大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞體外優(yōu)化培養(yǎng)方法的研究

朱一丹 吳翠萍 金越凡 殷善開(kāi) 李春燕

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（上海 200233）

上海交通大學(xué)耳鼻咽喉研究所（上海 200233）

螺旋神經(jīng)元（Spiral Ganglion Neuron，SGN）一旦損傷很難再生。利用SG 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元有望為螺旋神經(jīng)元的修復(fù)提供新的方向[1]。然而，SG 干細(xì)胞培養(yǎng)仍有一些亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。既往研究[2-6]主要采用懸浮培養(yǎng)方法進(jìn)行SG 干細(xì)胞球的培養(yǎng)。但懸浮培養(yǎng)方法存在一定缺陷，如干細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞不容易與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸，后期會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及自噬等損傷；其次，內(nèi)部細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行形態(tài)上的直觀觀察。既往研究[7]發(fā)現(xiàn)，SG 干細(xì)胞與腦來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特性極其相似。而腦來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞多采用單層貼壁法培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞單層貼壁，減少了早期接觸抑制，并且與培養(yǎng)基接觸完全，便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，更加有利于形態(tài)觀察和研究[8]。但SG干細(xì)胞的單層貼壁培養(yǎng)方式還鮮有研究報(bào)道。因此，本研究利用單層貼壁方式進(jìn)行大鼠SG干細(xì)胞的培養(yǎng)，并首次與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行比較，對(duì)比兩種方法培養(yǎng)的SG干細(xì)胞形態(tài)、活性、純度、增殖能力及分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1 天（Postnatal Day1，P1）的SD（Sprague-Dawley）由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：20180004055508。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

改良Dulbecco 細(xì)胞培養(yǎng)液（Dulbecco’s odifiedm Eagle’s medium,DMEM／F12培養(yǎng)液;Invitrogen，美國(guó)），無(wú)血清培養(yǎng)液添加劑N2 和B27（Invitrogen，美國(guó)），表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF；PeproTech，英國(guó)），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic-fibroblast growth factor，bFGF；PeproTech，英國(guó)），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-I,IGF1; PeproTech，英國(guó))，脫氧核糖核酸酶I(Deoxyribo、nucleaseI,DNaseI;Worthington,美國(guó))，大豆胰蛋白酶抑制劑(oybean trypsin inhibitor；Sigma，美國(guó))，青霉素-鏈霉素溶液（Biosharp,中國(guó)），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen，美國(guó)），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS,Invitrogen，美國(guó)）Hanks’平衡鹽溶液（Hanks’balanced salt solution，HBSS；Solarbio,中國(guó)），Dulbecco的磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，DPBS；Solarbio,中國(guó)），聚L-賴(lài)氨酸（Poly-Llysine，PLL，Sangon biotech，中國(guó)），活/死細(xì)胞染色試劑盒（Live/Dead Cell Staining Kit; Sciencell,美國(guó)），CCK8 試劑盒（CCK-8 Cell Counting Kit; Vazyme,中國(guó)）,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit;Beyotime,中國(guó))

1.1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色抗體及試劑

鼠抗Nestin 單克隆抗體,克隆rat-401（sigma，MAB353）；兔抗SOX2多克隆抗體(abcam,ab97959)；鼠抗Ki67 單克隆抗體(abcam,ab279653)；兔抗beta III Tubulin 單克隆抗體（abcam,ab52623）；山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (abcam,ab150113)；山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 555)（Thermo Fisher Scientific,A-21429)；Fluoroshield ?封固劑（含DAPI）（sigma,F6057）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新生大鼠SG干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

新生1d SD 大鼠（P1）經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉、75%乙醇浸泡消毒后，迅速斷頭處死，取出雙側(cè)顳骨置于4℃預(yù)冷的HBSS 溶液中；耳蝸完全暴露；剝除未骨化的蝸殼，沿蝸軸分離螺旋韌帶、血管紋及基底膜，再將螺旋神經(jīng)節(jié)與蝸軸剝離，取螺旋神經(jīng)節(jié)置于預(yù)冷的DPBS 溶液中。用Hanks’液清洗2次，使用0.125%胰蛋白酶37℃消化10min，每5min震蕩1 次；用內(nèi)含10mg/ml 的大豆胰蛋白酶抑制劑和1mg/ml 的DNaseI 的DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞終止消化，吸管輕柔吹打，40μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，獲得均勻的單細(xì)胞懸液。一部分以2×105cell/ml 的密度接種于懸浮六孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一部分以相同的密度接種于預(yù)先經(jīng)聚L-賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)板中進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，成分為DMEM/F12（1；1）、N2（1：100）、B27（1：100）、EGF（20ng/ml）、bFGF（10ng/ml）、IGF-1（50ng/ml）、青-鏈霉素(1：100)，每3d半量換液一次。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.2.3 活/死細(xì)胞熒光染色

離心收集懸浮培養(yǎng)的SG干細(xì)胞，加入1ml含有1μl活/死細(xì)胞染液的PBS（1：1000）。室溫靜置10分鐘。熒光顯微鏡觀察。將單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基吸去。加入1ml含有1μl 活/死細(xì)胞染液的PBS（1：1000）。室溫靜置10分鐘，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Annexin V/PI雙細(xì)胞熒光染色

離心收集懸浮培養(yǎng)的SG 干細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,具體操作方法參照試劑盒(Beyotime)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 SG干細(xì)胞免疫細(xì)胞熒光染色

將懸浮球狀和單層貼壁培養(yǎng)5d 的干細(xì)胞解離成單細(xì)胞，接種于經(jīng)聚L-賴(lài)氨酸包被處理并置于24 孔板中的圓形玻片上,置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4h。4%的多聚甲醛固定20min，0.5% TritonX-100 37℃孵育10min,，5%山羊血清封閉30min。除去封閉液，分別加入一抗anti-Nestin 單克隆抗體（1：200）、anti-Sox2 多克隆抗體（1：200）、anti-Ki67單克隆抗體（1：100），4℃下孵育過(guò)夜；PBS 洗滌后加二抗Alex Fluor 488（1：500）、Alex Fluor 555（1：500），室溫避光孵育1 h，洗滌后DAPI 染色封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 SG干細(xì)胞分化及鑒定

為了分析分化潛能,將懸浮培養(yǎng)5 天的神經(jīng)球接種在聚L-賴(lài)氨酸包被的蓋玻片上，次日換用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（DMEM/F12、10%胎牛血清、0.1%青霉素-鏈霉素）誘導(dǎo)其分化,隔天換液,繼續(xù)培養(yǎng)3d，進(jìn)行免疫熒光染色觀察。在貼壁培養(yǎng)中，SG 干細(xì)胞接種培養(yǎng)5 天后更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基以誘導(dǎo)SG 干細(xì)胞分化，隔天換液,繼續(xù)培養(yǎng)3d，進(jìn)行免疫熒光染色觀察。

1.2.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

SG 干細(xì)胞分別以懸浮和單層的培養(yǎng)方式接種于96 孔板中，采取CCK-8 法于1d、3d、5d、7d 分別測(cè)定兩種培養(yǎng)方式所培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

熒光顯微鏡在一個(gè)視野放大200 倍鏡頭下計(jì)數(shù)，用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)所有數(shù)據(jù)均用±s表示，對(duì)差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異顯著性指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 懸浮和單層貼壁培養(yǎng)的SG干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)懸浮培養(yǎng)方式培養(yǎng)1-2 天后的細(xì)胞可見(jiàn)“細(xì)胞球”，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞球體積逐漸增大；絕大部分細(xì)胞球?yàn)閷?shí)心細(xì)胞球，呈桑葚狀，細(xì)胞球內(nèi)所含細(xì)胞數(shù)量不一，細(xì)胞球大小不一，周?chē)梢?jiàn)單個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)6-7d 時(shí)，部分細(xì)胞球出現(xiàn)中心顏色加深、透光性變差的現(xiàn)象（圖1A）。

以貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細(xì)胞，接種后6h，已有部分細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多呈橢圓形。隨后貼壁細(xì)胞迅速增多，多呈梭狀，并以簇狀分布，周?chē)梢?jiàn)單個(gè)細(xì)胞，有少部分細(xì)胞可見(jiàn)小突起。貼壁細(xì)胞單層排列，胞體透明，胞漿勻質(zhì)，折光性良好（圖1B）。

圖1 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡形態(tài)照片。A：體外懸浮培養(yǎng)1、3、5、7 天；B：體外單層貼壁培養(yǎng)1、3、5、7天。7天時(shí)，懸浮培養(yǎng)(A)中較大細(xì)胞球出現(xiàn)暗色核心（藍(lán)色箭頭），可能為細(xì)胞死亡現(xiàn)象。Scale bar=50μm。Fig.1 Light micrographs of SG stem cells under different culture methods.A: In vitro suspension culture for 1,3,5,and 7 days; B: In vitro monolayer adherent suspension culture for 1,3,5,and 7 days.On day 7,larger spheroids in suspension culture (A) developed dark cores(blue arrow),likely due to cell death.Scale bar=50μm.

2.2 活/死細(xì)胞熒光染色

懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球，經(jīng)活/死細(xì)胞染色試劑盒熒光染色后可觀測(cè)到,神經(jīng)球整體發(fā)綠色熒光，表明神經(jīng)球細(xì)胞多為活細(xì)胞（圖2A）。單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)活/死細(xì)胞染色試劑盒熒光染色后細(xì)胞發(fā)綠色熒光，表明培養(yǎng)體系中的細(xì)胞多為活細(xì)胞（圖2B）。以上結(jié)果表明懸浮和單層貼壁兩種不同方式培養(yǎng)的SG干細(xì)胞均具備良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖2 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞的活/死細(xì)胞染色。(A)懸浮培養(yǎng)5天。(B)單層培養(yǎng)5天。綠色：活細(xì)胞，紅色：死細(xì)胞。Scale bar=100μm。Fig.2 Live/dead cell staining of SG stem cells under different culture methods.(A)Suspension culture for 5 days.(B)Monolayer culture for 5 days.Green:live cells Red,death cells.Scale bar=100μm.

2.3 Annexin V/PI雙細(xì)胞熒光染色

Annexin V/PI雙染法是檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死的一個(gè)敏感且特異的方法,早期凋亡細(xì)胞即可表現(xiàn)為細(xì)胞膜被Annexin V 熒光染色(呈綠色熒光),晚期凋亡細(xì)胞膜染色(呈綠色熒光)的同時(shí)核DNA 被PI 染色(呈紅色熒光)，壞死細(xì)胞核DNA 被PI 染色(呈紅色熒光)。結(jié)果顯示以?xún)煞N不同的培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細(xì)胞群中，凋亡以及死亡的細(xì)胞均很少（圖3），絕大部分細(xì)胞的均為活細(xì)胞。

圖3 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞的Annexin V/PI 雙染色測(cè)定。(A)懸浮培養(yǎng)5 天。(B)單層培養(yǎng)5 天。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC 染色陽(yáng)性細(xì)胞（Annexin V-FITC+），紅色為PI 染色陽(yáng)性細(xì)胞（PI+）。Annexin V-FITC+：凋亡細(xì)胞。Annexin V-FITC+/PI+：壞死和晚期凋亡細(xì)胞。Annexin VFITC-/PI-：正常細(xì)胞。Scale bar=100μm。Fig.3 Annexin V/PI double-staining assay of SG stem cells under different culture methods.(A)Suspension culture for 5 days.(B)Monolayer culture for 5 days.The green fluorescence in the figure is Annexin V-FITC staining-positive cells(Annexin V-FITC+),and the red is PI staining-positive cells(PI + ).Annexin V-FITC + : apoptotic cells.Annexin VFITC+/PI+: necrotic and late apoptotic cells.Annexin VFITC-/PI-:normal cells.Scale bar=100μm

2.4 不同培養(yǎng)方式SG干細(xì)胞純度分析

通過(guò)免疫熒光染色，可以進(jìn)一步分析和比較懸浮培養(yǎng)及單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的SG 干細(xì)胞純度。Nestin 是一種中間絲蛋白，Sox2 為轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，均在神經(jīng)前體細(xì)胞中有大量表達(dá),為神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白。對(duì)經(jīng)Nestin、Sox2 鑒定為雙陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞純度計(jì)算，結(jié)果顯示以懸浮方式培養(yǎng)的細(xì)胞群體中SG 干細(xì)胞的純度為（78.43±7.86）%，以單層貼壁方式培養(yǎng)的細(xì)胞群體中SG干細(xì)胞的純度為（74.42±10.57）%，SG干細(xì)胞純度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.557;P=0.595,n=4)(圖3)。提示兩種培養(yǎng)方式均可培養(yǎng)出大量保持干細(xì)胞生物學(xué)特性、具有自我更新能力的SG干細(xì)胞。

2.5 不同培養(yǎng)方式SG干細(xì)胞增殖活性分析

Ki67是一種細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志蛋白,主要表達(dá)于細(xì)胞增殖的的各個(gè)時(shí)期,但在靜息的細(xì)胞中不表達(dá)。我們用Ki67 和Sox2 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重?zé)晒鈽?biāo)記,其中Ki67和Sox2雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞為具有增殖特性和自我更新能力的SG 干細(xì)胞，這也進(jìn)一步表明了SG 干細(xì)胞的增殖活性。免疫熒光測(cè)定結(jié)果顯示，懸浮培養(yǎng)中約有細(xì)胞群體中Ki67、Sox2 雙陽(yáng)性的細(xì)胞占（9.99±1.03）%，以單層貼壁方式培養(yǎng)的細(xì)胞群體中Ki67、Sox2 雙陽(yáng)性陽(yáng)性的細(xì)胞占（15.64±0.55）%，Ki67、Sox2 雙陽(yáng)性的干細(xì)胞所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.84;P＜0.0001,n=7）（圖4）。結(jié)果表明以這兩種不同的培養(yǎng)方式培養(yǎng)SGN細(xì)胞均可在相應(yīng)的培養(yǎng)體系中增殖，但貼壁方式培養(yǎng)的細(xì)胞中Sox2、Ki67雙陽(yáng)性的干細(xì)胞所占的比例較懸浮培養(yǎng)高，提示貼壁培養(yǎng)的干細(xì)胞的增殖活性較懸浮培養(yǎng)的干細(xì)胞強(qiáng)。

圖4 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞純度對(duì)比。懸浮培養(yǎng)(A)和單層培養(yǎng)(B)第5天時(shí)，使用Nestin（綠色）和Sox2（紅色）特異性抗體對(duì)SG干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。C:Nestin/Sox2雙陽(yáng)性細(xì)胞的定量化計(jì)算(n=4)。Scale bar=100μm。Fig.4 Purity comparison of SG stem cells under different culture methods.Suspension cultured (A) and Monolayer cultured (B) SG stem cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Nestin(green)and Sox2 (red) at day5.Quantification of anti-Nestin and anti-Sox2 double-positive double-positive cells(n=4)(C).Scale bar=200μm.

圖5 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞增殖活性對(duì)比。懸浮培養(yǎng)(A)和單層培養(yǎng)(B)第5 天時(shí)，使用Sox2（紅色）和Ki67（綠色）特異性抗體對(duì)SG 干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。C:Ki67/Sox2 雙陽(yáng)性細(xì)胞的定量化計(jì)算。進(jìn)行t 檢驗(yàn)以計(jì)算顯著性差異(n=7,****P＜0.0001)。Scale bar=100μm。Fig.5 Comparison of the proliferation activity of SG stem cells under different culture methods.Suspension cultured (A)and Monolayer cultured (B) SG stem cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Sox2 (red) and Ki67 (green) at day5.Quantification of anti-Ki67 and anti-Sox2 double-positive double-positive cells (C).The t-tests were performed to calculate significance (n=7,****P＜0.0001).Scale bar=100 μm.

2.6 不同培養(yǎng)方式SG干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力鑒定

將兩種培養(yǎng)方式獲取的SG 干細(xì)胞經(jīng)FBS 誘導(dǎo)分化后，均可觀察到類(lèi)似SGN 形態(tài)的神經(jīng)元樣細(xì)胞，大多數(shù)神經(jīng)元樣細(xì)胞呈現(xiàn)類(lèi)似雙極神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞胞體呈梭形，雙極伸出較長(zhǎng)突起，長(zhǎng)的達(dá)胞體的數(shù)倍，細(xì)胞狀態(tài)良好。神經(jīng)元特異性管蛋白Ⅲ型(Neuronic-specific tubulin Ⅲ,Tuj1)是SGN 的特異性標(biāo)志物之一。為了在形態(tài)學(xué)上鑒定SGN，應(yīng)用Tuj1標(biāo)記SGN進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色，結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)方式經(jīng)誘導(dǎo)后均可觀察到全細(xì)胞著色呈紅色熒光的SGN樣細(xì)胞，橢圓形胞體和神經(jīng)突起十分清晰，表明具有神經(jīng)元的特征。根據(jù)免疫熒光結(jié)果定量分析了SG干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化效率,即Tuj1陽(yáng)性細(xì)胞占DAPI細(xì)胞的百分比。懸浮培養(yǎng)獲取的SG 干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化效率（3.94±1.18）%，貼壁培養(yǎng)獲取的SG 干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化效率為（4.70±0.94）%，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.008;P=0.352,n=4)（圖6）。提示兩種培養(yǎng)方式來(lái)源的SG 干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后均可以形成螺旋神經(jīng)元樣細(xì)胞，且其分化效率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖6 不同培養(yǎng)方式獲取的SG 干細(xì)胞的分化鑒定。懸浮培養(yǎng)(A)和單層培養(yǎng)(B)獲取的SG 干細(xì)胞應(yīng)用FBS 誘導(dǎo)分化3d后，使用Tuj1（紅色）特異性抗體對(duì)分化的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。明場(chǎng)圖像中的紅色箭頭表示具有雙極形態(tài)的神經(jīng)元樣細(xì)胞，兩個(gè)神經(jīng)突起生長(zhǎng)在神經(jīng)元胞體的兩極。C:Tuj1陽(yáng)性細(xì)胞的定量化計(jì)算(n=4)。Scale bar=20μm。Fig.6 Differentiation identification of SG stem cells obtained by different culture methods.After SG stem cells obtained from suspension culture (A) and monolayer culture (B) were induced to differentiate by FBS for 3 days,the differentiated neuronal cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Tuj1 (red).The red arrows in the bright field image indicate neuron-like cells with bipolar morphology,with two neurites growing at the two poles of the neuron cell body.C:Quantitative calculation of anti-Tuj1 positive cells(n=4).Scale bar=20μm.

2.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

SG 干細(xì)胞在懸浮和單層的培養(yǎng)方式下均呈增殖趨勢(shì)。自第3 天后，單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量每天都略高于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量（圖7），第3 天時(shí)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞活性高于貼壁培養(yǎng)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.97;P＜0.01,n=3），提示單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖能力較懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞強(qiáng)。兩種方式培養(yǎng)的干細(xì)胞增殖均在第5 天時(shí)達(dá)到巔峰，隨后細(xì)胞活性下降。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞活性下降的速率較單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞快，且懸浮培養(yǎng)細(xì)胞活性小于單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞（培養(yǎng)第7 天），其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.13;P＜0.001,n=3）。

圖7 不同培養(yǎng)方式下的SG 干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。進(jìn)行t 檢驗(yàn)以計(jì)算顯著性差異(**P＜0.01，***P＜0.001,n=3)。Fig.7 Growth curves of SG stem cells under different culture methods.The t-tests were performed to calculate significance(**P＜0.01，***P＜0.001,n=3).

3 討論

SGN 再生是耳科學(xué)研究的熱點(diǎn)。利用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為SGN 是解決這一科學(xué)難題的重要研究方向[9-13]。2007年Oshima[14,15]分離了來(lái)自新生哺乳動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)部位的干細(xì)胞。目前已有研究證實(shí)[16-18]，SG 干細(xì)胞具有自我更新能力，可分化為類(lèi)似于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的細(xì)胞。與其他來(lái)源的干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞相比，SG 干細(xì)胞理論上分化為螺旋神經(jīng)元的效率會(huì)更高，更容易分化為功能性的SGN 細(xì)胞。因此，利用SG 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元能為SGN損傷后的修復(fù)提供高效手段。然而，SG 干細(xì)胞數(shù)量少，獲取困難，因此，進(jìn)行穩(wěn)定高效的體外培養(yǎng)使其獲得穩(wěn)定增殖能力尤為重要。

既往研究多使用傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)小鼠的SG干細(xì)胞，SD大鼠的SG干細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)方式還鮮有研究報(bào)道。本研究嘗試用單層貼壁方式進(jìn)行SD 大鼠SG 干細(xì)胞的培養(yǎng)，并首次與懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行了對(duì)比。研究結(jié)果證實(shí)單層貼壁方式培養(yǎng)同樣可獲得大量具有干細(xì)胞特異性的SG 干細(xì)胞，且獲得的SG 干細(xì)胞純度與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)方式相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究懸浮方式獲取的SG 干細(xì)胞純度與既往文獻(xiàn)懸浮方式培養(yǎng)的小鼠SG 干細(xì)胞純度[4]相似。

活、死熒光染色和Annexin V/PI 雙染檢測(cè)結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)方式培獲得的SG 干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，其中凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞很少。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，兩種培養(yǎng)方式培獲得的SG 干細(xì)胞均可誘導(dǎo)分化為SGN樣神經(jīng)元細(xì)胞。

免疫熒光與生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單層貼壁培養(yǎng)法獲得的SG 干細(xì)胞增殖活性較懸浮培養(yǎng)的干細(xì)胞強(qiáng)。這種差異的存在可能歸結(jié)于以下兩個(gè)原因。一．相比懸浮培養(yǎng)方式，SG 干細(xì)胞的單層貼壁可以顯著增加細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，從而更有利于其充分獲取細(xì)胞因子刺激和營(yíng)養(yǎng)成分滋養(yǎng)，因此增殖更快。二．貼壁培養(yǎng)更有利于SG 干細(xì)胞的快速穩(wěn)定增殖可能與貼壁培養(yǎng)方式中使用聚L-賴(lài)氨酸（Poly-L-lysine，PLL）作為粘附基質(zhì)有關(guān)。PLL是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,可通過(guò)其上的正電荷與細(xì)胞膜的負(fù)電荷相互結(jié)合以促進(jìn)細(xì)胞粘附與存活，在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛被用于包被物促進(jìn)細(xì)胞貼壁，也是細(xì)胞增殖的合適基質(zhì)。既往研究表明，PLL 可能同干細(xì)胞表面一些與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的受體分子如整合素家族成員相結(jié)合,從而影響干細(xì)胞存活、遷移、增殖、分化等行為。例如Park 等[19]報(bào)道稱(chēng)PLL 可以促進(jìn)人類(lèi)造血干細(xì)胞的離體擴(kuò)增。也有報(bào)道[20]稱(chēng)PLL 可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞功能。近年來(lái)也有研究表明[21]，PLL 能夠?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)提供良好的微環(huán)境，顯著促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并引起干性標(biāo)記物基因表達(dá)的一致上調(diào)。此外，PLL 還可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的吸附，從而可能進(jìn)一步提升干細(xì)胞的活力。

此外，懸浮方式培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光等操作時(shí)，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化破球，不可避免地會(huì)損失一部分細(xì)胞，這可能是免疫熒光實(shí)驗(yàn)中懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度低于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞密度的原因。而SG 干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)可以有利避免消化破球時(shí)的細(xì)胞損傷，有益于對(duì)SG 干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定準(zhǔn)確的定量研究，從而提供更精準(zhǔn)科學(xué)的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究創(chuàng)新性探索了SG 干細(xì)胞的單層貼壁培養(yǎng)方式，通過(guò)與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)單層貼壁培養(yǎng)的SG 干細(xì)胞的增殖活性較懸浮培養(yǎng)的干細(xì)胞更強(qiáng),更有利于細(xì)胞的形態(tài)觀察及定量。本研究提供了SG 干細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)越方式，不僅為進(jìn)一步開(kāi)展SG 干細(xì)胞的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為該領(lǐng)域SG 干細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)提供了方法學(xué)上的參考。