應(yīng)用酶制劑進(jìn)行木薯發(fā)酵乙醇的工藝優(yōu)化研究

尚紅巖，程燕琳，2，劉俊敏，2，江雪晶，鄧毛程*，陳秀麗，吳曼亞，曾艷

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303；3.廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所，廣東廣州 510316)

木薯作為一種非糧經(jīng)濟(jì)作物，種植面積廣，是全球發(fā)酵酒精使用最廣原料之一,以木薯生產(chǎn)燃料乙醇將迎來巨大的發(fā)展機(jī)遇[1]。美國到2022 年，可再生能源的比例將達(dá)到新高峰，例如生物乙醇1.363×1011升。2015 年，歐盟推行的生物乙醇計劃占到了5 %的市場份額，2020 年進(jìn)一步增加到10 %[2]。我國2020 年要在全國范圍內(nèi)推廣使用車用乙醇汽油，基本實(shí)現(xiàn)全覆蓋，因此燃料乙醇的生產(chǎn)狀況對車用乙醇汽油的推廣具有十分重要的意義[3]。

木薯淀粉含量高，木薯原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，包括蒸煮糊化、液化、糖化和發(fā)酵等階段，需要淀粉酶和糖化酶的酶解，這是目前常用雙酶法工藝。木薯中除了含有淀粉還含果膠質(zhì)等大分子物質(zhì)，果膠是一種多糖，加水后以不穩(wěn)定的膠體狀態(tài)存在于醪液中，使醪液粘性增加，還會附著在活性材料的表面，阻止酶類與淀粉原料接觸，降低原料糖化發(fā)酵的效率。發(fā)酵前加入果膠酶，將果膠水解為小分子糖，有利于提高酶解和發(fā)酵率[4]。酶制劑應(yīng)用能夠優(yōu)化乙醇的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率。乙醇的工藝優(yōu)化也將帶動酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用[5]。本研究以木薯粉為原料，通過單因素實(shí)驗和正交實(shí)驗對液化工藝進(jìn)行優(yōu)化；通過添加果膠酶，研究對木薯糖化和發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

木薯粉，市售；耐高溫α-淀粉酶20000 U/g，糖化酶150000 U/g，果膠酶100000 U/g，廣州瑟燁生物科技有限公司；釀酒活性干酵母，廣西丹寶利酵母有限公司。

試劑及耗材：碘液、濃硫酸、酚酞、氫氧化鈉、尿素等均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

儀器設(shè)備：UV-520 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；PHS-3 精密酸度計，上海大普儀器有限公司；FA224 電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋，鄭州長城可供貿(mào)有限公司；98-1-C 數(shù)顯控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；YX-280 型手提壓力蒸汽滅菌鍋，廣州越特科學(xué)儀器有限公司；101-3AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科學(xué)儀器有限公司；酒精濃度計，河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 木薯發(fā)酵酒精工藝流程（圖1）

圖1 木薯發(fā)酵酒精工藝

1.2.2 木薯液化工藝單因素條件研究

(1)調(diào)漿：稱取木薯粉加水調(diào)漿，為考察料液比對發(fā)酵酒精的影響，分別選擇1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的料液比，加入耐高溫ɑ-淀粉酶50 U/g，設(shè)置液化溫度105 ℃，液化時間60 min，研究不同料液比對木薯粉液化效果和發(fā)酵的影響。

(2)液化：將木薯粉按1∶2.5 的料液比例加水調(diào)漿，pH 調(diào)至6.0～6.5，加入耐高溫ɑ-淀粉酶50 U/g，攪拌搖勻，研究不同液化溫度（95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃）和液化時間（45 min、60 min、75 min、90 min）對木薯液化效果和發(fā)酵酒精濃度的影響，液化結(jié)束后加入碘液，如無顯色反應(yīng)即液化完成，記錄碘液檢驗的顏色。

(3)糖化：液化結(jié)束，液化液冷卻至60 ℃后補(bǔ)水至原體積，加入10 %硫酸將pH 調(diào)至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，放置到58～62 ℃水浴鍋中糖化60 min。糖化結(jié)束后降溫至32 ℃。

(4)發(fā)酵：稱取0.8%活性干酵母（糖化液重量），加到10 倍的32 ℃無菌水中，攪拌溶解，復(fù)水活化10 min，加入糖化液中，31～33 ℃恒溫發(fā)酵72 h。

(5)發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液殘還原糖含量；對發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，測定蒸餾酒液的酒精濃度。

1.2.3 木薯液化工藝正交實(shí)驗優(yōu)化

為了進(jìn)一步優(yōu)化木薯淀粉液化工藝條件，在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交實(shí)驗。選擇液化料液比、液化溫度和液化時間三個因素作正交試驗，試驗因素和水平見表1。以發(fā)酵成熟醪液殘還原糖和酒精含量做評價指標(biāo)。

表1 正交實(shí)驗因素水平表

1.2.4 果膠酶對木薯淀粉糖化和發(fā)酵的影響

果膠是以半乳糖醛酸為主的復(fù)合多糖類物質(zhì)，加水拌料后以膠體形式存在于醪液中，使醪液粘度增大，在果膠酶作用下果膠會水解生成低分子量的半乳糖醛酸，降低醪液黏度。按步驟1.2.2 優(yōu)化后液化工藝液化木薯淀粉，液化結(jié)束后冷卻至60 ℃后補(bǔ)水至原體積，加入10 %硫酸將pH 調(diào)至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，分別添加果膠酶50 U/g、75 U/g、100 U/g、125 U/g，混勻后在58～62 ℃水浴鍋中糖化60 min，然后降溫至32 ℃，接種0.8 %活性干酵母，恒溫發(fā)酵時間為72 h。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液殘還原糖，對發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，測定蒸餾酒液的酒精濃度。

1.2.5 檢測方法

木薯粉液化液結(jié)果檢驗[6]：碘液檢驗，淀粉的存在與否可以用碘液檢查，淀粉具有在碘液中變藍(lán)的特性。

酒精度的測定：蒸餾-酒度計法，量筒量取100 mL發(fā)酵液，放入蒸餾燒瓶內(nèi)，用100 mL 蒸餾水沖洗量筒，放入蒸餾燒瓶內(nèi)，蒸餾并收集餾出液100 mL，用酒度計測定餾出液酒精濃度。

外觀糖度的測定：糖錘度計法。

總糖、還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS 法)[7]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗重復(fù)3 次，實(shí)驗結(jié)果取平均值，用Ex‐cel 軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和繪圖，SPSS 19.0 進(jìn)行正交實(shí)驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同料液比對液化條件的影響

木薯粉生產(chǎn)酒精需要加水調(diào)漿，料液比（加水量）是非常重要的參數(shù)，加水量過多，會使最終發(fā)酵酒精含量低，增加酒精蒸餾能耗；加水量過少，會使醪液黏度大，影響醪液的混合、輸送、加熱和冷卻等，進(jìn)一步影響液化和發(fā)酵效果。木薯粉以不同料液比配料后液化和發(fā)酵的實(shí)驗結(jié)果見表2。

表2 不同料液比對液化條件的影響

由表2 可知，隨著料液比的變化，發(fā)酵醪液酒精濃度呈現(xiàn)上升的趨勢，殘還原糖含量相應(yīng)降低，當(dāng)料液比1∶2.5 時，酒精濃度最高達(dá)到12.13 %vol，殘還原糖的含量最低；料液比1∶3.0 時，酒精濃度降低，殘還原糖含量增高；當(dāng)料液比1∶3.5 達(dá)到酒精濃度最低值。綜合分析表明，料液比在1∶2.5 時，酒精發(fā)酵效果最佳。

2.2 不同液化溫度對發(fā)酵酒精的影響

溫度是液化過程中最重要的因素之一，不僅影響反應(yīng)速度，也影響ɑ-淀粉酶的活性。提高溫度可以提高反應(yīng)速度，加速酶的反應(yīng)效率，提高溫度和降低反應(yīng)速度會導(dǎo)致酶蛋白逐漸變性，導(dǎo)致酶的反應(yīng)效率降低甚至失活。本實(shí)驗使用的耐高溫ɑ-淀粉酶，宜在95 ℃以上液化，為此考察了95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃4 個溫度對液化的影響，所得結(jié)果如表3 所示。耐高溫α-淀粉酶在液化溫度較低時液化淀粉的能力相對于高溫時液化能力弱，酒精發(fā)酵酒精濃度隨著溫度的升高而升高，液化溫度105 ℃左右液化效果較好，發(fā)酵酒精濃度可達(dá)12.29 %vol，液化溫度110 ℃和105 ℃時發(fā)酵酒精濃度相近，出于節(jié)能考慮，選擇相對最優(yōu)液化溫度為105 ℃。

表3 不同液化溫度對發(fā)酵酒精的影響

2.3 不同液化時間對發(fā)酵酒精的影響

為了研究液化時間對發(fā)酵酒精的影響，液化時間分別設(shè)定為45 min、60 min、75 min、90 min，液化后進(jìn)行碘檢試驗，用碘檢試驗后的顏色和酒精濃度評價液化的完成情況，結(jié)果見表4。

表4 不同液化時間對發(fā)酵酒精的影響

表5 液化實(shí)驗正交實(shí)驗L9(33)結(jié)果

由表4 可以看出，液化時間在60 min 時，酒精濃度最高，發(fā)酵效率最好；液化時間在45 min 時，碘檢結(jié)果不達(dá)標(biāo)，液化不完全；當(dāng)液化時間由60 min延長至75 min 后，酒精濃度下降。原料液化時間不充分會形成生料，導(dǎo)致整個發(fā)酵過程中染菌；如果液化時間過長同樣會影響發(fā)酵效果，影響出酒率。實(shí)驗結(jié)果表明，液化時間以60 min 為最佳，所以，確定最佳的液化時間為60 min。

2.4 木薯粉發(fā)酵酒精液化正交實(shí)驗影響

木薯液化三因素三水平正交試驗L9(3)3結(jié)果見表5。由實(shí)驗結(jié)果可知，按照極差R 大小確定的因子影響主次順序為：料液比＞液化溫度＞液化時間，以酒精濃度為主要評價指標(biāo)，最好的工藝參數(shù)配合水平為A2B2C1，即料液比1∶2.5，液化溫度為105 ℃，液化時間為60 min。用最優(yōu)因素組合A2B2C1進(jìn)行驗證試驗，發(fā)酵液酒精度達(dá)到12.58 %vol，殘還原糖為0.33 %。高于正交表中最高酒精濃度12.49 %vol，液化和發(fā)酵效果相對最好。

2.5 果膠酶對木薯發(fā)酵酒精的影響

2.5.1 果膠酶的添加方法

果膠是以半乳糖醛酸為主的復(fù)合多糖類物質(zhì)，果膠酶通過水解作用切斷果膠分子的α-1,4糖苷鍵，將果膠降解釋放還原性末端，使果膠黏度降低[8]，可有效降低發(fā)酵醪液黏度，增加可發(fā)酵糖的含量。

2.5.2 果膠酶不同添加量對木薯發(fā)酵酒精的影響

添加不同濃度果膠酶對酒精發(fā)酵的酒精濃度影響，如圖2 所示。

圖2 果膠酶對酒精發(fā)酵的酒精濃度影響

從圖2 可知，在一定范圍內(nèi)發(fā)酵酒精中的酒精濃度隨著果膠酶用量的增加而增大，用量從0到75 U/g，酒精濃度有明顯變化，說明在此范圍內(nèi)，增加果膠酶用量，提高酒精濃度效果顯著，繼續(xù)增加果膠酶用量時，酒精濃度呈現(xiàn)下降趨勢，說明繼續(xù)增加果膠酶用量對提高發(fā)酵酒精的優(yōu)化工藝意義不大。從經(jīng)濟(jì)以及效果優(yōu)化考慮，75 U/g 果膠酶的添加量為較合適果膠酶用量。

添加果膠酶對酒精發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)的影響，如表6 所示。

表6 果膠酶對酒精發(fā)酵的相關(guān)指標(biāo)影響

從表6 可知，隨著果膠酶用量從0 到75 U/g，酒精發(fā)酵后殘還原糖含量有明顯變化，殘還原糖降低，有利于酒精發(fā)酵；繼續(xù)增加果膠酶用量，殘?zhí)呛吭龈撸f明繼續(xù)增加果膠酶用量優(yōu)化工藝意義不大，綜上相關(guān)指標(biāo)研究，選取75 U/g 果膠酶添加量進(jìn)行后期實(shí)驗。

3 結(jié)論

在木薯發(fā)酵酒精中，添加α-淀粉酶、糖化酶、果膠酶和優(yōu)化液化工藝能顯著提高發(fā)酵液酒精含量。本文研究了木薯淀粉料液比、液化溫度和液化時間對淀粉液化效果和酒精發(fā)酵的影響。通過單因素試驗和正交實(shí)驗優(yōu)化，以酒精濃度和殘?zhí)亲鳛樵u價指標(biāo)，確定木薯粉液化的最佳料液比1∶2.5，液化溫度105 ℃，液化時間60 min，相應(yīng)發(fā)酵酒精濃度為12.58 %vol，殘還原糖0.33 g/100 mL。在糖化過程中，考察了糖化酶和果膠酶對糖化發(fā)酵的影響，通過單因素實(shí)驗添加不同用量果膠酶考察了對木薯酒精發(fā)酵影響，以1∶2.5 的料液比進(jìn)行配料，優(yōu)化后的液化條件進(jìn)行液化，加入10 %硫酸將料液pH調(diào)至4.2～4.5，設(shè)置溫度58～62 ℃，加入200 U/g糖化酶、75 U/g 果膠酶，水浴鍋中糖化60 min，接種0.8 %干酵母發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪液還原糖含量最低為0.37 g/100 mL，酒精度最高達(dá)到14.40 %vol，遠(yuǎn)高于不加果膠酶的發(fā)酵酒精濃度，木薯發(fā)酵酒精添加適量的果膠酶，對糖化和發(fā)酵影響顯著，可明顯提高發(fā)酵酒精濃度。