基于生物信息學(xué)分析腎透明細(xì)胞癌中植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白6的表達(dá)及臨床意義△

于建宇，方愛鐘，鄭義，于春娜，彭怡琛，林藝，汪曉敏#，李文斌,#

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)腫瘤綜合治療病區(qū)，北京 100071

2首都醫(yī)科大學(xué)健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)國家研究院，北京 100069

腎細(xì)胞癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中最常見的亞型是腎透明細(xì)胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC），占所有腎細(xì)胞癌類型的70%～80%[1-2]，是一種惡性程度相對較低、發(fā)展緩慢的腫瘤。手術(shù)是KIRC 的主要治療手段，但大多數(shù)情況下，即使進(jìn)行了早期手術(shù)治療，仍有30%轉(zhuǎn)移的可能[3-6]。KIRC 已被證明與免疫微環(huán)境[7]、廣泛的腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)[8]，這些改變可導(dǎo)致許多腫瘤相關(guān)基因表達(dá)水平的改變。因此，迫切需要對KIRC 的敏感基因進(jìn)行研究，以尋找有效的治療靶點(diǎn)及預(yù)后的分子標(biāo)志物，進(jìn)而有助于早期診斷，并為KIRC 早期干預(yù)提供依據(jù)。

植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白6（plant homeodomain finger protein 6，PHF6）定位于人染色體Xq26.3，是一種核仁、核糖體RNA 啟動子相關(guān)蛋白，該蛋白具有2 個(gè)植物同源結(jié)構(gòu)域[9]，定位于細(xì)胞核中，并在脊椎動物中高度保守[10]。PHF6 表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究表明，PHF6編碼核仁和染色質(zhì)相關(guān)的白血病抑制因子，其表達(dá)缺失會導(dǎo)致染色質(zhì)可及性及核小體定位的局灶性變化[11]，PHF6 表達(dá)缺失極大地?fù)p害了G2期細(xì)胞檢查點(diǎn)的恢復(fù)[12]。隨著基因研究的不斷深入，PHF6 在血液病中的作用，特別是對血液腫瘤的抑制作用也逐漸受到關(guān)注[13]，并取得了一定的成果。但目前臨床對KIRC 與PHF6 間的關(guān)系知之甚少。

本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者的臨床特征及RNA-seq 高通量測序信息，分析PHF6在KIRC 中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，從而分析PHF6表達(dá)與KIRC 間的關(guān)系，并通過免疫組化法進(jìn)一步驗(yàn)證PHF6的表達(dá)與腫瘤相關(guān)基因間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下載535 例KIRC組織及72 例正常腎組織的數(shù)據(jù)及患者的病歷資料；從基因型-組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫（https://commonfund.nih.gov/gtex）下載28 例正常腎組織的數(shù)據(jù)及患者的病歷資料。由于部分?jǐn)?shù)據(jù)有缺失，共統(tǒng)計(jì)到535 例KIRC患者的部分臨床特征、100 例正常腎組織和535 例KIRC 組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)、535 例KIRC 患者的總生存期（overall survival，OS）、532 例KIRC 患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）、530例KIRC 患者的疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）資料。此外，自上海超芯生物科技有限公司購買KIRC 組織及癌旁組織共150 個(gè)微陣列的石蠟切片，由于部分矩陣的病歷資料缺失，共統(tǒng)計(jì)到146 個(gè)微陣列的年齡和性別、148 個(gè)微陣列的組織學(xué)分級和臨床分期的資料。

首先比較TCGA 數(shù)據(jù)庫下載的72 例正常腎組織與535 例KIRC 組織中的PHF6表達(dá)情況；再加上GTEx 數(shù)據(jù)庫下載的28 例正常腎組織，比較100例正常腎組織與535 例KIRC 組織中PHF6的表達(dá)情況，并比較不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6的表達(dá)情況。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估PHF6表達(dá)對KIRC 的診斷價(jià)值。依據(jù)PHF6表達(dá)水平的中位數(shù)，將TCGA 數(shù)據(jù)庫中535 例KIRC 患者分為PHF6高表達(dá)組和PHF6低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，比較兩組患者的OS、PFS、DSS。

1.2 基因本位（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

為探究PHF6調(diào)節(jié)KIRC 的可能的分子機(jī)制，依據(jù)PHF6表達(dá)水平的中位數(shù)，將TCGA 數(shù)據(jù)庫中535 例KIRC 患者分為PHF6高表達(dá)組和PHF6低表達(dá)組，利用R 語言的“Limma”包對兩組患者的所有基因進(jìn)行差異分析，并將|Log Fold Change|＞1 作為共同差異基因。采用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對上述共同差異基因進(jìn)行GO 分析，并將共同差異基因中PHF6高表達(dá)組的基因提取出來進(jìn)行KEGG 通路富集分析，通過R 語言的“ggplot2”包進(jìn)行可視化。

1.3 免疫組化法驗(yàn)證組織微陣列中相關(guān)蛋白與PHF6 表達(dá)的相關(guān)性

選取KEGG 通路富集分析中的相關(guān)基因進(jìn)行相關(guān)性分析，免疫組化法驗(yàn)證組織微陣列中相關(guān)蛋白與PHF6 表達(dá)的相關(guān)性。選取上海超芯生物科技有限公司購買的75 例KIRC 組織及癌旁組織（共150 個(gè)矩陣），經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次，在微波爐內(nèi)用檸檬酸鹽修復(fù)15 min，冷卻至室溫后，TBST 洗滌3 次，免疫組化筆圈出組織，過氧化物酶封閉15 min。滴加稀釋后的山羊血清一抗，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min，胰蛋白酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合酶孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色15 min，蘇木素復(fù)染15 min，1%酸性乙醇分化液分化2 s，返藍(lán)2 min 后，梯度乙醇及二甲苯復(fù)水，封片，鏡檢。

判定標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，無著色計(jì)1 分，淺黃色染色計(jì)2 分，黃色或深黃色染色計(jì)3分，細(xì)胞呈較深黃色且沒有背景著色計(jì)4 分，細(xì)胞呈深黃色且沒有背景著色計(jì)5 分；依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評分，＜5%計(jì)1 分，5%～24%計(jì)2 分，25%～49%計(jì)3 分，50%～75%計(jì)4 分，＞75%計(jì)5 分。將染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞所占比例評分相乘，1～4 分為陰性，5～8 分為弱陽性，9～12 分為陽性，13～25 分為強(qiáng)陽性；其中1～8 分為低表達(dá)，9～25 分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R 語言和SPSS 16.0 對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法評估PHF6高表達(dá)組與PHF6低表達(dá)組KIRC 患者的生存差異，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線，計(jì)算AUC，評估PHF6表達(dá)對KIRC 的診斷價(jià)值。采用R 語言中的cor 函數(shù)計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，驗(yàn)證組織微陣列中相關(guān)蛋白與PHF6 表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常腎組織和KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況的比較

TCGA 數(shù)據(jù)庫中，正常腎組織中PHF6的相對表達(dá)量為（2.434±0.051），明顯高于KIRC 組織的（2.011±0.018），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.215，P＜0.01）。TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中，正常腎組織中PHF6的相對表達(dá)量為（2.352±0.482），明顯高于KIRC 組織的（2.011±0.018），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.417，P＜0.01）。

2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況的比較

TCGA 數(shù)據(jù)庫中，不同年齡、性別KIRC 患者KIRC 組織中PHF6表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床分期、組織學(xué)分級、腫瘤狀態(tài)KIRC 患者KIRC 組織中PHF6表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中術(shù)后無新發(fā)腫瘤患者的PHF6高表達(dá)率高于術(shù)后新發(fā)腫瘤患者，且隨臨床分期、組織學(xué)分級升高，PHF6高表達(dá)率逐漸降低。（表1）

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況的比較

2.3 組織微陣列中不同臨床特征KIRC 患者KIRC組織中PHF6 表達(dá)情況的比較

組織微陣列中，不同年齡、性別、組織學(xué)分級情況KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床分期KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 組織微陣列中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達(dá)情況的比較

2.4 PHF6 表達(dá)水平對KIRC 的診斷價(jià)值

ROC 曲線顯示，KIRC 組織中PHF6表達(dá)水平診斷KIRC 的AUC 為0.730（95%CI：0.672～0.782），靈敏度為77.80%，特異度為58.90%。（圖1）

圖1 PHF6表達(dá)診斷KIRC的ROC曲線

2.5 預(yù)后情況的比較

依據(jù)PHF6表達(dá)水平的中位數(shù)，將TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者分為PHF6高表達(dá)組和PHF6低表達(dá)組，Kaplan-Meier 法評估不同PHF6表達(dá)情況KIRC 患者生存情況的差異，結(jié)果顯示，PHF6高表達(dá)組患者的中位OS、PFS、DSS 均長于PHF6低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2～圖4）

圖2 PHF6高表達(dá)組（n=268）與PHF6低表達(dá)組（n=267）KIRC患者的OS曲線

圖3 PHF6高表達(dá)組（n=266）和PHF6低表達(dá)組（n=266）KIRC患者的PFS曲線

圖4 PHF6高表達(dá)組（n=265）和PHF6低表達(dá)組（n=265）KIRC患者的DSS曲線

2.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析

為研究PHF6參與KIRC 發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制，對TCGA 數(shù)據(jù)庫中PHF6高表達(dá)組和PHF6低表達(dá)組KIRC 患者的基因進(jìn)行分析，結(jié)果共篩選出750 個(gè)差異基因，其中300 個(gè)相對PHF6表達(dá)上調(diào)，450 個(gè)相對PHF6表達(dá)下調(diào)。GO 分析結(jié)果顯示，差異基因的生物過程主要集中于體液免疫應(yīng)答、補(bǔ)體激活和B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫上，細(xì)胞成分主要集中于免疫球蛋白復(fù)合物、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞的頂端部分和血液微粒上，分子功能主要集中于抗原結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合和硫化合物結(jié)合上。將共同差異基因中PHF6高表達(dá)組的基因提取出來進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示，PHF6高表達(dá)的KEGG 通路主要集中于膽固醇代謝、白細(xì)胞介素-17 信號通路和類固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通過生物代謝與合成、炎癥反應(yīng)影響免疫調(diào)節(jié)與應(yīng)答，調(diào)節(jié)KIRC 的發(fā)展進(jìn)程。（圖5、圖6）

圖5 差異基因的GO分析

圖6 差異基因的KEGG富集分析

2.7 免疫組化法驗(yàn)證組織微陣列中相關(guān)蛋白與PHF6 表達(dá)的相關(guān)性

選取KEGG 免疫相關(guān)的信號通路中參與KIRC發(fā)生發(fā)展的基因，探討其與PHF6表達(dá)的相關(guān)性，從而進(jìn)一步推斷PHF6在KIRC 中的作用。參與腫瘤調(diào)節(jié)的基因如肌醇1，4，5-三磷酸2 型受體（inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2，ITPR2）（是促進(jìn)細(xì)胞衰老、減少細(xì)胞增殖的基因）、磷脂酶A2組ⅣA（phospholipase A2 group ⅣA，PLA2G4A）（是介導(dǎo)溶酶體損傷的基因）、前列腺素F 受體（prostaglandin F receptor，PTGFR）（是抗血管生成的基因）、核糖體蛋白S6 激酶A6（ribosomal protein S6 kinase A6，RSK4）（是抑癌基因），均與PHF6的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.52、0.34、0.50、0.42，P＜0.01）。表明PHF6與ITPR2、PLA2G4A、PTGFR、RSK4 在KIRC 中的作用相似，可以抑制KIRC 細(xì)胞的生長。

通過免疫組化法驗(yàn)證組織微陣列中RSK4 與PHF6 表達(dá)的相關(guān)性，由2 名研究者獨(dú)立對染色后的組織微陣列中PHF6 蛋白和RSK4 蛋白的陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分，結(jié)果顯示，RSK4 蛋白的表達(dá)與PHF6 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.557，P＜0.01），表明PHF6 蛋白可能通過調(diào)節(jié)RSK4 蛋白的表達(dá)抑制KIRC 細(xì)胞的生長。（圖7）

圖7 組織微陣列中KIRC患者KIRC組織中PHF6與RSK4的表達(dá)情況（免疫組化染色，×10）

3 討論

PHF6的表達(dá)水平對KIRC 患者的預(yù)后有重要意義。近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，通過大數(shù)據(jù)分析某些或某類基因在疾病中的作用，可以為疾病的發(fā)生發(fā)展、治療和預(yù)后評估等提供新思路。KIRC 與免疫微環(huán)境、腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，這些改變均可導(dǎo)致多個(gè)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)水平的改變。目前，雖然已經(jīng)開發(fā)了新的診斷手段提高KIRC 的診斷率，但由于KIRC 起病隱匿、腫瘤標(biāo)志物較少，KIRC 患者的早期診斷效率仍較差[7]；因此，為尋找新的早期診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物，本研究對TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者的病歷資料和RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。

本研究首先分析了TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者的臨床特征，結(jié)果顯示，PHF6表達(dá)水平與KIRC 患者的臨床分期、組織學(xué)分級、腫瘤狀態(tài)有關(guān)；且與正常腎組織相比，PHF6在KIRC 組織中表達(dá)下調(diào)。然后本研究繪制ROC 曲線推斷PHF6表達(dá)水平對KIRC 的診斷效能，結(jié)果顯示，PHF6表達(dá)水平診斷KIRC 的AUC 為0.730（95%CI：0.672～0.782），靈敏度為77.80%，特異度為58.90%。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，PHF6高表達(dá)組患者的中位OS、PFS、DSS 均長于PHF6低表達(dá)組患者，提示PHF6的表達(dá)水平可能對KIRC 患者的預(yù)后有指示作用。

目前，臨床對PHF6 如何參與KIRC 的發(fā)生發(fā)展過程仍知之甚少，為進(jìn)一步研究PHF6在KIRC中的生物學(xué)功能，本研究依據(jù)PHF6 表達(dá)水平的中位數(shù)，對PHF6高表達(dá)組和PHF6低表達(dá)組KIRC 患者的差異基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示，PHF6表達(dá)與體液免疫應(yīng)答、B 細(xì)胞受體信號通路、抗原結(jié)合和補(bǔ)體激活有關(guān)，提示PHF6基因主要富集在免疫相關(guān)通路上，且可能對免疫相關(guān)通路存在促進(jìn)作用；將共同差異基因中PHF6高表達(dá)組的基因提取出來進(jìn)行KEGG 富集分析顯示，PHF6高表達(dá)的KEGG 通路主要集中于膽固醇代謝、白細(xì)胞介素-17 信號通路和類固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通過生物代謝與合成、炎癥反應(yīng)影響免疫調(diào)節(jié)與應(yīng)答，調(diào)節(jié)KIRC 的發(fā)展進(jìn)程。有研究證實(shí)，T細(xì)胞的衰竭是導(dǎo)致KIRC 組織免疫抑制的關(guān)鍵因素，且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[8]。既往研究證實(shí)，ITPR2對衰老和凋亡的觸發(fā)有重要貢獻(xiàn)[14]；PLA2G4A的下調(diào)減弱了腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[15-16]；PTGFR甲基化改變可以將轉(zhuǎn)錄調(diào)控重新定位到腫瘤組織，從而抑制腫瘤進(jìn)展[17]；RSK4與多種腫瘤患者的生存期有關(guān)[18-19]。本研究選取上述基因與PHF6的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，并通過免疫組化方法驗(yàn)證組織微陣列中RSK4 的表達(dá)與PHF6 表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TPR2、PLA2G4A、PTGFR和RSK4均與PHF6的表達(dá)水平呈正相關(guān)，且RSK4 蛋白的表達(dá)與PHF6 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，與正常腎組織相比，PHF6 在KIRC組織中表達(dá)下調(diào)，PHF6 高表達(dá)KIRC 患者的預(yù)后較好，RSK4 的表達(dá)與PHF6的表達(dá)呈正相關(guān)。可以根據(jù)PHF6的表達(dá)水平，對KIRC 患者進(jìn)行干預(yù)，有必要將其作為KIRC 的候選生物標(biāo)志物。