野生茯苓鑒定及其木質纖維素降解酶系研究

覃雯 尹立偉 胡婷 楊春成 武琳 黃祝 胡雅楠

摘 要：為揭示茯苓木質纖維素降解酶系及培養(yǎng)方式對其主要酶系的影響，該研究通過對野生茯苓菌株進行培養(yǎng)特性的顯微觀察，利用3對引物PCR擴增進行系統(tǒng)發(fā)育學的鑒定，經定性培養(yǎng)篩選出優(yōu)勢菌株YX1，采用酶標儀測定不同條件下茯苓纖維素酶、半纖維素酶和木質素降解酶的活力大小。結果表明： （1）茯苓有菌絲體、子實體和菌核3 種形態(tài)特征。（2）PCR分別獲得rDNA－ITS序列1 652 bp、核糖體大亞基序列 660 bp和翻譯延伸因子序列545 bp，提交至 NCBI，登錄號分別為 ON129554、ON129553和 ON155840。（3）纖維素酶和半纖維素酶在有松木屑和無松木屑條件下，外切β－葡聚糖酶（CBH）、內切β－葡聚糖酶（EG）、β－葡萄糖苷酶（BGL）最高分泌量分別為16 ～ 17 U·mL－1、32 ～ 35 U·mL－1、36 ～ 37 U·mL－1；木聚糖酶、甘露聚糖酶和α－葡萄糖苷酶最高分泌量分別為28 ～ 38 U·mL－1、280 ～ 342 U·mL－1、9 ～ 11 U·mL－1；錳過氧化物酶（MnP）、漆酶（laccase）、木質素過氧化物酶（LiP）這3種木質素降解酶在4種不同培養(yǎng)液中均有微弱的酶活性，木質纖維素酶中的酶活性大小依次為甘露聚糖酶>木聚糖酶>BGL>EG>CBH>α－葡萄糖苷酶>LiP>MnP>Laccase，纖維素酶和半纖維素酶酶活性之間存在顯著差異（P<0.05）。綜上表明，該研究結合形態(tài)學與分子鑒定，明確了野生茯苓YX1的分類地位，與褐腐菌在親緣關系上既有聯(lián)系又存在遺傳差距，為茯苓產生木質纖維素降解酶系的降解機制提供了基礎酶學參考。

關鍵詞： 茯苓， ITS序列， 纖維素酶， 半纖維素酶， 木質素降解酶

中圖分類號：Q945.8

文獻標識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0712－11

Abstract：In order to reveal the effects of Wolfiporia cocos lignocellulolytic enzymes and culture methods on its main enzymes， the main lignocellulolytic enzymes of W. cocos were determined in this study. The microscopic observation of the culture characteristics of the wild W. cocos strains was carried out， three pairs of primers were used for PCR amplification to carry out phylogenetic identification， and the dominant strain YX1 was screened by qualitative culture and finally the activities of cellulase， hemicellulase and ligninolytic enzymes under different conditions were determined by microplate reader. The results were as follows：（1） W. cocos had mycelium， fruiting body and sclerotium three morphological characteristics. （2） PCR obtained rDNA－ITS sequence of 1 652 bp， ribosomal large subunit sequence of 660 bp and translation elongation factor sequence of 545 bp， and submitted to NCBI，accession numbers were ON129554， ON129553， and ON155840， respectively. （3） The highest secretion of exo－β－glucanase（CBH）， endo－β－glucanase（EG） and β－glucosidase（BGL） in the presence or absence of sawdust was 16-17 U·mL－1， 32-35 U·mL－1， 36-37 U·mL－1； The maximum secretion of xylanase， mannanase and α－glucosidase was 28-38 U·mL－1， 280-342 U·mL－1， 9-11 U·mL－1. The three ligninolytic enzymes manganese peroxidase （MnP）， laccase， and lignin peroxidase （LiP） had weak enzymatic activities in four different cultures， the magnitude of enzymatic activities in lignocellulases were in the order of mannanase > xylanase > BGL> EG > CBH > α－glucosidase > LiP > MnP > laccase， and there were significant differences between cellulase and hemicellulase enzymatic activities （P<0.05）. In conclusion， this study combines morphological and molecular identification to clarify the taxonomic status of YX1， which has both relationship and genetic gap with brown rot fungi， and provides a basic enzymatic reference for the degradation mechanism of the lignocellulolytic enzymes system produced by W. cocos.

Key words： Wolfiporia cocos， ITS， cellulase， hemicellulase， ligninolytic enzymes

木質纖維素降解酶（lignocellulolytic enzymes）是分解木質纖維素主要的降解酶系，木質纖維素是地球上數(shù)量最為豐富且可再生的自然資源之一，全球每年可產生1.11×1011億t木質纖維素（Tadesse & Luque， 2011），木質纖維素的生物降解是一個涉及眾多酶系參與的高度復雜的過程，可低消耗、低污染、高效率地轉化利用自然界中的生物質能源（Macdonald et al.， 2011；楊立霞等， 2016a），為了更好地利用木質纖維素，國內外學者們開始關注木質纖維素降解酶的研究與應用。

茯苓（Wolfiporia cocos）是一種木材褐腐真菌，又稱玉靈、茯靈、萬靈桂、茯菟等，大多寄生在馬尾松（Pinus massoniana）或赤松（P. densiflora）等樹種的根上（王曉霞， 2012）。木質纖維素酶是多組分的復合酶系統(tǒng)，在降解木質纖維素時起催化作用，既包括與纖維素和半纖維素降解相關的水解酶類，又包括與木質素降解相關的氧化酶類。纖維素酶（cellulase， Cels）是一類能夠水解纖維素的β－D－糖苷鍵并生成葡萄糖的多組分酶的總稱，它們能夠分泌一系列的外切β－葡聚糖酶（exo－β－glucanase， CBH）、內切β－葡聚糖酶（endo－β－glucanase， EG）和β－葡萄糖苷酶（β－glucosidase， BGL）（Okal et al.， 2020）。半纖維素酶（hemicellulase， Hcels）是一個復雜的酶系，主要包括木聚糖酶（xylanase）、甘露聚糖酶（mannanase）和α－葡萄糖苷酶（α－glucosidase）等多種酶（高微微， 2017；Méndez－Líter et al.， 2021）。與木質素降解相關的氧化酶類主要包括錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、漆酶（laccase）等（ Upendra et al.， 2011）。Yoon 和Kim（2015）研究發(fā)現(xiàn)褐腐菌癩擬層孔菌（Fomitopsis palustris）能同時產生3種主要的纖維素酶（內切β－葡聚糖酶、外切β－葡聚糖酶和β－葡糖苷酶），并能降解結晶纖維素。謝君等（2007）報道側耳（Pleurotus sp. 2）和粗毛栓菌（Trametes gallica）在液體培養(yǎng)基中能夠產生很強的木質纖維素降解酶活力且產酶速度較快。安琪等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，在不同碳源、氮源條件下培養(yǎng)金針菇（Flammulina velutiper）對其羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和漆酶活力均有顯著影響。籬邊粘褶菌（Gloeophyllum saepiarium）能分泌淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶、麥芽糖酶、粘膠酶及尿素酶等20多種酶，在一系列復合酶的參與及協(xié)同作用下，將極其復雜的植物細胞壁物質分解為簡單的碳水化合物（Sista Kameshwar & Qin， 2020）。為了更好地開發(fā)與利用茯苓優(yōu)良菌系，探究茯苓木質纖維素復合酶中的主要酶系，探索木質纖維素酶系能夠有效降解木質纖維素資源，加速茯苓菌絲降解速率，縮短菌核形成周期，促進茯苓菌核增產增收，本研究以茯苓為研究對象，研究其木質纖維素復合酶中主要酶系差異及酶活性規(guī)律，擬解決以下兩個問題：（1）茯苓木質纖維素降解酶能否通過最佳培養(yǎng)基及誘導條件產生纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶及各酶類間有何差異；（2）茯苓木質纖維素降解酶能否通過不同底物的誘導來提高產酶能力及影響產酶規(guī)律，以期為今后木質纖維素相關酶的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

野生茯苓（Wolfiporia cocos）菌株于2020年2月，采自安徽省安慶市岳西縣中關鎮(zhèn)請寨村林區(qū)（116°35′ E、30°85′ N）腐朽的松樹樁下茯苓菌核，經分離鑒定后現(xiàn)保存在安慶師范大學動植物檢疫實驗室4 ℃冰箱內，并進行甘油保藏。液體茯苓菌絲YX1保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No：M 2021434。

1.2 培養(yǎng)基

固體PDA 培養(yǎng)基：去皮土豆 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 17 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌 30 min，用于茯苓菌絲的培養(yǎng)。

剛果紅初篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉 2 g，MgSO4·7H2O 1.88 g，KH2PO4 0.5 g，蛋白胨 2 g，瓊脂粉 15 g，定容至 1 000 mL，121 ℃高壓滅菌 30 min后備用，待菌落生長平皿5 cm時，向培養(yǎng)基中加入1 mg·mL－1剛果紅溶液，染色1 h，棄去染液后，加入1 mol·L－1 NaCl溶液，洗滌1 h后觀察結果，此培養(yǎng)基用于纖維素分解菌的定性培養(yǎng)和鑒別。

纖維素酶種子培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g，羧甲基纖維素鈉 10 g，NaCl 5 g，KH2PO4 1 g，用于纖維素酶產酶種子菌搖瓶培養(yǎng)。

纖維素酶產酶培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母膏 15 g，羧甲基纖維素鈉10 g，NaCl 5 g，KH2PO4 1 g，pH =7定容至1 000 mL，用于纖維素酶產酶菌搖瓶培養(yǎng)。

LNAS培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基的制備，根據(jù)4組不同分組需求選擇對應礦質溶液（Kirk et al.， 1978；Hatakka &Uusi－Rauva， 1983 ）。分別為以下4種培養(yǎng)基：不添加MnSO4·H2O的礦物元素溶液（無錳，A）；添加MnSO4·H2O的礦物元素溶液（含錳，B）；添加2 g松木屑的礦物元素溶液（有松木屑，C）；添加2， 6－二甲氧基苯酚的礦物元素溶液（加2，6－DMP，D），用于木質素降解酶的檢測。

1.3序列擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析

提取茯苓基因組DNA，滅菌刀具刮取約20 mg新鮮菌絲，采用細胞破壁儀充分研磨粉末至細胞破壁，按照真菌試劑盒（UNIQ－10柱式）說明書提取茯苓YX1基因組DNA。PCR采用通用引物對（吳悅妮等， 2020），分別為ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCGC

TTATTGATATGC－3′）、 NL1（5′－GCATATCAATAAG

CGGAGGAAAAG－3′） 和NL4 （5′－GGTCCGTGTTTC

AAGACGG－3′）、EF1－688F（5′－CGGTCACTTGATCT

ACAAGTGC－3′）、 EF1－1251R（5′－CCTCGAACTCAC

CAGTACCG－3′）。PCR擴增體系為模板 DNA 0.50 μL，引物10 μmol·L－1 各 1.75 μL，2×Rapid Taq Master Mix 25.00 μL，ddH2O定容至 50.00 μL，以上3種PCR擴增反應條件相同，均為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52～55 ℃退火45 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，終止4 ℃。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收測序，將獲得的YX1序列分別提交至NCBI的GenBank，進行BLAST比對，運用分析軟件MEGA6.1中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（Fan et al.， 2015；張紹剛等， 2021）。

1.4 菌株培養(yǎng)

木質纖維素降解酶系皆采用固體PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待菌絲即將長滿平板時，使用打孔器進行打孔，每瓶種子培養(yǎng)基中含5個孔徑為1 cm菌餅，28 ℃、150 r·min－1于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，纖維素和半纖維素降解酶系測定中，酶液制備皆為待種子培養(yǎng)基內菌絲生長成熟，用移液槍吸取接種至纖維素酶產酶培養(yǎng)基，接種量為每瓶 1.5 mL（鄒榮松， 2019），木質素降解酶系檢測使用分別添加上文1.2項下4種不同底物的LNAS培養(yǎng)基。在超凈工作臺內進行提取培養(yǎng)液即胞外酶液，纖維素酶系持續(xù)吸取至12 d，木質素酶系持續(xù)吸取至 21 d，每次使用移液槍定時定量吸取培養(yǎng)液 1.5 mL，提取的粗酶液離心 13 200 r·min－1，5 min，并進行酶活測定。

1.5 酶活測定

利用酶標儀（Multiskan GO全波長酶標儀）測定310～540 nm波長范圍下酶活力的大小。葡萄糖標準曲線的制作：配制1.0、0.75、0.5、0.25、0 mg·mL－1 葡萄糖標準液。D木糖標準曲線的制作：將10 mg·mL－1 D木糖標準液使用蒸餾水稀釋至1.0、0.8、0.6、0.4、0 mg·mL－1 即為標準稀釋液。酶標儀預熱 30 min 以上，調節(jié)波長至 540 nm，蒸餾水調零。以標準稀釋液為橫坐標（x），以其對應的ΔA標準為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程 y=kx+b，將ΔA 測定帶入公式中得到 x（mg·mL－1）。繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程為 y =0.841 6x - 0.023 6，相關系數(shù) R2 =0.996 5（圖1：A）；繪制 D木糖標準曲線，得到回歸方程為 y =0.683 2x - 0.008 4，相關系數(shù)R2 =0.996 7（圖1：B）。

1.5.1 纖維素酶活力測定 酶標儀檢測外切β－葡聚糖酶（CBH）、內切β－葡聚糖酶（EG）和β－葡萄糖苷酶（BGL）的活性，梯度試驗后最終采用 150 μL反應體系。首先，取粗酶液的量依次為 25、50、50 μL；其次，取各自不同體積底物溶液，檢測CBH所采用的底物溶液為2%微晶纖維素溶液50 μL，檢測EG所采用底物溶液為1%羧甲基纖維素鈉溶液 25 μL，檢測BGL所采用底物溶液為1%水楊苷溶液 25 μL；放入50 ℃恒溫水浴鍋中水浴反應，反應時間各依次為120、30、30 min；再次，加入DNS顯色液均為75 μL；最后，混勻后沸水浴時長均為5 min，冷卻后測定波長在540 nm處的吸光度（高微微， 2017）。酶活單位定義為每分鐘分解特定底物釋放出1 μmol還原糖所需的酶量。采用無松木屑和有松木屑為對照處理，分別檢測第2、第4、第6、第8、第10、第12 d的酶活力，各設置3個重復。

1.5.2 半纖維素酶活力測定 酶標儀檢測木聚糖酶、甘露聚糖酶、α－葡萄糖苷酶活性，梯度試驗最終采用 200 μL 反應體系。首先，取粗酶液的量依次為 67、67、6.7 μL；其次，各取自不同底物溶液，檢測木聚糖酶所采用的底物溶液為0.8%的木聚糖溶液33 μL，檢測甘露聚糖酶所采用底物溶液為0.8%的甘露聚糖溶液 33 μL，檢測α－葡萄糖苷酶所采用底物溶液為0.4%的pNPG溶液 60 μL；50 ℃恒溫水浴鍋中水浴反應時間依次為 30、30、60 min；再次，使反應終止，木聚糖酶、甘露聚糖酶均使用DNS顯色液終止反應，加入DNS試劑100 μL；最后，混勻沸水浴5 min，冷卻后測定波長在 540 nm 處的吸光度（高微微， 2017）。α－葡萄糖苷酶加入1 mol·L－1 Na2CO3溶液66.7 μL終止反應，振蕩混勻后測定波長在 410 nm 處的吸光度。酶活單位定義為每分鐘分解底物所釋放出1 μmol還原糖所需的酶量。采用無木屑和有松木屑為對照處理，分別檢測第2、第4、第6、第8、第10、第12 d的酶活力，各設置3個重復。

1.5.3 木質素降解酶活力測定 酶標儀檢測錳過氧化物酶、漆酶、木質素過氧化物酶活性，梯度試驗后最終采用100 μL反應體系。3種酶分別采用2，6－DMP、藜蘆醇（VA）、ABTS為底物，分別測定吸光度在 470、420、310 nm處1～3 min內的變化值。酶活單位（U）：上述條件下，每分鐘催化 1 μmol 2，6－DMP，ABTS或VA所需的酶量（池玉杰和閆洪波， 2009）。計算中的 ε470=49 600（mol·L－1cm）－1，ε420=36 000（mol·L－1cm）－1，ε310=9 300（mol·L－1cm）－1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，利用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行方差分析并評價其差異顯著性，使用Origin2018進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 茯苓YX1的生物學特性

茯苓YX1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5 d，于光學顯微鏡觀察菌絲的正反面（圖2：A），茯苓菌絲體呈白色絨毛狀，菌絲直徑 2～5 μm，菌絲光滑無色，多分支，有橫隔膜，偶見鎖狀聯(lián)合（圖2：B）。菌絲生命力旺盛5～7 d可長滿平皿，轉移至光照培養(yǎng)箱中，進行光暗交替培養(yǎng)，28 d后菌絲衰退呈褐色，子實體呈蜂窩狀，平鋪聚集群生（圖2：C）。茯苓YX1菌核（140～150）mm ×（170～180）mm，呈不規(guī)則橢球形等，深褐色、大小不均勻、表面粗糙呈瘤狀皺縮、有彈性生命力強，菌核內部呈白色粉質顆粒狀，質軟，易撕開，菌核晾干后含水率15%～18%，堅硬易破裂（圖2：D）。

2.2 茯苓YX1的3條序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

茯苓YX1的PCR產物測序分別得到1 652、660、545 bp的核苷酸序列，將該序列提交到GenBank（NCBI 登錄號分別為：ON129554、ON129553、ON155840。鑒定結果表明，茯苓YX1（ON129554）的rDNA－ITS序列為1 652 bp：1～5 bp為18S rRNA序列，6～1 005 bp為ITS1序列，1 006～1 167 bp為5.8S rRNA序列，1 168～1 626 bp為ITS2序列，347～508 bp為28S rRNA序列；茯苓YX1（ON129553）核糖體大亞基（large subunit，LSU）序列為1～660 bp；茯苓YX1（ON155840）翻譯延伸因子（translation extension factor， TEF）的CDS編碼序列共545 bp分別為1～129 bp、179～320 bp、380～545 bp，根據(jù)3條茯苓YX1序列，采用MEGA 6.1 軟件構建褐腐菌系統(tǒng)發(fā)育樹，運用NJ聚類法分析，從圖3中可知，系統(tǒng)發(fā)育樹分為內部轉錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）、LSU、TEF三部分序列，茯苓菌YX1與 22 個茯苓菌株都較為親密并聚類在一起，而Pachyma hoelen、Wolfiporia cocos、Poria cocos和Macrohyporia cocos 是茯苓菌的同物異名菌株。茯苓菌種間的遺傳距離最為接近，4個同物異名的茯苓ITS、LSU、TEF序列聚類在一起，另外3株褐腐菌樺剝管菌（Piptoporus betulinus） Pt－2、277、12 388菌株為外組群菌株為參照，分別與茯苓菌ITS、LSU、TEF的區(qū)間序列既有同源又有差距。在系統(tǒng)發(fā)育樹上區(qū)分了茯苓ITS序列、LSU序列、TEF序列，它們之間又有遺傳聯(lián)系且NCBI中同源性達90%以上，可以明確岳西野生茯苓菌YX1就是茯苓屬下的茯苓菌株。

2.3 茯苓木質纖維素酶的酶活

2.3.1 纖維素酶活檢測結果

茯苓菌在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下，檢測YX1纖維素酶中β－葡萄糖苷酶（BGL）和內切β－葡聚糖酶（EG）的酶活相當，變化范圍在32 ～ 37 U·mL－1之間，而外切β－葡聚糖酶（CBH）變化范圍在16 ～ 17 U·mL－1之間（圖4）。由圖4可知，在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下2 d時CBH酶活性最大值分別為14.48 U·mL－1和15.87 U·mL－1，第4天酶活性最大值分別為16.71 U·mL－1和16.82 U·mL－1；EG第2天酶活性最大值分別為32.6 U·mL－1和29.35 U·mL－1，第8天有松木屑酶活性達到最大值34.71 U·mL－1，而無松木屑的培養(yǎng)方式第12天酶活性達到最大值32.245 U·mL－1；BGL在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下第2天時酶活性分別為33.03 U·mL－1和30.46 U·mL－1，第8天時有松木屑酶活性達到最大值36.81 U·mL－1，逐漸降低，而無松木屑的培養(yǎng)方式第10天酶活性達到最大值36.7 U·mL－1。從纖維素酶的整體酶活對比來看，CBH

方差分析表明茯苓3種纖維素酶CBH、EG和BGL活性在有松木屑和無松木屑培養(yǎng)方式和培養(yǎng)時間上表現(xiàn)為顯著差異（P<0.05），其中的3種酶之間存在極顯著差異（P<0.001）；在主體間效應的檢驗中，3種酶均值分別為14.51、30.71、33.33 U·mL－1，培養(yǎng)方式F=5.53和培養(yǎng)時間F=2.62，均達到顯著差異，3種酶F=127.53，均達到極顯著差異（表1）。

2.3.2 半纖維素酶活檢測結果 茯苓菌在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下，檢測YX1半纖維素酶中甘露聚糖酶活性分泌量最高，變化范圍在280 ～ 342 U·mL－1之間，木聚糖酶變化范圍在28 ～ 38 U·mL－1之間，α－葡萄糖苷酶變化范圍在9 ～ 11 U·mL－1之間（圖5）。 由圖5可知，在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下第2天時木聚糖酶活最大值分別為 20.89 U·mL－1和 19.24 U·mL－1；第8天時酶活分別達到酶活性最大值，分別為37.31 U·mL－1和 28.79 U·mL－1；第10天酶活性最大值分別為 21.9 U·mL－1 和 15.37 U·mL－1。甘露聚糖酶在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下第2天酶活性分別為 275 U·mL－1和 217.49 U·mL－1；第8天時均達到酶活性最大值，分別為341.28 U·mL－1和280.74 U·mL－1；第10天酶活性最大值分別為272.04 U·mL－1和229.09 U·mL－1。α－葡萄糖苷酶在有松木屑和無松木屑2種培養(yǎng)方式下第2天，酶活性分別為9.23 U·mL－1和8.84 U·mL－1；第8天時酶活性最大值分別為10.66 U·mL－1和9.88 U·mL－1；第10天酶活性8.84 U·mL－1和8.77 U·mL－1。實驗表明各個酶活力之間存在變化差異，從半纖維素酶的整體酶活對比來看，α－葡萄糖苷酶<木聚糖酶<甘露聚糖酶活性。

方差分析表明茯苓3種半纖維素酶木聚糖酶、甘露聚糖酶和α－葡萄糖苷酶活性在有松木屑和無松木屑2種的培養(yǎng)方式上表現(xiàn)為顯著差異（P<0.05），培養(yǎng)時間表現(xiàn)為極顯著差異（P<0.001），其中3種酶之間存在極顯著差異（P<0.001），在主體間效應的檢驗中，3種酶均值分別為22.94、270.70、9.29 U·mL－1，培養(yǎng)方式F=5.53和培養(yǎng)時間F=2.62均達到顯著差異，3種酶F=127.53均達到極顯著差異（表2）。

2.3.3 木質素降解酶活檢測結果

茯苓菌在4種不同底物的培養(yǎng)條件下，檢測YX1錳過氧化物酶（MnP）酶活性變化范圍在0 ～ 0.1 U·mL－1之間，在培養(yǎng)條件A下，提取的酶液檢測到第15天的MnP酶活性為0.015 U·mL－1；在培養(yǎng)條件B下，提取的酶液檢測到第 15天達到MnP最高酶活性為0.081 U·mL－1；在培養(yǎng)條件C下，提取的酶液檢測到第15天的MnP酶活性為0.027 U·mL－1，達

到分泌高峰；在培養(yǎng)條件D下，提取的酶液檢測到第21天的MnP酶活性雖然達到分泌高峰，但只有0.025 U·mL－1；對比A無Mn2+和B含Mn2+兩種培養(yǎng)條件的結果表明，雖然MnP受到Mn2+的影響，但MnP酶活性變化不大，均在第15天達到分泌高峰；Mn2+是茯苓菌產生MnP的誘導因子之一，MnP酶活性變化規(guī)律一致；對比C有松木屑和對照組A無Mn2+相比較，受松木屑影響不明顯；加2，6－DMP培養(yǎng)條件D，在21 d內MnP酶活性規(guī)律不明顯，21 d之后有松木屑培養(yǎng)條件C和加 2，6－DMP 培養(yǎng)條件D仍然存在MnP酶的活性變化。21 d內茯苓菌4種培養(yǎng)條件產生MnP的情況見圖6。

茯苓菌在4種不同底物的培養(yǎng)條件下，檢測YX1漆酶（Laccase）酶活性變化范圍在0 ～ 0.04 U·mL－1之間。在培養(yǎng)條件A下，提取的酶液檢測到第 19天 的 Laccase酶活性為0.031 U·mL－1；在培養(yǎng)條件B下，提取的酶液檢測到第7天達到 Laccase 最大酶活性為0.033 U·mL－1；在培養(yǎng)條件C下，提取的酶液檢測到第9天的 Laccase酶活性為0.025 U·mL－1；在培養(yǎng)條件D下，提取的酶液檢測到第9天的Laccase酶活性只有 0.029 U·mL－1；對比A無Mn2+和B含Mn2+兩種培養(yǎng)條件的結果表明，Mn2+對產生茯苓菌Laccase沒有太大變化；對比4種不同底物 Laccases 的酶活性均較小，并且 Laccase 酶活性變化規(guī)律不明顯。21 d內茯苓菌在4種培養(yǎng)條件產生 Laccases 的情況見圖7。

YX1在4種不同底物的培養(yǎng)條件下，檢測木質素過氧化物酶（LiP）酶活性變化范圍在0 ～ 0.2 U·mL－1。在培養(yǎng)條件A下，提取的酶液檢測到第21天的LiP酶活性為0.023 U·mL－1；在培養(yǎng)條件B下，檢測到第11天達到LiP最大酶活性為0.109 U·mL－1；在培養(yǎng)條件C下，檢測到第7天的LiP酶活性為0.104 U·mL－1；在培養(yǎng)條件D下，檢測到第19天的LiP酶活性只有0.067 U·mL－1；對比A無Mn2+和B含Mn2+兩種培養(yǎng)液的檢測結果表明，Mn2+并非產生LiP的主要因素；雖然Mn2+有影響LiP酶活性變化，但比較微弱，對比4種不同底物LiP酶活性都比較小且LiP酶活性變化規(guī)律不明顯。21 d內茯苓菌在4種培養(yǎng)液中產生LiP的情況見圖8。

3 結論與討論

3.1 野生茯苓鑒定

本研究以野生茯苓YX1為研究對象，從團聚的菌絲培養(yǎng)來看，菌絲有隔膜、偶見鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，茯苓菌核也為茯苓菌絲團的一個休眠體。新鮮的菌核切開后茯苓肉為白色，也可作為母種或栽培種的結苓肉引。結合分子生物學的鑒定，選取ITS、LSU、TEF序列擴增，分析PCR產物，YX1與樺剝管菌Pt－2、277、12388菌株同為褐腐菌，在親緣關系上既有聯(lián)系又有遺傳差距。茯苓（Pachyma hoelen）、Wolfiporia cocos、Poria cocos和Macrohyporia cocos 有4種同物異名，在系統(tǒng)發(fā)育中它們之間聯(lián)系緊密，依據(jù)2008年《菌物字典》第十版（Kirk et al.， 2008）及參照最新編制八界系統(tǒng)的菌物分類學，茯苓YX1（Wolfiporia cocos），隸屬于擔子菌門（Basidiomycota），蘑菇亞門（Agaricomycotina）蘑菇綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），擬層孔菌科（Fomitopsi－daceae），茯苓屬（Wolfiporia），茯苓（W. cocos）。

3.2 茯苓產纖維素酶和半纖維素酶

本研究前期對茯苓菌產纖維素酶做了定性培養(yǎng)，存在明顯的透明圈現(xiàn)象，篩選出的YX1具有降解木質纖維素的能力，并作為定量培養(yǎng)研究菌株YX1進行木質纖維素酶活性的測定。研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和半纖維素酶在有松木屑和無松木屑為底物條件下，具有趨于一致的變化規(guī)律。培養(yǎng)方式中無松木屑對照組與有松木屑為底物的實驗組相比，除CBH以外，EG、BGL均表現(xiàn)為有松木屑實驗組高于無松木屑對照組，從纖維素酶活力之間對比來看，纖維素酶中CBH

3.3 茯苓產木質素降解酶

茯苓是褐腐菌，主要產生纖維素酶和半纖維素酶，也能產生微弱的木質素降解酶活性。茯苓木質素降解酶中除Laccase之外，MnP和LiP均表現(xiàn)為有松木屑實驗組高于無松木屑對照組，實驗表明添加Mn2+和松木屑為培養(yǎng)底物能夠起到誘導作用。Chi等（2007）研究蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）、平菇（Pleurotus ostreatus）和透明亞臥孔菌（Physisporinus rivulosus）等真菌共培養(yǎng)條件時MnP酶活性，在7 d 之后檢測到MnP活性達到最高，幾種不同培養(yǎng)方式下所取得的MnP酶活性范圍為25～250 U·mL－1，與前人研究結果相比，茯苓產MnP酶活性比較微弱，4種培養(yǎng)方式最高酶活性僅為0.081 U·mL－1。茯苓Laccase培養(yǎng)方式A和B相對比，培養(yǎng)方式B提前達到分泌高峰，但受到Mn2+的影響不大；培養(yǎng)方式C和D，同是第9天達到分泌高峰，與培養(yǎng)方式A無Mn2+相比較，不受松木屑所影響。池玉杰和閆洪波（2009）研究紅平菇4種培養(yǎng)方式Laccase酶活性變化范圍為36～205 U·L－1，在含Mn2+和無Mn2+條件下的酶活性分泌情況，與本研究結果基本一致，說明Laccase酶活性分泌規(guī)律不明顯，整體呈波動性變化，相比較茯苓Laccase酶活性都比較微弱，僅為0.025～0.032 U·mL－1。LiP培養(yǎng)方式A和B相對比，LiP受到Mn2+的影響，并且提前達到分泌高峰；培養(yǎng)方式C，第7天就達到分泌高峰，與培養(yǎng)方式A比較，結果表明以松木屑為底物是LiP誘導條件之一；培養(yǎng)方式D，第19天的LiP酶活性達到分泌高峰。王茂成（2013）研究黑木耳、靈芝、灰樹花和J201真菌LiP酶活性均在第9天達到最高，分別為121.6、143.5、111.6、145.2 U·mL－1，產酶規(guī)律都是以逐漸升高又逐漸降低，達到高峰后仍有產酶能力，這與本研究產LiP含Mn2+和有松木屑的培養(yǎng)方式分泌規(guī)律相似，不同之處是達到最大產酶時間，相比較茯苓產LiP酶活性都比較微弱，酶活性僅為0.017～0.109 U·mL－1。從茯苓木質素降解酶活力之間對比來看，木質素降解酶中LiP>MnP>Laccase。由于茯苓產生比較微弱的木質素降解酶，故未對MnP、Laccase和LiP 3種酶活性結果做進一步方差分析。從木質纖維素酶活力之間對比來看，木質素降解酶<纖維素酶<半纖維素酶活性。整體而言，以上結果表明茯苓菌具有分泌木質纖維素酶的能力，作為褐腐菌的茯苓僅僅只有微弱的木質素酶活性，多種酶之間均存在顯著性差異（P<0.05）。

綜上所述，野生茯苓菌的形態(tài)特征與分子生物學鑒定相結合，明確了茯苓的分類地位，揭示其木質纖維素酶系統(tǒng)的主要酶系及與培養(yǎng)條件等之間的聯(lián)系，因此，該菌株可作為候選菌株進行深入研究。纖維素酶中CBH在培養(yǎng)初期時酶活性達到最大量，半纖維素酶中α－葡萄糖苷酶在培養(yǎng)初期時酶活性達到最大量，而木質素降解酶中的MnP和LiP在培養(yǎng)后期達到分泌最大量。茯苓菌不斷的分泌纖維素酶和半纖維素酶較多，分解前期過程中起到主導因素，而木質素降解酶為次要因素。呂聰（2008）研究發(fā)現(xiàn)，茯苓分離純化出2種MnPI和MnPⅡ同工酶，優(yōu)化后的MnP酶活性高達1 249.7 U·mL－1。因此，后期提高茯苓菌木質纖維素酶的產酶效率，仍需進一步對產酶培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。另外，本研究結果表明木質纖維素降解酶活力的大小差距可能與菌種特性、培養(yǎng)方式及誘導因素等條件有關，木質素降解酶的整體酶活性都較低，這可能與本研究采用限氮培養(yǎng)基、酶標儀檢測的敏感性以及褐腐菌茯苓菌本身的生長特性、菌核形成周期有關。本研究結果還表明，茯苓產木質纖維素酶中的酶活性大小依次為甘露聚糖酶>木聚糖酶>BGL>EG>CBH>α－葡萄糖苷酶>LiP>MnP>Laccase。從分解木質纖維素組成結構來看，除木質纖維素酶外，茯苓菌可能還含有豐富的其他輔助酶系，它們以多種酶相互協(xié)同參與木質纖維素的降解機制，催化茯苓菌絲不斷地聚集，吸收基內、基外的營養(yǎng)，最終形成團聚的菌核，這些推測都有待進一步研究。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）