膀胱癌組織miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)及其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

楊海北,王衛(wèi)生,桂俊卿,徐躍文,崔茂榮,張超,劉志明

膀胱癌(bladder cancer,BC)發(fā)病率和病死率較高,是全球最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,分為非肌層浸潤性(NMIBC,75%,T1)和肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC,25%,T2～T4)[1-2]。BC易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、早期無明顯癥狀的特點使其在臨床中診斷困難,導(dǎo)致BC患者的診斷、治療被延誤,生存率和預(yù)后較差[3-5]。因此,尋求與BC相關(guān)的生物標(biāo)志物對其早期診斷和預(yù)后十分重要。MicroRNA(miRs)的異常表達(dá)與腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移等生物學(xué)進(jìn)展有關(guān),據(jù)報道,miR-20a-5p在腫瘤發(fā)生中起復(fù)雜作用[6-7]。此外,核受體亞家族4成員3(NR4A3)的下調(diào)也被發(fā)現(xiàn)與髓系白血病中分化狀態(tài)受損有關(guān)[8]。miR-20a-5p、NR4A3在BC中表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系未見報道。因此,本試驗對其進(jìn)行研究,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年12月—2019年1月曲靖市第一人民醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療BC患者30例,收集其膀胱癌組織及相應(yīng)的癌旁組織,其中男11例,女19例,年齡35～68(52.44±7.94)歲,組織病理學(xué)分級按WHO標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ～Ⅱ級10例,Ⅲ級20例;臨床分期基于UICC-TNM標(biāo)準(zhǔn)[9]:Ⅰ～Ⅱ期13例,Ⅲ～Ⅳ期17例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2016-1109003),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后病理診斷為BC[10];②患者無化療及其他治療史;③患者的臨床病理資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①患其他免疫系統(tǒng)或其他惡性腫瘤者;②有肝腎功能障礙及尿石癥、腺性膀胱炎反復(fù)發(fā)作者;③有嚴(yán)重心臟疾病及認(rèn)知功能損傷者;④患有感染性疾病者。BC的病理類型由2位經(jīng)驗豐富的病理學(xué)醫(yī)生獨立診斷。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-20a-5p、NR4A3表達(dá):使用NanoDrop 1000(Thermo Scientific,USA)從處于凍存狀態(tài)病變組織(手術(shù)時收集)中提取總RNA,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。計算A260/A280比率以評估RNA質(zhì)量和純度。在推薦的熱循環(huán)設(shè)置下,使用ABI 7300(ABI,Foster City,CA,USA)進(jìn)行qRT-PCR分析,步驟如下:95℃初始循環(huán)30 s,然后95℃ 30 s 、58℃ 30 s 、72℃ 30 s ,共40個循環(huán)。分別以U6、β-actin為內(nèi)參。基因相關(guān)序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后miR-20a-5p、NR4A3 mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 基因引物序列

1.3.2 隨訪情況:隨訪起點為手術(shù)開始時,終點為2022年1月,進(jìn)行為期3年的術(shù)后隨訪。術(shù)后通過電話訪問、門診復(fù)查等方式對所有患者進(jìn)行隨訪,全部病例無失訪,記錄患者生存情況。

2 結(jié) 果

2.1 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌組織和癌旁組織中表達(dá)比較 與癌旁組織比較,BC癌組織的miR-20a-5p水平上升,NR4A3水平下降(P<0.01),見表2。

表2 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌組織和癌旁組織表達(dá)比較

2.2 BC癌組織中miR-20a-5p與NR4A3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示,BC癌組織中miR-20a-5p與NR4A3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.599,P<0.001)

2.3 miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)在BC患者不同臨床病理參數(shù)中比較 病理Ⅲ級、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移BC患者miR-20a-5p表達(dá)高于病理Ⅰ～Ⅱ級、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05);病理Ⅲ級、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NR4A3表達(dá)低于病理Ⅰ～Ⅱ級、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);BC患者miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)在性別、年齡、吸煙史、肌層浸潤、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量等方面比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

2.4 miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)與BC患者預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)過3年隨訪,30例BC患者死亡11例,生存19例,總生存率為63.33%。miR-20a-5p高表達(dá)者3年生存率為47.06%(8/17),低于低表達(dá)者的84.62%(11/13),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.474,P=0.034);NR4A3低表達(dá)者3年生存率為37.50%(6/16),低于高表達(dá)者的92.86%(13/14),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.853,P=0.002),見圖1。

2.5 BC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 以BC患者預(yù)后為因變量,以病理分級(Ⅰ～Ⅱ級=0,Ⅲ級=1)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0,有=1)、miR-20a-5p(具體值)、NR4A3(具體值)為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,miR-20a-5p高表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.01),見表4。

3 討 論

BC是泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,它在我國的發(fā)病率和病死率非常高,其患病率在發(fā)達(dá)國家甚至全世界都在上升[11-12]。2020年美國估計有81 400例新發(fā)病例和17 980例BC患者死亡,BC通過膀胱壁浸潤深度的測量可分為NMIBC和MIBC[13]。目前BC的診斷和監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)方法為膀胱鏡檢查,但膀胱鏡檢查的敏感度較低,不但易引起排尿困難和尿路感染等并發(fā)癥,還會造成漏診的情況[14]。此外,BC的異質(zhì)性和易復(fù)發(fā)的特點也給BC的臨床診斷增加了困難,導(dǎo)致預(yù)后較差[10]。因此,尋找與BC關(guān)系密切的生物標(biāo)志物對其早診斷、早治療,以期提高BC患者生存率和改善預(yù)后情況。

表3 miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)在BC患者不同臨床病理參數(shù)中比較

圖1 BC癌組織miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)與患者3年總生存率的關(guān)系

表4 影響B(tài)C患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

miRNA是小的、非編碼的單鏈RNA分子,長度約為22個核苷酸,它們與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′ UTR)互補結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯,而miRNA失調(diào)與腫瘤生長、耐藥性和轉(zhuǎn)移有關(guān),使其成為不同癌癥的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[15]。miR-17-92簇位于13號染色體上MIR17HG(C13orf25)的內(nèi)含子中,包括6個成員:miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡[15]。既往研究發(fā)現(xiàn),miR-20a-5p是一種致癌基因,在前列腺癌、甲狀腺癌中,其高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[16-17]。本試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論,即miR-20a-5p高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移有促進(jìn)作用,從而進(jìn)一步促進(jìn)BC的發(fā)展。這也與既往實驗中外源性miR-20a-5p過表達(dá)促進(jìn)BC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的結(jié)果一致[10]。此外,miR-20a-5p高表達(dá)患者生存率顯著低于低表達(dá)患者,進(jìn)一步通過Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),miR-20a-5p高表達(dá)是BC預(yù)后的獨立危險因素,在Stoen等[16]在前列腺癌的實驗中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。提示miR-20a-5p未來可能作為BC預(yù)后生物標(biāo)志物。

NR4A3也稱為神經(jīng)元衍生的孤兒受體1(NOR1),是孤兒核受體家族的成員,NR4A3是一種新的腫瘤抑制基因,其表達(dá)在腫瘤中下調(diào),NR4A3的上調(diào)表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Son等[19]發(fā)現(xiàn)在激素療法聯(lián)合放療后,A549肺癌細(xì)胞中NR4A3水平升高,NR4A3可通過提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。Lin等[20]研究也表明,NR4A3維持MT-2信號傳導(dǎo)以抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,并通過促進(jìn)p21和PAI-1表達(dá)作為TGF-β/Smad2信號通路抑制腫瘤。這與本試驗中NR4A3在BC腫瘤組織中的降低趨勢及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的結(jié)果一致。此外,Fan等[21]也發(fā)現(xiàn),NR4A3在BC中表達(dá)下調(diào),對BC細(xì)胞增殖和干性有抑制作用,進(jìn)一步驗證了本研究結(jié)果。本試驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-20a-5p是NR4A3的靶基因,二者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。這與Zhao等[22]認(rèn)為miR-20a可通過靶向NR4A3促進(jìn)DRG神經(jīng)元的軸突再生,以及Yang等[10]在BC實驗中表明,miR-20a-5p可以靶向NR4A3,即miR-20a-5p通過抑制抑瘤基因NR4A3的表達(dá)促進(jìn)BC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移結(jié)果一致。以上結(jié)果顯示,miR-20a-5p通過負(fù)靶向NR4A3來參與BC疾病的發(fā)生、發(fā)展。但miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)水平在BC中的發(fā)病機制尚不明確,本研究僅分析了BC患者癌組織中miR-20a-5p、NR4A3表達(dá)水平與其臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,其具體機制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,BC癌組織中miR-20a-5p表達(dá)水平升高,NR4A3表達(dá)水平降低,與BC病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān),其中miR-20a-5p為BC預(yù)后的獨立危險因素,且miR-20a-5p通過負(fù)靶向調(diào)控NR4A3參與BC疾病的發(fā)生、發(fā)展。然而本研究僅將BC組織作為研究樣本,未能選取血清等其他樣本檢測驗證,且樣本量較小,試驗結(jié)果存在局限性,后期可進(jìn)一步使用大樣本血清對其具體機制進(jìn)行研究,對臨床中BC的診療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊海北、王衛(wèi)生:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;桂俊卿、徐躍文:進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;崔茂榮、張超:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉志明:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核