AOX1調(diào)控平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換參與動脈鈣化的研究

張倩茹,查 晴,陳 輝,張 煜,楊 克,劉 艷*

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,上海200011;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 心血管內(nèi)科,上海200025)

動脈鈣化主要發(fā)生在內(nèi)膜,是未來冠心病的獨立預(yù)測因子[1],目前冠心病的發(fā)病率和死亡率逐年升高[2-3],已成為全球較為嚴重的公共衛(wèi)生問題。動脈鈣化病變過程中,血脂異?？梢鹧鼙谥兄|(zhì)沉積,并形成氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL),繼而影響血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),引起細胞氧化應(yīng)激反應(yīng),細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多[4],ROS與谷胱甘肽(glutathione,GSH)結(jié)合,在谷胱甘肽還原酶催化作用下轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),即ROS與GSH間存在動態(tài)平衡關(guān)系,而ROS與GSH間不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激可觸發(fā)多種病理生理變化[5-6],導(dǎo)致一系列細胞功能異常,誘發(fā)斑塊形成。VSMC作為動脈中比例最高的細胞類型,參與動脈鈣化的整個病變過程[7],平滑肌細胞從收縮表型(contractile phenotype)向合成型表型(synthetic phenotype)轉(zhuǎn)換[8],是動脈鈣化進展的重要細胞學(xué)改變和事件。醛氧化酶1(aldehyde oxidase,AOX1)屬于鉬黃素(molybdoflavo enzyme,MOFEs)家族,AOX1可作為一種解毒酶參與體內(nèi)代謝過程,主要參與著氧化還原反應(yīng),而這一過程中,AOX1促進細胞內(nèi)過氧化氫的產(chǎn)生,ROS生成增多[9],從而參與細胞凋亡、增殖及分化功能[10-11],但AOX1與動脈鈣化之間無相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡、雄性C57BL/6J小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司)用于VSMC的提取。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)雙抗溶液、抗青霉素-鏈霉素-新霉素(anti-penicillin,streptomycin,and neomycin)三抗溶液、0.25%胰蛋白酶(trypsin)、DMEM培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium)均購自美國Gibco公司。活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit,也稱ROS Assay Kit)、GSH和GSSG檢測試劑盒(GSH and GSSG Assay Kit)和RIPA裂解液購自碧云天公司(中國)。oxLDL購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1VSMC的提取 將小鼠麻醉致死,剝離取小鼠主動脈并浸泡于10%的三抗溶液中;顯微鏡下仔細剝離血管周圍組織;超凈臺中三抗溶液清洗血管組織3次;剪成小組織塊。加入少許FBS放入培養(yǎng)箱1 h;待FBS將組織塊黏于皿底后加入DMEM培養(yǎng)基(DMEM+20%FBS+1%雙抗);培養(yǎng)至約1周,可見組織塊邊緣有平滑肌細胞爬出;用胰酶將細胞消化下來,重新接種于新的培養(yǎng)皿,用于后續(xù)細胞實驗。

1.2.2活性氧檢測試驗 oxLDL 0、12.5、25 和50 μg/mL分別刺激VSMC 24 h。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液,每個六孔板的1個孔加入1 ml稀釋好的DCFH-DA。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光顯微鏡下拍照觀察。實驗重復(fù)5次。

1.2.3GSH和GSSG檢測試驗 oxLDL 0、12.5、25和50 μg/mL分別刺激VSMC 24 h。配置GSSG儲備液、DTNB儲備液、蛋白去除試劑M溶液、NADPH儲備液、稀釋谷胱甘肽還原酶、工作液,PBS洗滌細胞1次,RIPA裂解液離心收集細胞;加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑M溶液,充分Vortex;液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融;4℃,10 000 g離心10 min取上清。加入稀釋的GSH清除輔助液vortex混勻;加入GSH清除工作液vortex混勻,25℃反應(yīng)60 min;加入工作液進行檢測,酶標(biāo)儀測定A412。實驗重復(fù)5次。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡(Western blotting) 運用細胞裂解液提取總蛋白;樣品100℃加熱10 min制樣;將樣品和標(biāo)志物加入電泳膠的加樣孔內(nèi);120 V電泳分離不同分子量的蛋白;裁膠。將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜泡于甲醇中激活,制作轉(zhuǎn)膜“三明治”順序為:轉(zhuǎn)移盒負極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-轉(zhuǎn)移盒正極的順序由下而上放置(300 mA);5%牛奶封閉1 h;洗膜緩沖液(Tris buffered saline Tween,TBST)洗3次,每次10 min;一抗4℃搖床孵育12 h;TBST 洗3次,每次10 min;二抗室溫孵育1 h;配置顯影液,拍照觀察。利用Image J軟件對條帶灰度值進行分析,以B肌動蛋白作為內(nèi)參蛋白。目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3 次。

1.2.5免疫組織化學(xué)(免疫組化) 取新鮮的血管樣品經(jīng)4%甲醛固定;石蠟包埋并切片;脫蠟。樣品用枸櫞酸鹽修復(fù)液修復(fù)抗原表位;3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶作用20 min,TBS清洗。5%馬血清室溫封閉;一抗4℃孵育12 h;TBS清洗;二抗室溫孵育30 min;TBS清洗。配置二氨基聯(lián)苯胺顯色溶液,顯微鏡下觀察到黃色陽性染色出現(xiàn)后,吸掉染色液終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染細胞核3 min,洗掉染色液,鹽酸乙醇分化沖洗;樣品依次浸入95%乙醇3 min,無水乙醇5 min;中性樹脂封片;顯微鏡觀察。免疫組化采用半定量分析方法,采用image proplus軟件分析積分光密度(integrated optical density,IOD值),最后用IOD值/面積。實驗重復(fù)5次。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用非配對t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 oxLDL促平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激反應(yīng),降低GSH/GSSG比例

為明確oxLDL對平滑肌細胞的作用,以不同濃度oxLDL(0、12.5、25.0和50.0ug/ml)刺激平滑肌細胞24 h,結(jié)果顯示隨著oxLDL刺激濃度升高,細胞內(nèi)ROS生成水平呈明顯的劑量依賴性升高;平滑肌細胞內(nèi)GSH/GSSG比例隨oxLDL刺激濃度升高而顯著性下降,并呈劑量相關(guān)性(見表1)。同時平滑肌細胞收縮表型分子α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、肌球蛋白重鏈11(myosin heavy chain 11,MYH11)表達下降,合成表型分子骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、Gla蛋白(Matrix Gla Protein,MGP)表達升高,即平滑肌細胞向合成表型轉(zhuǎn)換(見圖1)。

圖1 oxLDL對平滑肌細胞ROS生成及GSH/GSSG的影響

表1 oxLDL對VSMC的表型分子蛋白表達量

2.2 AOX1參與oxLDL誘導(dǎo)的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化

為進一步了解AOX1對平滑肌細胞調(diào)控作用,用AOX1敲減病毒感染平滑肌細胞,同時oxLDL(50 μg/mL)刺激細胞24 h。結(jié)果顯示,AOX1敲減后,平滑肌細胞收縮表型分子表達升高,而合成表型分子表達下降(見表2)。即AOX1降低抑制平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化。

表2 AOX1對VSMC的表型分子蛋白表達量的影響

平滑肌細胞感染AOX1及對照組敲減病毒后,使用oxLDL(50 μg/mL)刺激24 h后檢測平滑肌細胞表型分子(以β-actin為內(nèi)參照基因)。

2.3 AOX1調(diào)控ROS生成及GSH/GSSG

為探究AOX1參與oxLDL誘導(dǎo)的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的具體機制,在平滑肌細胞中導(dǎo)入特異性siRNA敲減AOX1表達,在oxLDL刺激下觀察AOX1表達變化,并同時觀察ROS及GSH/GSSG水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):敲減AOX1后,可顯著性抑制oxLDL誘導(dǎo)的ROS升高及GSH/GSSG下降(圖2)。證實oxLDL刺激下調(diào)控AOX1升高,誘發(fā)平滑肌細胞內(nèi)ROS-GSH失衡,導(dǎo)致平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化。

圖2 AOX1對VSMCROS生成及GSH/GSSG的影響

2.4 人動脈鈣化斑塊組織中AOX1表達升高,且定位于平滑肌細胞

為更進一步探究AOX1在動脈鈣化斑塊組織中表達及定位情況,本課題組通過倫理委員會論證審核后,收集人動脈鈣化斑塊及正常血管組織,使用熒光免疫組化檢測AOX1在斑塊及正常血管組織中表達及定位。結(jié)果顯示相較于正常血管組織,AOX1在動脈鈣化斑塊組織中表達升高,并定位于平滑肌細胞(αSMA陽性,見圖3)。

圖3 AOX1在斑塊組織中表達情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),oxLDL刺激促進平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激反應(yīng),降低GSH/GSSG比例及AOX1表達升高,而AOX1病毒敲減之后可顯著抑制平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化,ROS生成且AOX1在動脈粥樣硬化斑塊組織中表達升高,并定位于血管平滑肌細胞。提示AOX1參與脂質(zhì)誘導(dǎo)的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換,從而參與動脈鈣化。

動脈鈣化由許多局部和全身因素參與,包括高脂血癥、炎癥、氧化應(yīng)激、高血壓和糖尿病[12]。健康的血管處于促氧化和抗氧化的平衡之中,當(dāng)這種平衡被擾亂時,如活性氧生成增多就會發(fā)生內(nèi)皮功能障礙,導(dǎo)致血管發(fā)生鈣化[13-14]。鈣化血管細胞來源于局部的平滑肌細胞和循環(huán)中的造血干細胞血管,其中平滑肌細胞是動脈管壁的重要組成部分[15]。以往研究發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換是動脈壁的適應(yīng)性反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)膜增厚,進一步發(fā)展為鈣化[16-17]。還有研究表明,血管平滑肌細胞成骨分化是啟動動脈鈣化的機制之一[18-20]。以往的研究顯示,GSH在與ROS結(jié)合后,在谷胱甘肽還原酶催化作用下轉(zhuǎn)化為GSSG,達到清除ROS的生物學(xué)效應(yīng),但GSSG也可轉(zhuǎn)化為GSH[21]。故此,ROS與GSH間存在動態(tài)平衡關(guān)系,而ROS與GSH間不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激可觸發(fā)多種病理生理變化[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)oxLDL可誘導(dǎo)平滑肌細胞ROS升高,進而導(dǎo)致平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化[22]。因此推測在oxLDL刺激導(dǎo)致的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化過程中,ROS-GSH與平滑肌表型轉(zhuǎn)化存在相關(guān)性。

AOX1主要存在于哺乳動物細胞質(zhì)中,廣泛分布于體內(nèi)多個組織器官中,肝臟表達量最高,并受肝內(nèi)活性的影響[23],此外,內(nèi)分泌組織和腦中也可檢測到AOX1活性[24]。AOX1可作為一種解毒酶參與體內(nèi)代謝過程,AOX1的活性導(dǎo)致過氧化氫的產(chǎn)生,這也促進了ROS的產(chǎn)生,同時也可能誘導(dǎo)AMPK的磷酸化。AOX1催化活性需要黃素腺嘌呤二核苷酸和鉬蝶呤輔因子,AOX1催化雜環(huán)的羥基化和多種醛化合物氧化成相應(yīng)的羧酸[25],參與氧化還原反應(yīng),氧化的最終產(chǎn)物是像P450一樣的羥基化底物[26]。而這一過程中,AOX1促進細胞內(nèi)ROS生成增多[9],從而參與細胞凋亡、增殖及分化功能[10-11]。然而,AOX1與動脈鈣化之間無相關(guān)報道,本研究首次證實,AOX1參與oxLDL誘導(dǎo)的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換進而參與動脈鈣化。

動脈鈣化病理過程復(fù)雜,受多方面因素調(diào)控,本研究僅通過細胞水平體外研究其發(fā)病機制具有一定局限性。此外,脂質(zhì)如何通過AOX1誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換的具體機制還有待進一步探究。動脈鈣化是心血管事件和全因死亡的風(fēng)險標(biāo)志物,進一步闡明動脈鈣化分子機制有望為動脈鈣化提供新的治療靶點。