貓爪草醇類提取物對小鼠骨髓來源巨噬細胞極化的影響

亓 凱,劉芊伊,劉利萍,蒙祖迪,衛(wèi)麟娜,高雪涵,宋 濤,羅軍敏

(遵義醫(yī)科大學 免疫學教研室,貴州 遵義 563099)

巨噬細胞是機體內重要的免疫細胞,在抗病原微生物、抗腫瘤、炎癥損傷中發(fā)揮重要的調節(jié)功能。近年來,巨噬細胞在感染免疫過程中所發(fā)揮的作用成為研究者關注的焦點。巨噬細胞在不同誘導刺激下可產生極化,從而表現(xiàn)出較強的表型和功能的可塑性與異質性。目前根據(jù)其狀態(tài)和功能的不同分為:經典活化型(M1)和替代活化型(M2)［1]。M1型巨噬細胞由IFN-γ、脂多糖等Th1型細胞因子誘導而來,分泌大量的炎癥因子,如IL-1、NO等;M2型巨噬細胞由IL-4、IL-13等Th2型細胞因子誘導活化,分泌抗炎因子,如IL-10、TGF-β等［2]。當機體受到感染或炎癥等理化因素刺激時,巨噬細胞多表現(xiàn)出 M1表型,釋放 TNF-α,IL-1β等因子來發(fā)揮固有免疫功能;因此,機體調控產生M2型巨噬細胞分泌大量的 IL-10和 TGF-β 等發(fā)揮免疫抑制功能,促進組織修復、血管生成和維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)［3-4]。巨噬細胞可根據(jù)其不同的表型來發(fā)揮相應的功能,針對巨噬細胞極化的調控策略可成為感染性疾病臨床治療新的切入點［5]。

貓爪草(ranunculi ternati radix, RTR)為毛莨科植物小毛莨的塊根,功能主治化痰散結,解毒消腫［6]。近年來研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抗結核以及調節(jié)機體免疫功能的藥理作用［7-9]。研究表明,貓爪草治療淺表淋巴結結核的效果較好,不良反應發(fā)生率較低［10]。楊牧之等［11]研究發(fā)現(xiàn)貓爪草提取物可以提高小鼠腹腔巨噬細胞的活性,從而影響機體的免疫效應。也有研究顯示貓爪草可提高巨噬細胞的吞噬功能從而加強免疫活性［12]。目前有關貓爪草的相關免疫作用機制尚未闡明,是否影響巨噬細胞極化尚不清楚。本實驗用貓爪草醇類提取物體外刺激小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM),檢測巨噬細胞極化相關標志物的表達,鑒定巨噬細胞的極化表型,為貓爪草進一步的臨床應用奠定實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 RTR醇類提取物購于小草植物科技有限責任公司,原產地廣西,批號:XC20151205,規(guī)格:10∶1。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠,6～8周,雌性,購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.3 實驗所用試劑 DMEM培養(yǎng)基和FBS購于Gibco公司;小鼠重組GM-CSF購于Peprotech公司;CCK-8試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司;RNA逆轉錄、qPCR試劑盒購于TaKaRa公司;PCR引物合成由生工生物工程公司完成;IL-10、iNOS、TGF-β和TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience 公司。

1.4 獲取BMDM 6～8周大的BABL/C小鼠,取股骨及脛骨骨髓細胞,用DMEM完全培養(yǎng)基(含有20 ng/mL GM-CSF),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d,收集貼壁細胞,流式細胞術檢測巨噬細胞標志物F4/80和CD11b表達情況鑒定體外培養(yǎng)巨噬細胞的純度。

1.5 CCK8檢測BMDM活性 收集培育7 d的BMDM,密度為每孔3×104個鋪于96孔板中,孵育箱培養(yǎng)24 h使其貼壁,將10、50、100、150、200、500 μg/mL不同濃度RTR誘導BMDM 24 h,并設空白對照孔,每組3個復孔。CCK8檢測BMDM的活性。

1.6 qRT-PCR檢測BMDM細胞因子的轉錄水平 收集BMDM,TRIzol法提取總RNA,按照TaKaRa說明書所述,以總RNA為模板,將mRNA反轉錄為cDNA,反應條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA為模板構建qRT-PCR反應體系,95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,40個循環(huán),引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 ELISA檢測BMDM細胞因子的分泌水平 收集細胞的培養(yǎng)上清,用ELISA檢測TNF-α、IL-10、TGF-β細胞因子的分泌。按照試劑盒說明書加樣,置于37 ℃溫育60 min,加入稀釋30倍的洗滌液洗板5次,加顯色劑A、B,37 ℃避光顯色5～15 min后加入終止液,終止反應。450 nm波長檢測吸光度(OD)值并檢測細胞因子濃度。

1.8 流式細胞術檢測BMDM細胞標志物的表達 取BMDM,收集于流式管中,分別加入F/480抗體、NOS2抗體與CD206抗體各1 μL,4 ℃避光共孵育30 min,洗去游離的抗體,重懸后,流式細胞儀檢測NOS2與CD206的表達情況。

2 結果

2.1 RTR醇類提取物對BMDM活性及形態(tài)的影響 細胞培養(yǎng)7 d后,F480+/CD11b+陽性率達90.6%,鑒定為BMDM(圖1A);以不同濃度梯度RTR刺激BMDM 24 h,CCK-8檢測其活性變化,確定100 μg/mL的RTR為后續(xù)實驗最佳的刺激濃度(圖1B);RTR刺激BMDM 24 h后,光鏡下觀察巨噬細胞為梭狀、偽足較長,呈M1型,未刺激組的M0型巨噬細胞呈橢圓形(圖1C)。

A:FCM檢測BMDM細胞標志物的表達;B:CCK-8檢測RTR醇類提取物刺激BMDM最佳濃度;C:光鏡下觀察BMDM、RTR醇提取物形態(tài)變化,×20;*、**:與對照組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。

2.2 RTR醇類提取物對BMDM細胞因子轉錄水平的影響 分別用IFN-γ、IL-4、RTR 刺激BMDM 0、12、24、36、48、72 h,RTR醇類提取物組與對照組相比,M1型標志物IL-6、iNOS、TNF-α的mRNA表達水平升高(圖2A)。另一方面,M2型標志物IL-10、Arg-1、TGF-β的表達水平降低(圖2B)。

*、**:與對照組比較,P<0.05、P<0.001;n=3。

2.3 RTR醇類提取物對BMDM細胞因子分泌水平的影響 RTR刺激BMDM 48 h后檢測細胞上清液中細胞因子的表達,與M0型巨噬細胞相比TNF-α、iNOS相對表達水平較對照組顯著增加(圖3A、B)。TGF-β、IL-10相對表達水平明顯降低(P<0.05,圖3C、D)。表明RTR刺激后的BMDM與M1型極化相關。

*、**:與對照組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。

2.4 RTR醇類提取物對BMDM 極化相關膜分子表達的影響 RTR醇類提取物刺激BMDM后,F4/80+NOS2+細胞占比隨刺激時間逐漸升高,于36 h達到峰值,F4/80+CD206+細胞占比未發(fā)生明顯改變,表明BMDM發(fā)生M1型極化(圖4)。

3 討論

根據(jù)不同的微環(huán)境,巨噬細胞可分化為 M1、M2兩種不同的表型。M1型巨噬細胞又被稱為經典激活的巨噬細胞(classically activated macrophage),激活后分泌活性氧中間產物和還原性一氧化氮合酶等大量的炎性細胞因子,促進炎癥的發(fā)展,從而清除病原體,調節(jié)并促進Th1型免疫應答;M2型巨噬細胞被稱為替代激活的巨噬細胞(alternatively activated macrophage),激活后高表達炎癥抑制因子,抑制炎癥反應,促進組織修復等［13]。因此,探索巨噬細胞極化的相關機制有利于闡明疾病的發(fā)生發(fā)展,為臨床用藥提供理論支持。近年來有大量研究報道中草藥及其活性成分對巨噬細胞的影響,從而揭示巨噬細胞極化與治療疾病的關聯(lián)［14-16]。貓爪草是我國民間用于抗結核的傳統(tǒng)藥物,對于結核分枝桿菌具有明顯的抑制作用［17-18]。研究表明貓爪草可以抑制結核桿菌生長,促進巨噬細胞分泌TNF-α［19]。但目前研究中貓爪草是否能夠調控巨噬細胞表型、功能改變未見報道。

為了明確RTR的免疫功能與機制,本研究采用RTR醇類提取物誘導BMDM,觀察RTR醇類提取物與巨噬細胞極化的關聯(lián)。首先從形態(tài)學觀察,M0型巨噬細胞以圓形、橢圓形為主,RTR醇類提取物誘導后,細胞形態(tài)呈梭狀且偽足較長,與 M1型巨噬細胞形態(tài)相近。進一步檢測RTR醇類提取物誘導后 巨噬細胞極化相關mRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)M1型極化相關IL-6、iNOS、TNF-α的mRNA表達顯著上調,且M2型極化相關IL-10、Arg1、TGF-β的 mRNA表達明顯下調;另一方面ELISA結果顯示TNF-α、iNOS的分泌明顯增加,而TGF-β、IL-10的分泌降低。上述結果表明,貓爪草可以刺激M1型極化相關炎癥因子的轉錄表達與分泌,與文獻報道的M1型巨噬細胞極化后的功能相符合［20]。為了明確貓抓草刺激后BMDM極化表型的改變,通過FCM檢測極化相關標志物的表達,發(fā)現(xiàn)M1型極化相關標志物NOS2表達在RTR誘導36 h后明顯升高,而M2型極化相關標志物CD206無明顯變化,表明貓抓草具有刺激BMDM向M1型極化的活性。

基于貓爪草調節(jié)免疫功能的優(yōu)勢,本研究發(fā)現(xiàn)貓爪草醇類提取物能夠誘導M1型巨噬細胞極化。為貓爪草相關研究明確了其抗結核、抗腫瘤相關藥理藥效,并為進一步研發(fā)貓爪草制劑在臨床疾病的防治及應用提供基礎實驗依據(jù)。