丙泊酚減輕肺炎支原體感染所致肺損傷的機制探究

彭承旭 楊坤渹 向紅 吳君如

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)是與兒童急性呼吸道感染相關(guān)的主要病原體之一[1]。多數(shù)MP肺炎(MP pneumonia,MPP)患者通過大環(huán)內(nèi)酯類或四環(huán)素治療后會康復(fù);然而,由于抗生素不斷使用誘發(fā)了MP耐藥菌株的出現(xiàn),進而導(dǎo)致臨床難治性MPP的逐年增加[2-3]。因此,尋找治療MPP的有效方法尤為重要。丙泊酚是一種快速、短效的靜脈麻醉藥,廣泛用于術(shù)后及ICU患者[4]。有研究證實,丙泊酚在不同程度的肺損傷過程中均發(fā)揮保護作用[5]。但關(guān)于丙泊酚對MP感染引起的肺損傷的潛在保護作用知之甚少。PI3K/Akt信號通路廣泛參與多個生物學(xué)過程[6]。丙泊酚已被證實可通過激活PI3K/Akt信號通路在缺血再灌注引發(fā)的腸和肺損傷中發(fā)揮保護作用[7]。綜上,猜想丙泊酚可能通過激活PI3K/Akt信號通路對MP感染所致的肺損傷具有保護作用。

資料與方法

一、材料

雄性SD大鼠,年齡6～8周齡,體質(zhì)量為(200～230)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,SCXK(京)2021-0011;MP(15531)獲自美國ATCC;PPLO肉湯培養(yǎng)基(GD-P0094846)、大鼠MP-IgM ELISA試劑盒(GD-E015278667)、大鼠CRP ELISA(GD-E018275651)試劑盒獲自上海GuanDao;丙泊酚(純度:99.52%,HY-B0649)、阿奇霉素(純度:98.0%,HY-17506)、渥曼青霉素(PI3K抑制劑,純度:99.85%,HY-10197)獲自美國MedChemExpress;大鼠IL-6 ELISA試劑盒(ER0042)、大鼠IL-18 ELISA試劑盒(ER0036)和大鼠TNF-α ELISA試劑盒(ER1393)均購自武漢FineTest。HE染色試劑盒(G1120)、Diff-Quik全血染色試劑盒(G1541)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(T2190)和RIPA裂解液(R0020)獲自北京Solarbio;一抗p-PI3K(ab278545)、PI3K(ab191606)、p-Akt(ab38449)、Akt(ab8805)和β-actin(ab8226)均獲自英國Abcam。

二、方法

1 MPP模型構(gòu)建及分組

MP溶解在PPLO肉湯培養(yǎng)基中,在37℃下孵育。對數(shù)生長期的MP通過顏色變化單位(color change unit,CCU)進行量化,使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至所需濃度。

將SD大鼠飼養(yǎng)在21℃,55%濕度和12 h光/暗循環(huán)下,自由獲取食物和水。將大鼠分為以下5組(n=12/組):對照組、MPP模型組、丙泊酚組、阿奇霉素組和丙泊酚+PI3K抑制劑(渥曼青霉素)組。為了誘導(dǎo)MP感染,通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉將每只大鼠麻醉,一旦麻醉,對照組大鼠用生理鹽水處理,其他組大鼠鼻內(nèi)接種含有1×108CCU/mL的150 mL MP溶液,連續(xù)4天,每天一次,以制備MPP模型,MP檢測陽性即表示造模成功[8]。丙泊酚組、阿奇霉素組從末次接種日起腹腔注射丙泊酚10 mg/(kg·d)[9]或阿奇霉素25 mg/(kg·d)[8],連續(xù)4天。對照組和MPP模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水,丙泊酚+渥曼青霉素組在腹腔注射丙泊酚的同時尾靜脈注射15 ug/kg/day渥曼青霉素[7],連續(xù)4天。所有處理完成后,用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,通過心臟穿刺將血樣收集到含EDTA的血漿分離管中。隨后,用120 mg/kg戊巴比妥鈉對大鼠實施安樂死,并立即進行尸檢。收集大鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織以供進一步實驗。動物實驗得到本院機構(gòu)動物護理和使用委員會的批準(zhǔn)(2018論審第(WY19)號)。

2 血清MP-IgM和CRP水平檢測

將血樣離心后獲取血清,根據(jù)試劑盒方法檢測MP-IgM和CRP水平。

3 BALF中IL-6、IL-18和TNF-α表達測定

打開安樂死大鼠的胸腔,在左右支氣管分叉位點對右主氣管進行結(jié)扎。預(yù)冷的PBS進行3次右肺支氣管肺泡灌洗,每次回收約3.5 mL灌洗液(BALF)。離心收集上清液,經(jīng)對應(yīng)試劑盒方法檢測BALF中炎癥因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平。

4 BALF中炎癥細(xì)胞的定量檢測

將BALF中的細(xì)胞懸浮在1 mL PBS中,并與0.4%臺盼藍(lán)染料以1 ∶1的比例混合,將10 μL懸浮液置于腔室載玻片,并將載玻片插入自動細(xì)胞計數(shù)器,進行總細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞沉淀重懸以制備涂片用于染色。使用Wright-Giemsa染色對BALF中包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞進行計數(shù)。簡而言之,通過用基于甲醇的Wright-Giemsa染色劑固定2 min,對載玻片進行染色。之后,將載玻片在Diff-Quik I溶液中染色5～10 s并立即取出。然后根據(jù)Diff-Quik全血染色試劑盒的說明,將載玻片在Diff-Quik II溶液中染色10～20 s并在室溫下立即取出。最后使用自動細(xì)胞計數(shù)器從隨機選擇的區(qū)域中對每個樣本的總共200～300個細(xì)胞進行計數(shù)。

5 肺濕干比

將大鼠安樂死后,通過鈍性解剖將氣管和食道與肺分開,使用PBS沖洗肺組織后稱重左肺的重量(濕重)。隨后在65℃進行48 h烘干,測量左肺的干重并計算濕重與干重的比率(肺濕干比)。

6 HE染色

制備常規(guī)石蠟肺組織切片,切片在40℃恒溫烘箱中干燥。脫蠟、水合后,將組織用蘇木精染色5 min,伊紅復(fù)染30～60 s,在光學(xué)顯微鏡下觀察以驗證顏色的變化。脫水后干燥、密封,在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并評分。實質(zhì)性肺炎評分基于炎性細(xì)胞肺泡浸潤程度[10],標(biāo)準(zhǔn)如下:0分,支氣管周圍無炎癥細(xì)胞;1分,支氣管周圍觀察到少量的炎癥細(xì)胞;2分,炎癥呈細(xì)胞層厚;3分,氣管周圍有兩到四層細(xì)胞層厚的炎癥;4分,氣管周圍炎癥呈四層細(xì)胞厚。

7 TUNEL檢測

將肺組織切片自然干燥,用二甲苯脫蠟并用梯度酒精溶液水合。添加50 μL TdT酶反應(yīng)溶液中,避光孵育60 min。隨后,將組織切片上添加50 μL Streptavidin-TRITC標(biāo)記溶液孵育30 min。通過DAPI溶液復(fù)染15 min,用封固劑密封后在顯微鏡下觀察。Image J軟件對圖像中的TUNEL陽性細(xì)胞進行計數(shù),并計算細(xì)胞凋亡率(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%)。

8 Western Blot分析

收集大鼠肺組織,并用RIPA裂解液裂解。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后將膜與一抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和β-actin在4℃下過夜孵育[11]。將HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h。ECL用于可視化印跡,并用Image J軟件分析灰度值,β-actin作為內(nèi)參對照。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、丙泊酚降低MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平

(表1)結(jié)果顯示,MPP模型組血清MP-IgM和CRP水平較對照組顯著升高(P<0.05)。此外,丙泊酚或阿奇霉素治療后顯著降低了MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平(P<0.05);而丙泊酚與阿奇霉素對MP-IgM和CRP水平的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在使用渥曼青霉素干預(yù)后可明顯逆轉(zhuǎn)丙泊酚對MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平的抑制作用(P<0.05)。

表1 丙泊酚對MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平的影響

二、丙泊酚抑制MPP模型大鼠BALF的炎癥反應(yīng)

(表2)結(jié)果顯示,與對照組比較,MPP模型組大鼠BALF中炎癥因子IL-6、IL-18和TNF-α水平顯著上調(diào);另外嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯增多(P<0.05)。與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平明顯降低;此外,嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.05)。與丙泊酚組比較,阿奇霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平變化以及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量變化無顯著差異(P>0.05):而丙泊酚+渥曼青霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平以及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。

表2 丙泊酚對MPP模型大鼠BALF中炎癥因子水平和炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響

三、丙泊酚改善MPP模型大鼠肺組織損傷

(表3)結(jié)果顯示,MPP模型組大鼠肺濕干比較對照組明顯上調(diào)(P<0.05);相比之下,與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組顯著降低大鼠肺濕干比(P<0.05);此外,丙泊酚對大鼠肺濕干比的抑制作用可被渥曼青霉素減弱(P<0.05)。

表3 丙泊酚對MPP模型大鼠肺濕干比以及肺組織病理性損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示,對照組支氣管、肺泡和血管未見明顯病變,肺泡壁未見明顯異常,肺組織未見炎癥細(xì)胞浸潤;而MPP模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較松散,肺泡壁因水腫而增厚,肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤;相比于MPP模型組,丙泊酚組或阿奇霉素組肺泡結(jié)構(gòu)和肺組織壁增厚顯著減少,炎癥細(xì)胞浸潤減少(見圖1)。然而,丙泊酚對肺組織病理損傷的積極作用被渥曼青霉素阻斷。此外,根據(jù)炎癥浸潤評分標(biāo)準(zhǔn)評估肺組織損傷,與對照組比較,MPP模型組大鼠炎癥浸潤評分明顯升高(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組大鼠炎癥浸潤評分顯著下調(diào)(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組大鼠炎癥浸潤評分變化無顯著差異(P>0.05),丙泊酚+渥曼青霉素組大鼠炎癥浸潤評分顯著增加(P<0.05)。

圖1 HE染色檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織病理性損傷的影響(×200,箭頭表示炎性細(xì)胞浸潤)

四、丙泊酚抑制MPP模型大鼠肺組織細(xì)胞凋亡

(圖2和表4)結(jié)果顯示,與對照組比較,MPP模型組肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組細(xì)胞凋亡率變化無顯著差異(P>0.05);丙泊酚+渥曼青霉素組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。

圖2 TUNEL染色檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響(×400)

表4 丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響

五、丙泊酚激活MPP模型大鼠中PI3K/Akt信號通路

(圖3和表5)結(jié)果顯示,與對照組比較,MPP模型組肺組織中磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯降低(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯升高(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平變化無顯著差異(P>0.05),而丙泊酚+渥曼青霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯降低(P<0.05)。

圖3 Western Blot檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織PI3K/Akt信號通路的影響1～5依次表示為對照組、MPP模型組、丙泊酚組、阿奇霉素組和丙泊酚+渥曼青霉素組

表5 丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值的影響

討 論

MPP是一種兒童常見的呼吸道疾病,其發(fā)病率正在逐漸增加[12]。MP是一種最小、最簡單的自我復(fù)制細(xì)菌,無細(xì)胞壁,其生存依賴于宿主的營養(yǎng)交換。MP侵入人體后可通過與宿主細(xì)胞膜融合誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)[13]。隨著對MPP的不斷研究,多種包含阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物可用作一線治療藥物,但由于耐藥導(dǎo)致治療效果有限,并且單獨使用阿奇霉素治療還可誘發(fā)難治性的MPP[14]。因此,尋找MPP的理想治療方案尤為關(guān)鍵。

MP特異性IgM的鑒定是臨床上用于診斷MP感染的廣泛指標(biāo)[15]。本研究顯示,丙泊酚后可明顯降低MPP大鼠MP-IgM水平,提示丙泊酚抑制MP生長。另外,CRP不僅是一種急性期反應(yīng)蛋白,也是一種促炎因子,在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染時高表達,也是診斷MPP發(fā)生的關(guān)鍵性指標(biāo)之一[16-17]。結(jié)果顯示,丙泊酚降低了MP感染誘發(fā)的血清中CRP的高表達。現(xiàn)有的研究和報告顯示,IL-6等炎性因子是CRP合成的主要因素[18]。以上這些炎癥已被證實在MPP中高表達,且與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病相關(guān)。于是,本研究檢測了用或不用丙泊酚處理的MPP大鼠BALF中炎癥因子的水平和炎癥細(xì)胞的數(shù)量以探究丙泊酚與MPP大鼠炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果表明,丙泊酚不僅減少了MPP大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量,并且降低了IL-6、IL-18和TNF-α水平。提示丙泊酚通過減少炎癥細(xì)胞的浸潤改善MP誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。進一步表明,丙泊酚減輕了MPP大鼠肺組織的病理損傷,降低了MPP大鼠肺組織中細(xì)胞凋亡率。以上結(jié)果表明,丙泊酚保護MP感染的大鼠免受炎癥和細(xì)胞凋亡損傷,然而其機制尚不明晰。

既往研究表明,PI3K/Akt信號通路在炎癥細(xì)胞募集、調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達以及氣道重塑等多種機體活動中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19]。據(jù)報道,激活PI3K/Akt信號可通過抑制炎癥和纖維化的發(fā)生發(fā)揮心臟保護作用[20]。另外,線粒體ATP敏感性鉀離子通道通過激活哮喘大鼠模型中PI3K/Akt信號通路增加氣道平滑肌細(xì)胞增殖[21]。為闡明PI3K/Akt通路激活是否參與丙泊酚對MP感染所致的肺損傷的保護作用。本研究通過檢測PI3K和Akt磷酸化水平發(fā)現(xiàn),丙泊酚可上調(diào)MPP模型大鼠肺組織中PI3K和Akt磷酸化水平;而在使用PI3K抑制劑渥曼青霉素處理后不僅抑制了丙泊酚對PI3K和Akt磷酸化水平的促進作用,并且削弱了丙泊酚對MPP大鼠的保護作用。以上這些結(jié)果表明,PI3K/Akt通路參與了丙泊酚對MP誘導(dǎo)的肺損傷的保護作用。

綜上,丙泊酚能夠通過下調(diào)血清MP-IgM和CRP水平、抑制BALF中炎癥因子水平和減少炎癥細(xì)胞數(shù)量、同時削弱肺組織的炎癥浸潤和病理變化以及抑制細(xì)胞凋亡改善MP所致的肺損傷。值得注意的是,丙泊酚的這些保護特性可以通過激活PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)。然而,本研究還存在一些局限性,首先,渥曼青霉素只能部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚的保護作用,表明除了PI3K/Akt通路,丙泊酚可能還存在其他保護機制;其次,僅使用了渥曼青霉素研究了PI3K/Akt信號通路在當(dāng)前研究中的作用,而PI3K或Akt基因敲除模型或RNA干擾技術(shù)也可考慮應(yīng)用于進一步研究,這將有利于證明此通路在丙泊酚保護MP誘導(dǎo)的肺損傷中的具體作用。