唾液乳桿菌在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展中的作用

袁 飛,黃暖琴,黃 瑩,蕭韻健,李 麗,楊彩紅

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院;東莞市人民醫(yī)院,廣東 東莞 523058)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病,主要侵犯全身各處關(guān)節(jié),呈多發(fā)性和對(duì)稱(chēng)性,由此引起關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)囊的破壞,最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形[1].RA在臨床上是一種常見(jiàn)慢性的炎癥性疾病,初期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬(尤其是晨僵)、關(guān)節(jié)腫脹疼痛,甚至關(guān)節(jié)出現(xiàn)畸形[2-3].目前,RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確.

眾所周知,多種微生物在人體內(nèi)共生,對(duì)人體的免疫功能發(fā)揮著重要調(diào)控作用[4].有研究[5]表明,多種細(xì)菌與RA的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性.腸道是人體最大的微生物寄居地,腸道微生態(tài)系統(tǒng)是由上皮細(xì)胞、腸道固有菌群、腸黏膜免疫系統(tǒng)組成的[6],腸道內(nèi)種類(lèi)繁多的微生物和諧共生.有研究[7]表明,機(jī)體免疫功能受腸道微生態(tài)平衡的影響,參與免疫應(yīng)答,腸道內(nèi)黏膜可阻止有害物質(zhì)進(jìn)入,其不僅是保護(hù)屏障,也是主要的抗體分泌和免疫球蛋白的“工廠”[8],因此,腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生.已有研究[9]發(fā)現(xiàn):RA發(fā)病與大腸埃希桿菌、奇異變形桿菌、結(jié)核分枝桿菌等細(xì)菌感染相關(guān);在RA患者關(guān)節(jié)中亦檢測(cè)到細(xì)胞壁肽聚糖成分和腸道細(xì)菌降解的DNA,同時(shí),人腸道細(xì)菌的細(xì)胞壁可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎[10];許多腸道細(xì)菌的其他成分亦能激發(fā)類(lèi)風(fēng)濕因子抗體的分泌,這表明腸道細(xì)菌可能影響RA發(fā)病[11].

有研究[12]通過(guò)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)腸道菌群在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力方面發(fā)揮著重要作用.腸道菌群紊亂將導(dǎo)致腸道菌群多樣性發(fā)生變化(致病菌增加,有益菌群減少),進(jìn)而導(dǎo)致RA的發(fā)生和發(fā)展[13].唾液乳桿菌屬于乳桿菌科、乳桿菌屬,廣泛地存在于人和動(dòng)物的腸道中,是腸道菌群的重要成員之一,在多種疾病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但其在RA中的作用研究較少.本研究主要探討唾液乳桿菌在RA進(jìn)展中的作用,旨為RA的預(yù)防和治療提供新的思路和方向.

1 材料與方法

1.1 唾液乳桿菌和甲氨蝶呤制備

唾液乳桿菌(ATCC11741,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)配制:在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h,活菌計(jì)數(shù),采用無(wú)菌生理鹽水配制菌液為1010CFU/mL.甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司)配制:取8片甲氨蝶呤片(共20 mg),加入少量0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸液研磨,待充分研磨后,繼續(xù)加0.5% CMC-Na混懸液至26.3 mL,得0.76 mg/mL的甲氨蝶呤混懸液.

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物準(zhǔn)備及飼養(yǎng)

SD大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(粵)2018-0002)飼養(yǎng)條件:檢疫期間4只大鼠/箱,群養(yǎng);試驗(yàn)期間4只大鼠/箱,飼養(yǎng)溫度為20～26 ℃,濕度為40%～70%,采用12 h∶12 h晝夜交替照明,自動(dòng)抽風(fēng);自由進(jìn)食和飲水,飼料為全價(jià)顆粒飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),飲水為廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備的純凈水.本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(13202109-4).

1.2.2 動(dòng)物分組及預(yù)防性給藥

選用32只雄性SD大鼠,采用先預(yù)防給藥,再造模,將其隨機(jī)分為唾液乳桿菌組、甲氨蝶呤組,膠原誘導(dǎo)型(collagen-inducedarthritis,CIA)模型對(duì)照組、健康對(duì)照組,每組8只.分組結(jié)束后,測(cè)量所有動(dòng)物雙后肢足趾體積2次,測(cè)量完成后,各組開(kāi)始給藥.健康對(duì)照組直接灌胃細(xì)菌培養(yǎng)基1 mL/(次·只),3次/周;CIA模型組亦直接灌胃細(xì)菌培養(yǎng)基1 mL/(次·只),3次/周;唾液乳桿菌干預(yù)組灌胃給予唾液乳桿菌(1010CFU/mL)1 mL/(次·只),3次/周;甲氨蝶呤組灌胃給予甲氨蝶呤(7.6 mg/kg),1次/周,連續(xù)2周.分組及給藥情況見(jiàn)表1.

1.2.3 模型建立

本實(shí)驗(yàn)在預(yù)防灌胃給藥2周后測(cè)量所有動(dòng)物雙后肢足趾體積2次,記為第零天的情況.第1天開(kāi)始首次造模,除健康對(duì)照組外,其余3組動(dòng)物使用Hamilton注射器在動(dòng)物尾根部2 cm處皮下進(jìn)針,距尾根部0.5 cm處皮下注射乳化劑(膠原-弗氏完全佐劑混合乳化后),每只200 μL.第8天加強(qiáng)造模,除健康對(duì)照組外,其余3組動(dòng)物使用Hamilton注射器在動(dòng)物尾根部3 cm處皮下進(jìn)針,距尾根部1.5 cm處皮下注射乳化劑(膠原-弗氏不完全佐劑混合乳化后),每只200 μL.造模成功后,對(duì)應(yīng)各組持續(xù)給藥4周.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死動(dòng)物,留取左側(cè)踝關(guān)節(jié),中性甲醛固定,行組織病理學(xué)檢查.

表1 各組給藥情況(♂)Tab.1 Administration of each group (♂)

1.2.4 造模評(píng)分

D15(第15天),測(cè)量所有動(dòng)物四肢足趾體積2次,并依照表2進(jìn)行評(píng)分.

表2 CIA大鼠模型關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Arthritis scoring standard of CIA rat model

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1)一般觀察:每天觀察動(dòng)物狀態(tài),并進(jìn)行記錄.

2)各組體質(zhì)量測(cè)量:實(shí)驗(yàn)期間,每周測(cè)量體質(zhì)量1次.

3)各組CIA評(píng)分:造模開(kāi)始后每周依照表2進(jìn)行雙人獨(dú)立關(guān)節(jié)炎評(píng)分1次.

4)足跖體積測(cè)量:造模開(kāi)始后,每周測(cè)量雙后肢足腫脹體積3次.

5)各組糞便采集及糞便菌群DNA檢測(cè):第2周、第5周、第8周分別采集無(wú)菌采集動(dòng)物糞便1次,每只動(dòng)物2粒(凍存),初次免疫后的第13天進(jìn)行糞便菌群DNA檢測(cè).根據(jù)大鼠糞便DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便菌群DNA.取各組糞便樣品200 mg,置于預(yù)冷的離心管內(nèi),加入300 mg玻璃珠、400 μL裂解液和20 μL蛋白酶K,混勻10 min,70 ℃水浴20 min,期間3次顛倒混勻,15 000 r/min離心5 min;取上清于另一離心管內(nèi),加入200 μL萃取分離液,混勻20 s,孵育5 min,15 000 r/min離心5 min;取上清250 μL至離心管內(nèi),加入250 μL含無(wú)水乙醇的結(jié)合液,混勻,15 000 r/min離心2 min;棄去管內(nèi)液體,并將離心柱置于新的管內(nèi),并加入500 μL漂洗液,15 000 r/min離心2 min;棄去管內(nèi)液體,再將離心柱置于新的管內(nèi),加入750 μL洗滌液,15 000 r/min離心2 min;棄去管內(nèi)液體,15 000 r/min離心4 min;轉(zhuǎn)移離心柱于離心管內(nèi),加入200 μL洗脫液后,室溫條件下溫育4 min,然后15 000 r/min離心2 min;得到腸道菌群DNA,-20 ℃以下低溫保存.采用乳桿菌屬特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)腸道乳桿菌屬種類(lèi)及數(shù)量.

6)HE染色實(shí)驗(yàn):HE染色主要用于觀察足跖病理學(xué)變化,結(jié)果顯示,大鼠足跖組織損傷程度加大;處死各組大鼠,分離膝關(guān)節(jié),應(yīng)用4%多聚甲醛固定24 h,然后轉(zhuǎn)移至70%酒精中,進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色,最后用光鏡進(jìn)行觀察.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠病理組織學(xué)觀察

健康對(duì)照組送檢8例踝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)檢查,結(jié)果未見(jiàn)異常變化.CIA模型對(duì)照組送檢8例踝關(guān)節(jié),結(jié)果重度關(guān)節(jié)炎3例,表現(xiàn)為滑膜纖維化、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、局部出現(xiàn)壞死、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、骨組織受累,且與周?chē)M織粘連,關(guān)節(jié)腔狹窄或消失;中度關(guān)節(jié)炎2例,表現(xiàn)為滑膜上皮及小血管增生、形成血管翳、滑膜上皮及間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)、局部可見(jiàn)單核細(xì)胞聚集;輕度關(guān)節(jié)炎3例,表現(xiàn)為滑膜上皮細(xì)胞增生、滑膜血管增生/淤血、滑膜上皮及間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn).

唾液乳桿菌干預(yù)組送檢8例踝關(guān)節(jié),其中輕度關(guān)節(jié)炎7例,1例未見(jiàn)異常變化;甲氨蝶呤組送檢8例踝關(guān)節(jié),4例可見(jiàn)與CIA模型對(duì)照組相似病變,其中重度關(guān)節(jié)炎1例,中度關(guān)節(jié)炎1例,輕度關(guān)節(jié)炎5例,1例未見(jiàn)異常變化.各組大鼠病理組織學(xué)變化結(jié)果顯示,唾液乳桿菌干預(yù)可明顯改善RA大鼠組織病理狀態(tài).

2.2 體質(zhì)量指數(shù)變化

本研究結(jié)果顯示,各組大鼠每周體質(zhì)量變化情況見(jiàn)表3,各組體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明體質(zhì)量在關(guān)節(jié)炎病程中并不是關(guān)鍵因素.

表3 各階段各組大鼠體質(zhì)量情況Tab.3 Body mass of rats in each stage

2.3 關(guān)節(jié)炎程度(CIA)評(píng)分

本研究結(jié)果顯示,除健康組以外,其他3組大鼠進(jìn)入CIA建模階段后,在無(wú)干預(yù)情況下關(guān)節(jié)炎程度明顯更高(模型組關(guān)節(jié)炎評(píng)分最高),與健康組相比,模型組關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著增高(P<0.01);與模型組比較,唾液乳桿菌干預(yù)組和甲氨蝶呤組大鼠的關(guān)節(jié)炎程度評(píng)分均顯著下降(P<0.01).見(jiàn)表4.

2.4 足跖容積測(cè)量分析

足跖容積測(cè)量分析結(jié)果顯示,前足跖容積(見(jiàn)圖1 a)、后足跖容積(見(jiàn)圖1 b)及前后足跖綜合容積(見(jiàn)圖1 c)唾液乳桿菌干預(yù)組均顯著低于模型組(P<0.05),且與甲氨蝶呤組足跖容積水平相似.足跖容積測(cè)量分析表明,唾液乳桿菌可顯著改善CIA模型大鼠的腫脹程度.結(jié)果見(jiàn)圖1.

表4 各組大鼠CIA模型后關(guān)節(jié)炎程度評(píng)分Tab.4 Arthritis degree scores of rats in each group after CIA model

圖1 各組大鼠足跖容積變化趨勢(shì)Fig.1 Change trend in plantar volume of rats in each group

2.5 HE染色分析

本研究結(jié)果顯示,健康對(duì)照組大鼠(圖2 a)踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常變化;CIA模型組大鼠(圖2 b)可見(jiàn)踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)有重度關(guān)節(jié)炎;唾液乳桿菌干預(yù)組大鼠(圖2 c)踝關(guān)節(jié)有輕度關(guān)節(jié)炎;甲氨蝶呤組大鼠(圖2 d)踝關(guān)節(jié)有中度關(guān)節(jié)炎.與模型組比較,唾液乳桿菌干預(yù)組大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎明顯減輕,說(shuō)明唾液乳桿菌可改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎.各組大鼠足跖HE染色情況見(jiàn)圖2.

2.6 唾液乳桿菌多樣性分析

唾液乳桿菌多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表5,與健康對(duì)照組相比,CIA模型組的相似度、豐富度(S)、均勻度(E)和Shannon-Wiener指數(shù)(H)均顯著降低(P<0.05);與CIA模型組相比,唾液乳桿菌干預(yù)組和甲氨蝶呤組的相似度、豐富度(S)、均勻度(E)和Shannon-Wiener指數(shù)(H)均顯著升高(P<0.05);而唾液乳桿菌干預(yù)組與甲氨蝶呤組指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

a.健康對(duì)照組;b.CIA模型組;c.唾液乳桿菌干預(yù)組;d.甲氨蝶呤組.圖2 各組大鼠足跖HE染色情況Fig.2 HE staining of rats’ toes in each group

表5 4組唾液乳桿菌的多樣性Tab.5 Diversity of Lactobacillus salivary bacteria of four groups

3 討 論

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種影響關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾病,臨床上腸道微生物群在RA免疫功能障礙中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.然而,腸道微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致RA的機(jī)制尚不完全清楚.目前,RA發(fā)病機(jī)制有一種假設(shè):由于黏膜免疫系統(tǒng)和異常的局部微生物群之間的相互作用,疾病開(kāi)始于黏膜部位,然后轉(zhuǎn)移到滑膜關(guān)節(jié).確診的RA患者肺部、口腔和腸道微生物菌群組成的變化表明,黏膜微生態(tài)失調(diào)在RA的發(fā)展和持續(xù)中發(fā)揮作用,來(lái)自RA小鼠模型的數(shù)據(jù)也支持這一觀點(diǎn)[14].幾種廣泛用于治療RA的治療方案均與腸道微生物群的改變有關(guān),表明調(diào)節(jié)腸道微生物群和/或腸道屏障功能可能有助于預(yù)防或治療RA[15].已有研究[16-17]表明,糞便微生物群移植、活體生物治療或針對(duì)微生物群的飲食干預(yù)可能是自身免疫性疾病(包括RA)的一種治療新方法.

腸道是人體最大的微生物寄居地,是由上皮細(xì)胞、腸道局部黏膜大量固有的菌群免疫系統(tǒng)組成的腸道微生態(tài)系統(tǒng)[6],多種微生物在人體內(nèi)共生,對(duì)人體的免疫功能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4].乳桿菌是人體腸道中最具代表性的益生菌屬之一,在維持及調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18].已有研究[19]發(fā)現(xiàn),通過(guò)乳桿菌移植能夠調(diào)控腸道微生物群穩(wěn)態(tài),可以達(dá)到治療疾病的目的;植物乳桿菌DP189可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群,改善帕金森病小鼠的神經(jīng)退行性變.唾液乳桿菌是乳桿菌的一種,是從人體腸道中分離出來(lái)的益生菌菌株,在2010年4月22日衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《可用于食品的菌種名單》之中,乳桿菌是一種可食用的益生菌,已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防和治療中[20].在哮喘模型中,唾液乳桿菌灌胃可以減輕哮喘小鼠的臨床癥狀、氣道炎癥,改善哮喘小鼠Th1/Th2失衡[21].本研究結(jié)果顯示,在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中,唾液乳桿菌灌胃可以減輕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的病理狀態(tài).

大鼠足跖腫脹是篩選和研究抗炎藥物的經(jīng)典方法,對(duì)腫脹程度的精確跟蹤檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,在斷足稱(chēng)重、周徑測(cè)量、千分尺厚度測(cè)量和溶劑法中,以足跖容積測(cè)量方法最為靈敏和穩(wěn)定,且操作簡(jiǎn)便.本研究結(jié)果顯示,各組大鼠病理組織學(xué)變化顯示唾液乳桿菌干預(yù)可明顯改善RA大鼠組織病理狀態(tài).本研究對(duì)腫脹程度的數(shù)據(jù)顯示,唾液乳桿菌干預(yù)組和甲氨蝶呤組大鼠的關(guān)節(jié)炎程度評(píng)分均有顯著下降(P<0.05).各組大鼠足跖進(jìn)一步行HE染色,結(jié)果顯示唾液乳桿菌干預(yù)組的大鼠踝關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)炎情況明顯減輕,唾液乳桿菌多樣性分析表明其多樣性程度與RA嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)性.有研究[22]顯示,接受甲氨蝶呤治療的RA患者腸道微生物菌群發(fā)生了變化.

綜上所述,唾液乳桿菌對(duì)RA可能有類(lèi)似于甲氨蝶呤(治療RA的常用藥物)的治療效果和作用.下一步我們將從炎癥細(xì)胞因子水平入手,深入探討唾液乳桿菌對(duì)RA干預(yù)的作用機(jī)制.