氧化苦參堿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎性細(xì)胞因子與腸道菌群的影響

徐德榮，徐志紅，陳磊垚，許立

作者單位：1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210014；2南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210046

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是由基因易感性人群中腸上皮功能障礙、腸道菌群和腸黏膜免疫應(yīng)答平衡失調(diào)引起的炎癥性腸道疾?。↖BD）［1-2］?，F(xiàn)有藥物和療法有缺陷，氨基水楊酸、單克隆抗體類無法使大部分病人獲得臨床緩解，而皮質(zhì)類固醇或免疫抑制劑等藥物不良反應(yīng)過大。因此，急需尋找安全有效的中藥治療UC。

腸道微生物包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、病毒和原生生物，其中細(xì)菌負(fù)荷量約為3.9×1013，與人體自身細(xì)胞數(shù)量接近［3］。腸道菌群在腸道蠕動(dòng)、腸屏障功能、免疫系統(tǒng)成熟和UC 發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用［4］。調(diào)整紊亂的腸道菌群可能是UC 治療的突破口之一。從苦參根中分離得到氧化苦參堿具有抗病毒、抗炎、促進(jìn)凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和心血管保護(hù)作用［5-6］。本研究在2022 年1—3 月從抗炎與調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)切入，探求氧化苦參堿治療UC的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物氧化苦參堿（Aladdin 公司，批號(hào)A111285）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，36–50 kDa，MP 公司，批號(hào)S3045）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β ELISA 試劑盒（Biolegend 公司，批號(hào)分別為B262395、B282759、B293243）；5-氨基水楊酸（上海源葉，批號(hào)SS0905CA24）。

1.2 儀器全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo）；IX71 熒光顯微鏡（日本Olympus）。

1.3 動(dòng)物C57BL∕6 小鼠，雌雄：雄性，潔凈級(jí)別：SPF 級(jí)，周齡范圍8～10 周，體質(zhì)量（20±2）g，揚(yáng)州大學(xué)供應(yīng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證書編號(hào)為202008024。室內(nèi)溫度范圍20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光照節(jié)律12 h∕12 h，自由進(jìn)食和飲水。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.4 造模與給藥60 只C57BL∕6 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為六組：空白組、模型組、5-氨基水楊酸組（50 mg∕kg）、氧化苦參堿低劑量組（50 mg∕kg）、氧化苦參堿中劑量組（100 mg∕kg）、氧化苦參堿高劑量組（200 mg∕kg），每組10 只。模型組、5-氨基水楊酸組及氧化苦參堿低、中、高劑量組小鼠自由飲用3%DSS溶液連續(xù)7 d，建立UC模型。自造模日起，5-氨基水楊酸組及氧化苦參堿低、中、高劑量組按劑量灌胃，每天1 次，連續(xù)10 d。每天觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、觀察糞便性狀和便血情況。最后一次給藥后禁食不禁水。將小鼠脫頸椎處死，取出結(jié)腸，擠出結(jié)腸部位糞便后放在-80 ℃冰箱冷凍。結(jié)腸組織用生理鹽水沖洗后，部分用10%福爾馬林固定，部分保存在-80 ℃冰箱，以備后續(xù)分析。

1.5 結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評(píng)估結(jié)腸組織用10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切片（4 μm 厚度），然后用蘇木精和伊紅（HE）染色。根據(jù)病變范圍、病變深度、隱窩損害程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況等評(píng)估病理損傷，計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)性指數(shù)（DAI）［7］。

1.6 ELISA 法檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子含量取保存于-80 ℃冰箱的小鼠結(jié)腸組織，稱定50 mg，剪碎后加入10倍量磷酸緩沖鹽溶液混合并充分勻漿，3 000 r∕min 離心20 min 后取上清液，參考ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程測(cè)定各炎性因子含量。

1.7 腸道菌群分析微生物DNA 提取后，采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)各組腸道菌群。采用基因通用引物對(duì)16S rDNA 基因V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并根據(jù)制造商的說明在Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增子焦磷酸測(cè)序（美吉生物制藥科技有限公司）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，觀測(cè)資料為計(jì)量資料，以表示，均符合正態(tài)分布。多組間比較采用單因素方差分析，總體有差異進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿緩解DSS誘導(dǎo)的UC空白組小鼠毛發(fā)光澤、體質(zhì)量上升、精神與活動(dòng)良好、飲水進(jìn)食與糞便均正常。模型組小鼠毛發(fā)粗糙、精神萎靡、慵懶少動(dòng)。5-氨基水楊酸組和氧化苦參堿各劑量組小鼠造模期間毛發(fā)光澤、精神與活動(dòng)情況、飲水進(jìn)食量改變，出現(xiàn)稀便、血便等癥狀。氧化苦參堿各給藥組小鼠癥狀較模型組有所減輕?？瞻捉M、模型組、5-氨基水楊酸組、氧化苦參堿低、中、高劑量組的DAI 評(píng)分分別為（0.00±0.00）分、（2.63±0.25）分、（0.62±0.06）分、（1.84±0.21）分、（1.56±0.17）分 和（1.08±0.12）分。與空白組比較，模型組小鼠DAI 評(píng)分顯著升高（F=67.45，P＜0.001）；與模型組比較，氧化苦參堿低、中、高劑量組小鼠DAI 評(píng)分顯著降低（F=67.45，P＜0.001）。由圖1A 可知，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較空白組顯著變短（P＜0.001）；氧化苦參堿中、高劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較模型組明顯增長(zhǎng)（P＜0.001）。結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)果顯示（圖1B），模型組結(jié)腸黏膜組織隱窩結(jié)構(gòu)被破壞、杯狀細(xì)胞減少、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，模型組病理學(xué)評(píng)分較空白組明顯升高（P＜0.001）；經(jīng)氧化苦參堿干預(yù)后，結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)清晰且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，氧化苦參堿中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織病理組織學(xué)評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.001）。表明，苦參堿可以較好改善UC小鼠癥狀，且與劑量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

圖1 氧化苦參堿對(duì)結(jié)腸損傷程度的影響：1A為結(jié)腸長(zhǎng)度；1B為結(jié)腸組織切片（HE染色×200）圖2 基于物種數(shù)豐度的主坐標(biāo)分析圖3 氧化苦參堿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群在門水平和屬水平組成的影響：3A為門水平；3B為屬水平

2.2 氧化苦參堿降低UC小鼠體內(nèi)炎癥水平模型組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子表達(dá)水平均顯著大于空白組（P＜0.001）。與模型組比較，氧化苦參堿各劑量組顯著降低TNF-α、IL-1β 含量（P＜0.05，P＜0.001）。而在氧化苦參堿各劑量組中，高劑量組顯著降低UC 小鼠結(jié)腸組織中IL-6 含量（P＜0.05，P＜0.001）。見表1。

表1 各組小鼠中氧化苦參堿降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子含量比較∕（ng∕g，）

表1 各組小鼠中氧化苦參堿降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子含量比較∕（ng∕g，）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素-6，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β。①與空白組比較，P＜0.001。②與模型組比較，P＜0.001。③與模型組比較，P＜0.05。

2.3 腸道菌群alpha多樣性分析本測(cè)序?qū)ξ锓N的覆蓋度均大于99%（Coverage 指數(shù)），說明測(cè)序幾乎涵蓋所有序列。模型組群落多樣性（Sobs 指數(shù)、Shannon 指數(shù)）及物種豐富度（Chao 指數(shù)）較空白組顯著降低（P＜0.001）。氧化苦參堿可以增加UC 小鼠腸道群落多樣性及物種豐富度，具體見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群alpha多樣性指數(shù)∕

表2 各組小鼠腸道菌群alpha多樣性指數(shù)∕

注：①與空白組相比，P＜0.001。②與模型組相比，P＜0.05。③與模型組相比，P＜0.001。④與模型組相比，P＜0.01。

2.4 樣本比較分析由圖2 可知，模型組與空白組樣本之間距離較遠(yuǎn)，而且沒有交集，所以模型組與空白組小鼠腸道菌群組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氧化苦參堿各給藥組隨著劑量增加逐漸接近空白組，且明顯近于模型組，表明氧化苦參堿可以調(diào)整UC 小鼠腸道菌群組成，使其朝著健康狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化。

2.5 物種組成分析Firmicutes和Bacteroidetes是兩個(gè)最重要的細(xì)菌門類，它們豐度之和占61.4%～85%。在模型組中，Proteobacteria豐度升高，而Actinobacteriota豐度、Firmicutes和Bacteroidetes豐 度比降低，說明UC 小鼠的腸道菌群發(fā)生紊亂。氧化苦參堿給藥后，與模型組相比，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes豐度比顯著提高，Proteobacteria豐度降低，Actinobacteriota豐度升高（圖3A）。共檢測(cè)到50 個(gè)細(xì)菌屬類。模型組較空白組Lactobacillus、Bifidobacterium和Akkermansia豐度顯著降低，Escherichia-Shigella、Desulfovibrio、Blautia、Parasutterella、Turicibacter和Bacteroides豐度顯著升高。氧化苦參堿給藥后，與模型組相比，Lactobacillus、Bifidobacterium和Akkermansia豐度顯著升高，Escherichia-Shigella、Desulfovibrio、Blautia、Parasutterella、Turicibacter和Bacteroides豐度顯著降低（圖3B）。

2.6 物種差異分析通過前期研究，氧化苦參堿高劑量組對(duì)UC 小鼠體質(zhì)量、DAI、HE、病理組織學(xué)評(píng)分、促炎細(xì)胞因子含量的改善效果最好。因此，選擇高劑量組為代表做腸道菌群部分的物種差異分析。在門水平上，Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Patescibacteria在空白組、模型組、氧化苦參堿高劑量組小鼠之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在屬水平上，Lactobacillus、Escherichia-Shigella、norank_f_Muribaculaceae、Enterococcus、Dubosiella、Turicibacter、Romboutsia、Bifidobacterium、Bacteroides、Faecalibaculum、Vagococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnoclostrium、Enterorhabdus、Klebsiella在空白組、模型組、氧化苦參堿高劑量組小鼠之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3，4。

表3 采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)各組小鼠腸道菌群在門水平物種差異∕%

3 討論

DSS 能夠破壞腸道黏膜屏障功能，從而使細(xì)菌接觸到腸固有層細(xì)胞［8-9］。DSS 還會(huì)引起嚴(yán)重的病理損傷，如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞［10］。我們使小鼠自由飲用3%DSS水溶液建立UC 小鼠模型，探討氧化苦參堿是否可以改善疾病癥狀以及對(duì)炎性因子和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

IBD 是一種自身免疫性疾病，過量的源于免疫細(xì)胞的炎性因子可引起黏膜損傷及持續(xù)的炎癥反應(yīng)。TNF-α可促進(jìn)IL-1β和IL-6的產(chǎn)生、成纖維細(xì)胞的增殖、黏附分子的表達(dá)、促凝因子的激活和急性反應(yīng)的激發(fā)［11］。TNF-α高表達(dá)可能導(dǎo)致黏膜屏障功能障礙，引發(fā)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)［12］。IBD 中IL-1β表達(dá)的增加可能是由于巨噬細(xì)胞激活I(lǐng)L-1β 轉(zhuǎn)化酶，從而釋放成熟的IL-1β 到結(jié)腸黏膜［13］。IL-6 是典型的促炎因子，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)的急性期分泌。UC 病人的血清和組織活檢中發(fā)現(xiàn)IL-6 增加［14］。本研究結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致：UC模型組中TNF-α、IL-1β、IL-6 三種炎癥細(xì)胞因子水平較空白組顯著增加［15］。通過對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿對(duì)炎性因子呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。

人類腸道內(nèi)微生物數(shù)量龐大，被稱為“人體器官”或“人類第二基因組”［16］。目前，已知的細(xì)菌門類有52 種，其中5～7 種細(xì)菌門類存在于哺乳動(dòng)物的胃腸道中。雖然優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)較少，但據(jù)估計(jì)，超過1 000 種細(xì)菌的基因數(shù)量是宿主基因的150 多倍［17］。這一龐大的微生物群為宿主提供了互補(bǔ)的遺傳資源，如必需維生素的生產(chǎn)、獲取能量的途徑、免疫系統(tǒng)的發(fā)育和腸道的成熟。我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，各組別的主要菌群均是Firmicutes和Bacteroidetes，其次為Actinobacteriota和Proteobacteria，與Cui 等［18］、陶金華［19］的研究結(jié)果一致。在UC 病人中發(fā)現(xiàn)，有益菌降低且有害菌增加［20］。有研究表明，Bifidobacterium可以降低腸道內(nèi)環(huán)境pH，阻止腐敗菌、病原菌生長(zhǎng)，維持腸道屏障功能，降低肉毒素侵入血液［21］。UC 小鼠經(jīng)氧化苦參堿干預(yù)后，Bifidobacterium相對(duì)豐度增加。DSS 干預(yù)后的小鼠腸道菌群中Lactobacillus相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，氧化苦參堿干預(yù)后具有上升趨勢(shì)，且Lactobacillus可以促進(jìn)乳酸的生成，有益于人體消化吸收碳水化合物，降低腸道內(nèi)環(huán)境pH，抑制有害菌黏附于腸上皮，刺激產(chǎn)生免疫球蛋白，增強(qiáng)宿主免疫力［22］。Wang 等［23］證實(shí)DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠腸道中Bacteroides相對(duì)豐度增加，且Bacteroides損害腸道免疫系統(tǒng)。我們亦發(fā)現(xiàn)，模型組中Bacteroides相對(duì)豐度增加，經(jīng)氧化苦參堿干預(yù)后降低。由此可見，氧化苦參堿可有效增加益生菌含量，抑制致病菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。

表4 采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)各組小鼠腸道菌群在屬水平物種差異∕%

腸道菌群失調(diào)與UC 密切相關(guān)，但是腸道微生態(tài)與UC 的關(guān)系尚不完全明確。我們從腸道微生物角度入手，探索氧化苦參堿對(duì)UC 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿對(duì)UC 小鼠腸道菌群多樣性與結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用與其對(duì)UC 的治療作用呈現(xiàn)相關(guān)性。但是，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變是氧化苦參堿治療UC 的途徑還是結(jié)果，目前尚不能得出結(jié)論。我們將進(jìn)一步結(jié)合多組學(xué)技術(shù)從腸道菌群角度深層次探究氧化苦參堿治療UC的作用機(jī)制。

（本文圖1～3見插圖6-5）