NT-3對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育的調(diào)控機制研究進展

王雪艷 侯書樂 金永德 孫蓮花 賈彥均 權海燕 金玉蓮,*審校：楊軍

1 延邊大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(延吉 133000）

2 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科;上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所;上海耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室(上海 200092）

3 青島市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(青島 266000）

4 延邊大學附屬醫(yī)院中心實驗室(延吉 133000）

耳蝸螺旋神經(jīng)元（spiral ganglion neurons,SGN）的發(fā)育需要各類神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)控，其中神經(jīng)營養(yǎng)素3（neurotrophin-3,NT-3）有著舉足輕重的作用。NT-3 通過原肌球蛋白相關激酶C（tropomyosin receptor kinase C,TrkC）和p75 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（neurotrophin receptor,p75NTR）相關的信號通路發(fā)揮促進細胞存活、突觸可塑性、改變神經(jīng)支配模式和再生髓鞘的作用，并且修復和逆轉(zhuǎn)SGN發(fā)育過程中的損傷[1-3]。本文就NT-3 在SGN 發(fā)育中作用機制的研究進展綜述如下。

1 NT-3在SGN發(fā)育中的作用

SGN 的發(fā)育過程依賴于多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的協(xié)同或拮抗作用，包括神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）、腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）、NT-3 和神經(jīng)營養(yǎng)素4/5（neurotrophin-4/5,NT-4/5）等。研究發(fā)現(xiàn)敲除NT-3 基因的小鼠中SGN 的數(shù)量約減少了85%，因此認為NT-3 是SGN 發(fā)育中重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它主要來源于健康耳蝸內(nèi)的毛細胞（hair cell,HC）和支持細胞（sertoli cells,SCs）[4]。其中SCs 中的NT-3 是維持SGN 存活和正常生理功能的關鍵因子，而HC中的NT-3 可以增加突觸的密度。無論是SCs 源性還是HC 源性的NT-3，二者主要在耳蝸中發(fā)揮作用[5]。但NT-3 在耳蝸中如何分布，有待進一步研究。研究顯示：當敲除SCs 源性NT-3 基因時，耳蝸基底部傳入神經(jīng)纖維的數(shù)量減少，因此，NT-3分布于耳蝸基底部高頻區(qū)域的可能性較大；但是用β-半乳糖苷酶標記法探討NT-3 分布的研究卻發(fā)現(xiàn)，NT-3的梯度由頂回到低回逐漸降低[6]。

NT-3 參與SGN 發(fā)育的多個過程。SGN 來源于聽基板（otic placode）和神經(jīng)管，但以聽基板為主要來源[7]。聽基板為外胚層區(qū)域增厚的部分。在胚胎發(fā)育早期，該區(qū)域發(fā)生內(nèi)陷形成聽杯（otic cup），而聽杯繼續(xù)凹陷并從上皮細胞分離逐漸形成由假復層柱狀上皮包裹的囊泡狀結(jié)構(gòu)，即耳囊（otocyst/otic vesicle）。耳囊前腹側(cè)部分細胞發(fā)生遷移形成耳蝸-前庭神經(jīng)節(jié)（cochleo-vestibular ganglion,CVG），CVG 神經(jīng)母細胞遷移到蝸管的底部，為SGN 的發(fā)育做準備。在這個過程中NT-3參與了SGN的遷移和定位[8]。出生后12日（P12），Ⅰ型SGN 神經(jīng)纖維發(fā)生突觸修剪并與內(nèi)毛細胞（inner hair cells,IHC）建立成熟的突觸聯(lián)系，標志著聽力開始形成。此時主要是高水平的NT-3 誘導早期聽力的獲得[9]。出生后3 周（3W），Ⅱ型SGN 與外毛細胞（outer hair cell，OHC）建立成熟穩(wěn)定的突觸聯(lián)系，聽功能發(fā)育基本成熟。到成年時期，NT-3對噪音、耳毒性藥物和年齡相關性聽力損失，均有SGN損傷后的保護作用，因此NT-3 在成熟的突觸結(jié)構(gòu)中也發(fā)揮其生物學效應[10]。綜上所述，自胚胎期到成年期，NT-3 在耳蝸中持續(xù)表達，不同時期參與不同的生物學過程，從而維持著SGN的正常發(fā)育與損傷后的修復。Jin 等[9]對P0、P5 和P20 三個時期SGN 進行體外細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別添加NT-3、BDNF、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF），NT-3 組、BDNF 組、NT-3+BDNF 組和NT-3+BDNF+LIF 組作為實驗組，與未添加任何神經(jīng)營養(yǎng)因子作為對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在P0 和P5 期，三種神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合使用組（NT-3+BDNF+LIF組）的SGN的存活率明顯高于單獨使用神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT-3 組和BDNF 組）或聯(lián)合使用兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子組（NT-3+BDNF組）；而在P20 期，單獨使用神經(jīng)營養(yǎng)因子組（NT-3 組和BDNF 組），SGN 的存活率高于兩種營養(yǎng)因子聯(lián)合(NT-3+BDNF 組)或三種神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合使用組（NT-3+BDNF+LIF 組），從而證實了SGN 在耳蝸的發(fā)育早期高度依賴外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，且在發(fā)育后期對NT-3 的依賴性更加突出。在此基礎上，又進行體內(nèi)實驗[11]，利用Ad-GFP 作為NT-3的載體注入到P5期大鼠耳蝸鼓階中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P10、P15、P20期大鼠耳蝸底回、中回和頂回的NT-3mRNA表達水平明顯高于正常組，且范圍逐漸擴大到神經(jīng)纖維和血管紋，進而在SGN 內(nèi)發(fā)揮廣泛作用；與同期未轉(zhuǎn)染NT-3的大鼠相比，轉(zhuǎn)染后的大鼠ABR閾值降低。因此，在SGN 發(fā)育早期及時補充外源性NT-3 可以有效避免因其不足導致的聽力損失。

目前體內(nèi)實驗[12,13]和體外實驗[11,14,15]的研究已證實NT-3 加速SGN 軸突的延伸速度，并促進SGN 數(shù)量和密度的增加[16]，但其作用機制尚不清楚，下文中將從受體和信號通路闡述其在SGN 發(fā)育中的作用機制。

2 NT-3促進SGN發(fā)育的機制

HC 和SCs 產(chǎn)生的NT-3 經(jīng)軸突運送到SGN 后，與酪氨酸激酶受體TrkC 和p75NTR 結(jié)合發(fā)揮生物學作用。TrkC 與p75NTR，與SGN 的結(jié)合方式不同，TrkC 與SGN 特異性結(jié)合，p75NTR 與SGN 非特異性結(jié)合。TrkC 是NT-3 濃度依賴性受體，當缺乏NT-3時，TrkC被半胱氨酸酶切割發(fā)揮促凋亡作用；但當NT-3 充足時，TrkC 受體促進SGN 分化發(fā)育的作用掩蓋了p75NTR的促凋亡作用[17]。TrkC受體通過RAS-絲裂原激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK1/2）-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）信號通路和磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）信號通路，將信息傳遞到細胞內(nèi)，從而調(diào)控SGN的發(fā)育。

p75NTR 的存在增強了NT-3 與TrkC 結(jié)合的特異性，當缺乏TrkC 受體時，NT-3 通過p75NTR 誘導細胞凋亡；除此之外，p75NTR也具有促進神經(jīng)細胞增殖和突觸生長的作用[18]。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p75NTR在耳蝸神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達，主要是在雪旺細胞，而在SGN的胞體和突觸中未見表達，因此p75NTR在SGN中，可能是通過形成髓鞘從而起到保護作用，其參與的信號通路可能是為NT-3/p75NTR/應激活化蛋白激酶（JNK）通路和NT-3/p75NTR/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路。

2.1 TrkC介導的信號通路

2.1.1 RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路

RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的亞家族之一，其作用是將細胞外的信號逐級放大并傳遞到細胞核，再通過轉(zhuǎn)錄因子完成各種生命活動。當NT-3 與TrkC 受體結(jié)合后，TrkC 受體發(fā)生二聚化導致自身激活發(fā)生自身的磷酸化，為下游信號蛋白提供錨定位點，GRB2-SOS 復合物與激活后的受體結(jié)合后導致Ras蛋白由結(jié)合二磷酸鳥苷（GDP）轉(zhuǎn)為結(jié)合三磷酸鳥苷（GTP）而自身活化，將胞漿中的Raf 蛋白募集到質(zhì)膜上，并誘導其構(gòu)象的改變。激活后的Raf 并逐級磷酸化MEK1/2 和ERK1/2。ERK1/2 平時位于胞質(zhì)內(nèi)，當被激活后進入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子活化，活化后的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA 上啟動下游靶基因的表達，實現(xiàn)生理功能；除此之外，活化后的ERK1/2 也可以磷酸化胞質(zhì)和核內(nèi)的激酶[19]。SGN 體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，NT-3 通過RASMEK1/2-ERK1/2 信號通路促進SGN 發(fā)育。下面將從細胞遷移、細胞分化發(fā)育和細胞凋亡三個階段，闡述NT-3 通過TrkC 受體經(jīng)RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路對SGN發(fā)育的作用機制（圖1）。

在神經(jīng)元發(fā)育過程中，NT-3 可能與TrkC 受體結(jié)合，通過RAS-MEK1/2-ERK1/2 信號通路，參與了神經(jīng)元的遷移。Yamauchi等[20]認為NT-3 增強了TrkC 受體磷酸化Dbs的能力，誘導了周圍神經(jīng)系統(tǒng)中雪旺細胞的遷移。沿SGN 纖維分布的雪旺細胞表達NT-3，因此雪旺細胞為SGN的再生帶來可能。Hossain 等[8]認為起源于神經(jīng)嵴的SGN 從聽泡遷出后緊貼著耳蝸上皮自蝸底沿著蝸管向頂端延伸，其軸突穿透上皮并發(fā)生修剪，與HC建立連接，在這個過程中NT-3參與了SGN的遷移和定位。因腎小球足細胞表達神經(jīng)元標志性蛋白，所以被用作神經(jīng)元研究的替代物，研究發(fā)現(xiàn)NT-3 通過激活TrkC 經(jīng)ERK 通路增加了足細胞的遷移，因此推測NT-3 可能與TrkC 受體結(jié)合通過RAS-MEK1/2-ERK1/2 信號通路參與SGN的遷移。

除此之外，NT-3 與TrkC 受體結(jié)合通過RASMEK1/2-ERK1/2 信號通路促進神經(jīng)元分化發(fā)育。Kevin 等[21]研究發(fā)現(xiàn)MIAMI（marrow isoled adult multilineage inducible）細胞在體外具有分化為多種神經(jīng)元細胞的潛能，分化后的神經(jīng)元細胞表達βIII-微管蛋白神經(jīng)元標志物和具有成熟神經(jīng)元細胞的電生理特性，并且細胞表面唯一表達TrkC受體，這種細胞的分化潛能完全依賴于NT-3誘導ERK1/2短暫激活（5至15分鐘）的級聯(lián)反應。最新研究認為在大鼠海馬神經(jīng)元中，NT-3通過TrkC受體的二聚化啟動細胞內(nèi)的信號通路促進了TrkC-PTPσ復合物的相互作用，誘導了SGN海馬神經(jīng)元突觸的分化過程[22,23]。研究還發(fā)現(xiàn)RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路具有誘導小鼠胚胎干細胞分化的潛能，因此，在SGN分化過程中，NT-3 可能通過TrkC 受體經(jīng)RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路發(fā)揮作用。

NT-3 與TrkC 受體結(jié)合通過RAS-MEK1/2-ERK1/2 信號通路，還可以誘導了神經(jīng)元細胞凋亡。Saini 等[24]認為在少突膠質(zhì)細胞增殖中，NT-3 濃度和抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平呈現(xiàn)正相關，協(xié)同起促進作用。在無神經(jīng)營養(yǎng)因子維持時，抗凋亡蛋白Bcl-2 足以維持SGN 的存活[25]；雖然TrkC 和Bcl-2均表現(xiàn)為NT-3 濃度依賴性，但NT-3 存在時，MEK1/2和Bcl-2過表達導致SGN死亡，可能是NT-3過度激活TrkC受體通過RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路誘導細胞凋亡的能力大于Bcl-2 維持SGN存活的能力[26]。

2.1.2 PI3K信號通路

在SGN 中，PI3K 直接或者間接接受TrkC 受體信號轉(zhuǎn)導，起到促存活和促突觸作用。由于細胞間存在著極其復雜的信號通路間的交流，Grb2與SOS形成的信號轉(zhuǎn)導復合物，在RAS-MEK1/2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導與PI3K/絲氨酸-蘇氨酸激酶（Akt）信號轉(zhuǎn)導中起到橋梁作用，所以RAS 也可以直接激活PI3K[27]。Aletsee 等[28]在SGN 細胞培養(yǎng)中通過添加NT-3 誘導神經(jīng)突起的數(shù)量和長度顯著增加，而使用PI3K 抑制劑明顯減弱這種促進作用，因此PI3K也是NT-3/TrkC 調(diào)節(jié)SGN 發(fā)育過程中的關鍵酶（圖1）。PI3K相關的信號通路眾多，如PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路和PI3K/AKT/環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（CREB）通路等，抑制mTOR 或者過表達CREB 均可以提高SGN 的存活率和突觸生長，但NT-3/TrkC具體是通過哪種信號通路仍有待驗證。

圖1 NT-3/TrkC信號通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of the NT-3/TrkC signal pathway

2.2 p75NTR介導的信號通路

2.2.1 JNK通路

JNK 也是MAPK 信號通路中的一個亞型，在細胞因子和細胞應激等多種生命活動中發(fā)揮作用。JNK 對SGN 的保護作用包括促進細胞凋亡和突觸生長，這是由JNK 在細胞中不同定位決定的-通常細胞核中的JNK 促進細胞凋亡，而細胞質(zhì)中的JNK促進突觸生長。JNK 分為JNK1、JNK2和JNK3三個亞型，而JNK3 在誘導SGN 凋亡中起主導作用[29]，敲除JNK3 后抑制了HC 丟失后SGN 的凋亡,因此使用JNK3 抑制劑成為SGN 損傷后的潛在治療方式[30]。然而無外界刺激或NT-3 充足時，JNK1、JNK2 和JNK3 誘導了SGN 突觸的形成并維持其生長[2]。抑制JNK 信號通路，SGN 外植體神經(jīng)突觸的長度和數(shù)量均減少，但通過添加NT-3 可以逆轉(zhuǎn)[31,32]。因此，NT-3促進神經(jīng)元存活的機制可能是通過抑制細胞核JNK 的磷酸化，從而抑制SGN 細胞的凋亡；或者是促進胞質(zhì)內(nèi)JNK 的磷酸化而促進SGN 的軸突生長和存活[33]，此外還有觀點認為NT-3 與p75NTR 的結(jié)合降低后，JNK 的蛋白表達明顯降低，即NT-3 對SGN發(fā)育的調(diào)節(jié)作用可能是通過p75NTR/JNK通路發(fā)揮作用[34]。

2.2.2 P38MAPK通路

P38MAPK 信號通路參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘形成和修復，它通過在成熟少突膠質(zhì)細胞[35]和雪旺細胞[36]中發(fā)揮作用，保持了神經(jīng)元周圍髓鞘的完整性，促進了神經(jīng)元的存活[37]。除此之外，此通路還與突觸可塑性密切相關[38]。Mullen等[39]認為在SGN中，BDNF通過P38信號通路對其突觸數(shù)量起促進作用，然而Aletsee等[40]認為P38不能通過NT-3影響SGN，根據(jù)NT-3與TrkC結(jié)合特異性強于p75NTR的特點，推測可能原因是NT-3優(yōu)先與TrkC結(jié)合，導致NT-3/TrkC 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑抑制NT-3/p75NTR/P38MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑所致。

3 小結(jié)與展望

SGN 在HC 或SCs 損傷后仍可以存活數(shù)周到數(shù)月，而且TrkC 受體和p75NTR 在成年后的SGN 中仍持續(xù)表達，這為SGN 損傷后，或干細胞治療和人工耳蝸植入后[41-42]，補充外源性NT-3 以維持SGN 存活并發(fā)揮生物學功能提供理論依據(jù)。雖然BDNF在一定程度上可以代替NT-3，但是這些神經(jīng)營養(yǎng)因子激活的信號通路卻大不相同，毋庸置疑NT-3是耳蝸發(fā)育不可或缺以及無法替代的神經(jīng)營養(yǎng)因子，深入了解NT-3 在耳蝸發(fā)育過程中的作用及機制，可為以后將其應用于臨床提供理論依據(jù)。