5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.10 mL，用樣品溶液定容至10 mL，混勻后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 儀器參數(shù)與測(cè)定

色譜柱：中科ZKAT-LZP 9301 毛細(xì)管色譜柱（30 m × 320 μ m，0.25 μ m）或其他具有同等分析效果的毛細(xì)管柱，進(jìn)樣量：1 μ L，載氣：高純氮，純度≥99.999 %，1.0 mL/min，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：約15∶1，尾吹約25 mL/min，空氣流量：300 mL/min，氫氣流量：30 mL/min，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，檢測(cè)器溫度：250 ℃，程序升溫：45 ℃（7 min）（12 ℃/min）→190 ℃（5 min）（15 ℃/min）→210 ℃（3 min），檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

根據(jù)7種酸酯的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)（沸點(diǎn)、結(jié)構(gòu)式等）以及極性特點(diǎn)確定所需色譜柱（依據(jù)相似相容原理）。根據(jù)各酸酯中最高物質(zhì)的沸點(diǎn)確定進(jìn)樣口溫度，保證所有樣品中目標(biāo)物均能汽化，注意確保樣品檢測(cè)時(shí)不因高溫遭到破壞，所以進(jìn)樣口溫度選擇為250 ℃，對(duì)于進(jìn)樣量考慮到液體汽化后體積膨脹，襯管體積有限所以選擇進(jìn)樣1 μ L。進(jìn)樣量太多會(huì)導(dǎo)致襯管過(guò)載樣品不能瞬間完全汽化進(jìn)入色譜柱，導(dǎo)致峰拖尾和峰擴(kuò)展嚴(yán)重。載氣流速過(guò)大會(huì)影響色譜分離度，致使7種物質(zhì)不能完全分開，對(duì)于化合物的定性和定量有所干擾。

程序升溫能夠提高色譜分離度，初始溫度選擇最低沸點(diǎn)樣品溫度，終溫大于最高組分沸點(diǎn)，但是要低于色譜柱最高耐受溫度。流速大小決定分離度效果及峰型。起初程序升溫只設(shè)置一階二階程序，后期升溫速率太快會(huì)導(dǎo)致基線漂移嚴(yán)重，所以在這個(gè)基礎(chǔ)上再增加了一階程序升溫。檢測(cè)器溫度保證樣品不冷凝，最終溫度高于最終柱溫30～50 ℃，確定為250 ℃。綜上所述主要從以下3 個(gè)方面優(yōu)化檢測(cè)方法：（一）調(diào)節(jié)程序升溫，如改變初始溫度、升溫速率達(dá)到分離效果；（二）調(diào)節(jié)流速，速率小可以提高分離度；（三）不改變上述兩個(gè)條件的情況下，選擇合適的色譜柱，采用白酒專用色譜柱。

圖1 溶劑空白色譜圖

圖2 7種酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和2種內(nèi)標(biāo)溶液色譜圖(1.5 g/L)

圖3 7種酸酯目標(biāo)物添加回收色譜圖

2.2 檢出限和定量限

在相同的色譜條件下，配制0.5 g/L 的7種酸酯樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，得到酒樣的氣相色譜圖和各色譜峰的峰面積，計(jì)算所有特征峰的信噪比，得到7種酸酯的檢出限和定量限，見表1。

表1 7種酸酯的檢出限和定量限試驗(yàn)數(shù)據(jù) (g/L)

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

在相同的色譜條件下，配制0.5 g/L 的7種酸酯樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，得到酒樣的氣相色譜圖和各色譜峰的峰面積，計(jì)算所有特征峰相對(duì)峰面積的RSD(%)，見表2。

表2 7種酸酯的重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

空白試劑為55%食用酒精。添加樣品，取試劑空白試樣5 mL，添加5.00 g/L 乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸和10.00 g/L 的乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.020 mL、0.06 mL 和0.20 mL，得添加濃度含量乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸、己酸為0.01 g/L、0.03 g/L 和0.10 g/L 的試樣，乙酸為0.02 g/L、0.06 g/L 和0.20 g/L 的試樣，與待測(cè)試樣同步處理?；厥章蕦?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3。

表3 7種酸酯的添加濃度及其平均回收率的試驗(yàn)數(shù)據(jù) (%)

3 討論

本研究基于氣相色譜法建立了白酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸和己酸的測(cè)定方法，該方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，只需加入內(nèi)標(biāo)溶液和樣品溶液定容后上機(jī)檢測(cè)，乙酸在0.01～3.0 g/L 濃度條件下線性系數(shù)r2＞0.99，其余6種酸酯在0.01～1.5 g/L 濃度條件下線性系數(shù)r2＞0.99；乙酸和其余6種酸酯檢出限分別為0.006 g/L和0.003 g/L，定量限分別為0.020 g/L 和0.010 g/L；乙酸在0.02 g/L、0.06 g/L 和0.20 g/L 添加濃度水平上的回收率為98.67%～100.39%，其余6種酸酯在0.01 g/L、0.03 g/L 和0.10 g/L 添加濃度水平上的回收率為97.07 %～104.28 %。本方法前處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性好且分析時(shí)間短，能提高檢測(cè)效率并且結(jié)果準(zhǔn)確度高，為醬香型白酒中丁酸等7種酸酯的檢測(cè)提供了技術(shù)參考。