母體血清微RNA-146a-5p聯(lián)合三聯(lián)法檢測(cè)在孕中期唐氏綜合征篩查中的意義

肖歡，張志安，梅軍華，張仙

作者單位：1黃岡市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 黃岡 438000；2湖北省婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430000

唐氏綜合征是染色體異常造成的先天性疾病，又稱為21-三體綜合征。終止妊娠是最有效的方法［1-2］。羊水穿刺是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的主要手段，但可引發(fā)1.0%胎兒流產(chǎn)，且僅限于唐氏綜合征高危孕婦篩查。目前國(guó)內(nèi)孕中期唐氏綜合征胎兒篩查方法多為甲胎蛋白（AFP）+人絨毛膜促性腺激素（β-hCG）+游離雌三醇（uE3）三聯(lián)法［3］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)三聯(lián)法檢測(cè)（AFP+β-hCG+uE3）仍然存在一定程度的假陽性率［4］從而只能作為篩查方法。近年來，研究發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征病兒胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞可脫落RNA產(chǎn)物至母體血液中，因此母體血液中miRNA 可能存在唐氏綜合征疾病標(biāo)志物［5］。微RNA-146a-5p（miR-146a-5p）是參與天然免疫的調(diào)控因子，具有調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力。有研究顯示巨噬細(xì)胞分泌的miR-146a-5p 高表達(dá)時(shí)，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移［6］。因此，本研究將探討母體血液miR-146a-5p 表達(dá)水平聯(lián)合三聯(lián)法對(duì)孕中期唐氏綜合征的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017 年1 月至2020 年8 月于黃岡市中心醫(yī)院孕中期行唐氏綜合征篩查結(jié)果為陽性的孕婦65 例（病例組），孕周范圍15～20 周，年齡范圍24～38歲，年齡（32.18±4.32）歲。同期選擇本院健康的妊娠孕婦65 例（對(duì)照組），孕周范圍15～20周，年齡范圍24～38，年齡（31.91±4.41）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）唐氏綜合征產(chǎn)前篩查為高風(fēng)險(xiǎn)，并在終止妊娠后經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)為唐氏綜合征胎兒；（2）單胎妊娠；（3）既往無不良妊娠史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、妊娠期甲狀腺功能異常者；（2）合并妊娠期肝病、腎病并發(fā)癥；（3）存在唐氏綜合征家族史；（4）存在無腦兒、腎變性、腦積水等胎兒畸形。本研究對(duì)象或其近親屬簽署知情同意書，且經(jīng)黃岡市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)20161109）。

1.2 唐氏綜合征臨床篩查方法在孕婦空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血3～4 mL，使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特Access 2 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)AFP，β-hCG 以及uE3 等指標(biāo)，依據(jù)血清uE3、β-hCG、AFP 水平換算為中位數(shù)的倍數(shù)（multiple of the median，MOM），唐氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估界限，即β-hCG MOM＞2.5；AFP MOM值＞2.5；uE3MOM值≤2.0［7］。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)孕婦血清中miR-146a-5p 的水平病例組、對(duì)照組孕婦入院行唐氏篩查時(shí)采取靜脈血3～4 mL，離心，留上清液裝于采血管中，提取總RNA，依據(jù)Rever Tra Ace Qpcr RT Kit（日本Takara公司）指導(dǎo)書反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA。采用7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）對(duì)miR-146a-5p及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a-5p 相對(duì)表達(dá)量。miR-146a-5p、U6 引物由上海生工合成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用軟件SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者操作特征（ROC）曲線分析母體血清miR-146a-5p 聯(lián)合三聯(lián)法對(duì)孕中期唐氏綜合征的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用Pearson法分析miR-146a-5p相對(duì)表達(dá)水平與血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較病例組、對(duì)照組年齡、孕周等項(xiàng)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

2.2 兩組血清miR-146a-5p 相對(duì)表達(dá)水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值與對(duì)照組相比，病例組血清AFP、β-hCG MOM 值及血清miR-146a-5p 相對(duì)表達(dá)水平較高（P＜0.05），uE3MOM 值較低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組孕婦血清miR-146a-5p水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM值比較∕

表2 兩組孕婦血清miR-146a-5p水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM值比較∕

注：miR-146a-5p為微RNA-146a-5p，AFP為血清甲胎蛋白，MOM為中位數(shù)倍數(shù)，uE3為游離雌三醇，β-hCG為人絨毛膜促性腺激素。

2.3 血清miR-146a-5p 相對(duì)表達(dá)水平與血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值相關(guān)性分析Pearson 法分析顯示，miR-146a-5p 與AFP、β-hCG 呈正相關(guān)（r=0.41，r=0.46，均P＜0.001），與uE3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57，P＜0.001），見圖1。

圖1 孕中期唐氏綜合征的孕婦微RNA-146a-5p（miR-146a-5p）與甲胎蛋白（AFP）、人絨毛膜促性腺激素（β-hCG）、游離雌三醇（uE3）相關(guān)性分析：A為AFP相關(guān)性分析；B為β-hCG相關(guān)性分析；C為uE3相關(guān)性分析

2.4 miR-146a-5p聯(lián)合三聯(lián)法對(duì)孕中期唐氏綜合征的預(yù)測(cè)價(jià)值分析以因變量對(duì)照組定義為0，孕中期唐氏綜合征定義為1，自變量分別為miR-146a-5p、AFP+uE3+β-hCG（三聯(lián)）及miR-146a-5p 聯(lián)合三聯(lián)的預(yù)測(cè)概率（經(jīng)miR-146a-5p、AFP、uE3、β-hCG 二元logistic 回歸得到），進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，AFP、uE3、β-hCG 預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的曲線下面積（AUC）及其95%CI分別為0.74（0.66，0.83）、0.78（0.70，0.86）、0.76（0.67，0.84）；AFP+uE3+β-hCG預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的AUC 及其95%CI為0.85（0.78，0.92）；miR-146a-5p預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的AUC 及其95%CI為0.86（0.79，0.93）；miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的AUC 及其95%CI為0.91（0.86，0.96），靈敏度為86.20%，特異度為80.00%。其中miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 預(yù)測(cè)AUC 值高于AFP+uE3+β-hCG 預(yù)測(cè)AUC值（Z=1.79，P＜0.05），見表3。

表3 miR-146a-5p聯(lián)合三聯(lián)法對(duì)孕中期唐氏綜合征的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

3 討論

隨著優(yōu)生優(yōu)育政策的全面普及，孕產(chǎn)婦產(chǎn)前篩查意識(shí)逐漸增強(qiáng)。AFP、uE3、β-hCG 三聯(lián)是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的血清聯(lián)合篩查物，具有較高的安全性［8］。AFP 由胎兒肝臟和卵黃囊分泌的糖蛋白，通過胎兒的泌尿系統(tǒng)被排泄到羊水中，羊水中AFP 可被轉(zhuǎn)運(yùn)到母體血液中［9］。正常妊娠女性血液中AFP 濃度隨孕周增加而逐步升高。若胎兒肝臟發(fā)育不全，母體血液中AFP濃度會(huì)相應(yīng)下降［10］。uE3是由胎兒及胎盤分泌，其表達(dá)水平隨孕周增加逐漸上升，大約在孕90 d 時(shí)達(dá)到峰值［11］。uE3 可在胎兒宮內(nèi)發(fā)育過程中具有較好的調(diào)節(jié)作用［12］。hCG主要由胎盤、滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的孕期激素。hCG 可吸附在滋養(yǎng)層細(xì)胞表面而阻止母體淋巴細(xì)胞攻擊胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞［13］。在孕周范圍14～20 周時(shí)，hCG 濃度將隨著孕周增加而逐漸下降，但唐氏綜合征病兒由于胎盤發(fā)育速度較慢，導(dǎo)致hCG 下降速度較為緩慢，由此發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征孕婦血清中hCG 水平較同孕周的正常孕婦高［14］。本研究發(fā)現(xiàn)病例組血清AFP、β-hCG MOM 值水平較對(duì)照組高，uE3MOM 值較對(duì)照組低（P＜0.05），AFP+uE3+β-hCG 預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的AUC 為0.85，靈敏度為83.10%，特異度為75.40%，提示三聯(lián)法對(duì)預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

妊娠期胎盤可表達(dá)獨(dú)特的miRNA，其中滋養(yǎng)層miRNA 可被微粒體攜帶進(jìn)而被大量釋放到母體血液中，參與細(xì)胞增殖和分化，由此猜測(cè)miRNA 可能與妊娠期疾病發(fā)生相關(guān)［15-16］。母胎細(xì)胞間通信依賴于滋養(yǎng)層的侵襲和遷移。許多研究已經(jīng)闡明了miRNA 在滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)展中的重要作用。miR-146a 是位于人染色體5q34 上，可通過靶向多個(gè)基因從而在機(jī)體中發(fā)揮作用。miR-146a-5p 參與細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。陳芳榮等［17］研究顯示，子癇前期胎盤組織中miR-146a-3p 高表達(dá)，miR-146a-3p是通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞而參與子癇前期疾病發(fā)生。miR-146a-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力有抑制作用［18］。Peng 等［19］研究顯示，子癇前期胎盤組織中miR-146a-5p 呈高表達(dá)，且miR-146a-5p 過表達(dá)會(huì)抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲，從而介導(dǎo)子癇前期疾病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)病例組血清miR-146a-5p表達(dá)水平較對(duì)照組高，提示miR-146a-5p 可能影響唐氏綜合征發(fā)生。猜測(cè)miR-146a-5p 可能通過影響胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖而影響hCG 表達(dá)水平變化最終影響唐氏綜合征疾病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p 預(yù)測(cè)孕中期唐氏綜合征的AUC 為0.86，靈敏度為81.50%，特異度為87.70%，miR-146a-5p 與AFP、β-hCG 呈正相關(guān)，與uE3呈負(fù)相關(guān)，ROC 分析顯示，miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 預(yù)測(cè)子孕中期唐氏綜合征的AUC為0.91，診斷價(jià)值高于三聯(lián)法。

綜上所述，母體血清中miR-146a-5p 對(duì)唐氏綜合征的診斷效能優(yōu)于AFP、uE3、β-hCG 單獨(dú)診斷效能，miR-146a-5p聯(lián)合三聯(lián)法對(duì)孕中期唐氏綜合征的診斷效能具有較高的臨床價(jià)值。但本研究樣本來源單一，樣本數(shù)量有限，后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本中心，對(duì)本研究進(jìn)行深入探討。