血清長鏈非編碼RNA癌易感性候選基因2表達水平對膿毒癥并發(fā)急性腎損傷病兒預(yù)后的預(yù)測價值

李媛媛，劉嬌，郭娜

中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心兒科，北京100091

膿毒癥是因病原微生物感染而引起的全身炎癥性疾病，由于小兒的身體發(fā)育未成熟，其身體免疫能力較差，導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)病率較高［1］。急性腎損傷（AKI）是常見的膿毒癥并發(fā)癥，其死亡率為28%～90%，嚴(yán)重威脅病兒的生命健康，目前，臨床上常用的血肌酐靈敏度較差，發(fā)生變化時腎部已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重損傷，存在一定的局限性［2］。因此，尋找能夠早期準(zhǔn)確評估膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后情況的生物因子尤為重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長約為200 nt，但不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，可控制多個水平的基因表達［3］。癌易感性候選基因2（CASC2）是lncRNA 中的一種，最初在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)，其參與細胞增殖、分化、凋亡過程，其在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用［4］。近年來有研究表明，lncRNA CASC2 在膿毒癥病人中下調(diào)，過表達的CASC2 可抑制炎癥和氧化損傷［5］。但其對膿毒癥并發(fā)AKI 病兒的生存情況是否具有預(yù)測作用尚未研究。因此，本研究通過探究血清lncRNA CASC2 表達對膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后的預(yù)測價值，旨在為提高病兒的預(yù)后提供可靠參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2019 年2 月至2021 年2 月中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心收治的83 例膿毒癥并發(fā)AKI病兒為研究對象，其中男51例，女32例，年齡范圍為1～12 歲，年齡（6.14±1.22）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（16.93±2.09）kg∕m2，納入標(biāo)準(zhǔn)：①病兒均符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。②AKI 診斷符合《KDIGO 急性腎損傷臨床實踐指南》［7］：48 h 內(nèi)血肌酐水平升高超過基線水平26.5 μmol∕L；血肌酐水平升高到基線水平的150%；尿量連續(xù)6 h 以上＜0.5 mL·kg-1·h-1；符合上述三項中任意一項即可確診為AKI。③病兒在本院接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有先天免疫疾??；②伴有惡性腫瘤；③伴有心、肝重大器官疾??；④病歷資料不完整者。將本組病兒根據(jù)28 d 生存情況分為生存組57 例，死亡組26 例。本研究經(jīng)病兒近親屬簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑與儀器Trizol 試劑（上海善然生物科技有限公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京祥生興業(yè)科技有限公司）；miScript SYBR?Green qPCR Kit 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；引物（廣東文華氏生物科技有限公司）；PCR 儀（深圳市康初源有限公司），三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）由上海臻科生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1資料收集 收集入院時病兒年齡、BMI、體溫、心率、呼吸、尿量、動脈血二氧化碳分壓（Pa-CO2）、氧合指數(shù)（OI）、平均動脈壓（MAP）、急性生理和慢性健康系統(tǒng)Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分［8］、胱抑素C（CysC）、白細胞計數(shù)（WBC）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原、血肌酐等臨床資料。

1.3.2血清lncRNA CASC2 水平檢測 采集病兒入組次日清晨空腹靜脈血5 mL，于3 000 r∕min 離心10 min，取上清液保存于-80 ℃待用。首先通過在樣品中加入Trizol 試劑提取總RNA，并檢驗RNA 是否符合試驗要求。根據(jù)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA），嚴(yán)格按照miScript SYBR?Green qPCR Kit 試劑盒說明書操作，其反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s、95 ℃ 10 s、56.5 ℃ 30 s，進行40 個循環(huán)，以GAPDH 為lncRNA CASC2 的內(nèi)參，其相對表達量采用2-ΔΔCt計算，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0 進行。計量資料以描述，兩組間比較行t檢驗；計數(shù)資料以例表示，兩組間比較采用χ2檢驗。多因素logistic 回歸分析影響膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后的危險因素；受試者操作特征（ROC）曲線分析血清lncRNA CASC2、血肌酐對膿毒癥并發(fā)AKI病兒死亡的預(yù)測價值曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗；Pearson 相關(guān)性分析血清lncRNA CASC2 與臨床資料的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病兒一般臨床資料兩組病兒性別、年齡、BMI、體溫、心率、呼吸、OI、MAP、WBC 之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；尿量、PaCO2、APACHE Ⅱ評分、CysC、CRP、降鈣素原、血肌酐之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組膿毒癥并發(fā)急性腎損傷病兒一般臨床資料

2.2 兩組病兒血清lncRNA CASC2 水平比較與生存組相比，死亡組病兒血清lncRNA CASC2 水平顯著降低（1.02±0.18比0.69±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.84，P＜0.001）。

2.3 多因素logistic 回歸分析影響膿毒癥并發(fā)AKI病兒預(yù)后的危險因素將連續(xù)變量中尿量、PaCO2、CysC、CRP、降鈣素原、lncRNA CASC2、血肌酐等根據(jù)中位數(shù)分為高水平組和低水平組進行賦值：高水平尿量、PaCO2均賦值為0；低水平尿量、PaCO2均賦值 為1；高水平CysC、CRP、降鈣素原、lncRNA CASC2、血肌酐均賦值為1；低水平CysC、CRP、降鈣素原、lncRNA CASC2、血肌酐均賦值為0；然后進行多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示lncRNA CASC2低表達、血肌酐高水平是影響膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 多因素logistic回歸分析影響膿毒癥并發(fā)AKI病兒預(yù)后的危險因素

2.4 血清lncRNA CASC2、血肌酐對膿毒癥并發(fā)AKI 病兒死亡的預(yù)測價值ROC 曲線分析顯示，血清lncRNA CASC2、血肌酐聯(lián)合預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI病兒死亡的靈敏度為96.2%，特異度為78.9%，二者聯(lián)合AUC 顯著高于其單一指標(biāo)檢測（Z=2.25，P=0.024；Z=2.05，P=0.040）。見表4。

表4 血清lncRNA CASC2、血肌酐對膿毒癥并發(fā)AKI病兒死亡的預(yù)測價值

2.5 血清lncRNA CASC2 與臨床資料的關(guān)系Pearson 相關(guān)性分析顯示，血清lncRNA CASC2 與病兒尿量、PaCO2 呈正相關(guān)（P＜0.05），與APACHE Ⅱ評分、CysC、CRP、降鈣素原、血肌酐呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 血清lncRNA CASC2與膿毒癥并發(fā)AKI病兒一般臨床資料的關(guān)系

3 討論

AKI是重癥監(jiān)護室中膿毒癥病兒常見的并發(fā)癥之一，由于腎臟是膿毒癥直接的靶器官，膿毒癥并發(fā)AKI的發(fā)病率不斷升高，若得不到及時的治療，對病兒的腎小管可造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，給病兒家庭也將帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)［9］。臨床中常見的監(jiān)測指標(biāo)存在一定的延誤性，不能對腎損傷作出早期反應(yīng)，因此，尋找靈敏度、特異度高的血清標(biāo)志物，對膿毒癥并發(fā)AKI病兒的預(yù)后評估是十分有必要的。

lncRNA 是一類長鏈非編碼RNA，最初被認為是基因組的“噪聲”，經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 覆蓋了人類的大部分基因，可參與細胞周期、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控等重要生物學(xué)過程［10］。CASC2是一個新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于人染色體10q26，在腫瘤［11］、炎癥［12］、氧化應(yīng)激［13］中發(fā)揮關(guān)鍵作用。lncRNA CASC2 水平上調(diào)可抑制炎性因子的釋放，Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血漿中l(wèi)ncRNA CASC2 水平下調(diào)，而促炎因子白細胞介素17 水平上調(diào)。Wang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CASC2 在2 型糖尿病（T2DM）合并慢性腎功能衰竭病人血清和腎組織中顯著下降，而在合并其他疾病的T2DM 病人血清和腎組織中無顯著變化，低表達的lncRNA CASC2 對T2DM 病人慢性腎功能衰竭的發(fā)生具有預(yù)測價值。Wang等［16］研究表明，膿毒癥血清中l(wèi)ncRNA CASC2 表達水平較對照組明顯降低，其水平與炎性因子釋放、氧化應(yīng)激、細胞凋亡密切相關(guān)，lncRNA CASC2隨著AKI的嚴(yán)重程度加深而不斷降低。Hu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CASC2 在膿毒癥病人和脂多糖建立膿毒癥細胞模型中均顯著降低，過表達的CASC2 可促進細胞活力并抑制細胞凋亡、氧化應(yīng)激。這與本研究結(jié)果一致，在本研究中，膿毒癥并發(fā)AKI 死亡組病兒血清lncRNA CASC2水平較生存組顯著降低，且Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清lncRNA CASC2 與病兒尿量、Pa-CO2 呈正相關(guān)，與APACHE Ⅱ評分、CysC、CRP、降鈣素原、血肌酐呈顯著負相關(guān)，提示lncRNA CASC2參與了該疾病的發(fā)展。

另外本研究結(jié)果還顯示，兩組病兒尿量、Pa-CO2、APACHE Ⅱ評分、CysC、CRP、降鈣素原、血肌酐之間具有顯著差異。多因素logistic 回歸分析顯示，lncRNA CASC2 低表達、血肌酐高水平是影響膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后的危險因素，提示臨床中應(yīng)實時檢測上述危險指標(biāo)，制定個性化治療計劃，改善病兒治療效果。ROC 曲線分析顯示，血清lncRNA CASC2、血肌酐聯(lián)合預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI 病兒死亡的靈敏度為96.2%，特異度為78.9%，二者聯(lián)合AUC 顯著高于其單一指標(biāo)檢測，提示血清lncRNA CASC2 可作為血肌酐的輔助評估指標(biāo)，有效提高膿毒癥并發(fā)AKI病兒的預(yù)后預(yù)測效果［18-19］。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)AKI 預(yù)后不良病兒血清lncRNA CASC2 水平較預(yù)后良好病兒顯著下調(diào)，是影響膿毒癥并發(fā)AKI 病兒預(yù)后的危險因素，lncRNA CASC2聯(lián)合血肌酐對膿毒癥并發(fā)AKI病兒的預(yù)后有一定的預(yù)測價值。但是由于本研究納入樣本量較少，關(guān)于lncRNA CASC2 在膿毒癥并發(fā)AKI 中具體作用機制目前尚不明確，因此還需要進一步擴大樣本量，從多個角度進行深入分析，為膿毒癥并發(fā)AKI的診治提供可靠的參考依據(jù)。