黑木耳黑色素的液體發(fā)酵培養(yǎng)及提取工藝研究

王小漫 柴新義 于士軍 向玉勇 孫星

摘要 為提高黑木耳黑色素的產(chǎn)量，以堿溶酸沉法對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中的黑色素進(jìn)行提取，以黑色素得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對黑木耳黑色素的液體發(fā)酵生產(chǎn)及提取工藝條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，黑木耳黑色素的最優(yōu)液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件為起始pH 5.5、25 ℃、培養(yǎng)9 d；最佳提取工藝條件為NaOH濃度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h。黑木耳黑色素得率可達(dá)1.55%。研究結(jié)果可為黑木耳工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素提供重要的參考。

關(guān)鍵詞 黑木耳黑色素；液體發(fā)酵；黑色素得率；工藝條件優(yōu)化

中圖分類號 Q939.96? ?文獻(xiàn)標(biāo)識號 A

文章編號 1007-7731（2023）05-0031-06

Study on Liquid Fermentation Culture and Extraction Technology of Melanin from

Auricularia auriculata

WANG Xiaoman? ?CHAI Xinyi? ?YU Shijuan? ?XIANG Yuyong? ?SUN Xing

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou Anhui 239000）

Abstract In order to improve the yield of Auricularia auricula melanin， the melanin in liquid fermentation mycelium of Auricularia auricula was extracted by alkali solution and acid precipitation. Taking the yield of melanin as the index， the liquid fermentation production and extraction conditions of Auricularia auricula melanin were studied by single factor test and orthogonal design test. The results showed that the optimum liquid fermentation conditions of Auricularia auricula melanin were as follows：initial pH 5.5， 25 ℃ and culture for 9 days; The optimum extraction conditions were NaOH concentration of 2 mol/L，solid-liquid ratio of 1∶40 and extraction for 1.5 h. The yield of melanin from Auricularia auricula can reach 1.55%. The results can provide an important reference for the industrial liquid fermentation of Auricularia auricula to produce melanin.

Keywords Auricularia auricula melanin; liquid fermentation; melanin yield; optimization of process conditions

黑木耳（Auricularia auricula）隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia），在我國云南、東北、河南等多地廣泛分布[1]。黑木耳中富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、黑色素、黃酮、多酚等多種生物活性化合物，兼有優(yōu)良的食用與藥用價(jià)值[2]。其中，黑色素是黑木耳最主要的活性物質(zhì)之一，黑木耳子實(shí)體呈現(xiàn)黑褐色就是其富含黑色素的緣故[3]。黑色素是一種氨基酸衍生物，是由多羥基酚類或吲哚類物質(zhì)氧化聚合而成的大分子疏水性生物聚合體[4]。黑木耳黑色素的安全性高，且具有抗輻射、抗氧化、清除自由基與提高免疫力等多方面的生理功能，是極具發(fā)展?jié)摿Φ奶烊还δ苄陨豙5-9]。黑木耳的傳統(tǒng)栽培是采用固體菌種進(jìn)行接代轉(zhuǎn)接，每一代都需要經(jīng)過60～90 d的栽培，周期較長，同時(shí)由于環(huán)境等不可控因素會導(dǎo)致栽培過程中容易出現(xiàn)菌齡不一致、污染率高以及生產(chǎn)效率低下等問題。微生物深層液體發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的逐步成熟，因其具有周期短、成本低、便于分離純化等優(yōu)勢而引起廣泛關(guān)注[10-11]。已有研究表明，深層液體發(fā)酵的黑木耳在營養(yǎng)價(jià)值以及生理活性方面并不比傳統(tǒng)栽培技術(shù)獲得的黑木耳低，其中液體發(fā)酵的成分含量甚至高于黑木耳子實(shí)體中的含量[12-15]。鑒于此，為提高黑木耳黑色素的產(chǎn)量，本研究以堿溶酸沉法對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中的黑色素進(jìn)行提取，以黑色素得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對黑木耳黑色素的液體發(fā)酵生產(chǎn)及提取工藝條件進(jìn)行了研究，以期為黑木耳黑色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。本試驗(yàn)使用黑木耳109菌種，購自山東耀勝生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。PDA培養(yǎng)基（南通凱恒生物科技有限公司）；葡萄糖（天津市匯杭化工有限公司）、酵母膏（杭州百思生物技術(shù)有限公司）、MgSO4·7H2O（上海強(qiáng)順化工有限公司）、KH2PO4（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、HCl、NaOH（上海振企化學(xué)試劑有限公司）等均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備。高壓蒸汽滅菌鍋（BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋）；超凈工作臺（SW-CJ-1BU，蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠）；高速離心機(jī)（H2-16K，湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；搖床（ZD-85A，常州國宇儀器制造有限公司）；培養(yǎng)箱（DNP-9402AE型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；干燥箱（DHG-9203A，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化。配置PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然），將培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿放入高壓蒸汽鍋滅菌。滅菌后，在超凈工作臺制作PDA平板，并使用接種環(huán)挑取黑木耳斜面菌種，接種于PDA平板，然后將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)。液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方[16]：20%葡萄糖，2%酵母膏，0.2% KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O。將上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基按照40%的裝液量分別裝于250 mL的錐形瓶中，隨后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌冷卻后，于超凈工作臺無菌條件下用接種環(huán)挑取3～4個(gè)約1 cm2大小的菌種塊，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。接種后，為讓菌種充分活化，便于菌種萌發(fā)，將三角瓶先置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 d。第2 d再置于25 ℃的搖床中以150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.3 黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素的提取。用8層紗布過濾黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)液中的菌絲體，并用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾2～3次，過濾后的菌絲體置于65 ℃的干燥箱中干燥24 h，取干燥后的菌絲體置于研缽中研磨成顆粒狀或者粉狀，保存?zhèn)溆?。采用堿溶酸沉法進(jìn)行黑色素的提取[17-18]，其具體操作步驟：①精確稱取0.2 g黑木耳菌絲體粉末狀樣品，加入試管中，按照1∶30的料液比，加入1 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻后，置于80 ℃水浴鍋中浸提1 h；②使用高速離心機(jī)在10 000 r/min的條件下對步驟①的浸提液離心15 min，離心后取上清液置于試管中；③使用1.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.5，隨后放入水浴鍋中浸提12 h；④12 h后，將浸提液7 500 r/min高速離心10 min，保留沉淀?xiàng)壣锨逡?，此時(shí)的沉淀即為黑色素粗品；⑤重復(fù)①～④步驟2～3次，使用去離子水對最終沉淀物反復(fù)清洗3～4次，收集沉淀物，即為黑色素純品，干燥后置于-20 ℃保存。

1.2.4 黑色素得率的測定。黑色素的質(zhì)量采用恒重差值法測定。將培養(yǎng)皿和濾紙?zhí)崆爸糜?05 ℃干燥箱中，烘干至恒重（±0.000 1 g），稱重。將上述提取的黑色素產(chǎn)品倒入已恒重的裝有濾紙的培養(yǎng)皿中再次烘干至恒重，稱量。前后差值即為黑色素純品的質(zhì)量。黑色素得率計(jì)算公式：黑色素得率（%）=（黑木耳黑色素純品質(zhì)量÷黑木耳菌絲體質(zhì)量）×100。

1.2.5 黑木耳黑色素液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究。（1）最適起始pH篩選。因?yàn)楹谀径L環(huán)境為酸性[19]，所以分別設(shè)置起始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照40%的裝液量將搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在250 mL三角瓶中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個(gè)約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1 d，再放入25 ℃的搖床中以150 r/min培養(yǎng)7 d。按照1.2.4中的方法進(jìn)行黑木耳黑色素得率的測定。

（2）最適溫度篩選。使用上述篩選得到的最適pH，按照40%的裝液量將液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在250 mL的三角瓶中，共計(jì)15瓶。在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個(gè)約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1 d，然后，分別置于17、21、25、29、33℃的培養(yǎng)溫度下，以150 r/min培養(yǎng)7 d，每個(gè)不同處理3個(gè)重復(fù)。隨后，按照1.2.3和1.2.4中的方法進(jìn)行黑木耳黑色素得率的測定。

（3）最適培養(yǎng)天數(shù)篩選。利用上述篩選得到的最佳培養(yǎng)起始pH配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照40%的裝液量將液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在250 mL三角瓶中，共計(jì)15瓶。在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個(gè)約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1 d，然后以轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床分別培養(yǎng)5、7、9、11、13 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。隨后，按照1.2.4中的方法進(jìn)行黑木耳黑色素得率的測定。

1.2.6 黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素的提取工藝研究。（1）最適浸提時(shí)間篩選。按照1.2.3中方法，獲得黑木耳液體發(fā)酵菌絲體粉末狀樣品。在采用堿溶酸沉法進(jìn)行黑色素的提取時(shí)，分別設(shè)置浸提時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的不同試驗(yàn)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，根據(jù)1.2.4中的方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素的最佳浸提時(shí)間。

（2）浸提最適NaOH濃度篩選。在采用堿溶酸沉法進(jìn)行黑色素的提取時(shí)，設(shè)置NaOH濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的5個(gè)不同處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。根據(jù)上述試驗(yàn)篩選的最佳浸提時(shí)間進(jìn)行黑木耳液體發(fā)酵菌絲體粉末狀樣品中黑色素的提取，根據(jù)1.2.4中的方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素提取時(shí)的最佳NaOH濃度。

（3）浸提最適料液比篩選。采用堿溶酸沉法進(jìn)行黑色素的提取時(shí)，料液比分別按照1∶20、1∶25、1∶30、

1∶35、1∶40 5個(gè)不同的試驗(yàn)處理進(jìn)行設(shè)置，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。依據(jù)上述試驗(yàn)篩選的最佳浸提時(shí)間和NaOH濃度進(jìn)行黑木耳液體發(fā)酵菌絲體粉末狀樣品中黑色素的提取，根據(jù)1.2.4中方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素提取時(shí)的最佳料液比。

1.2.7 黑木耳黑色素生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化研究。為提高黑木耳黑色素的產(chǎn)量，對不同的液體發(fā)酵條件對黑木耳黑色素得率的影響進(jìn)行了研究。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化研究，選取最優(yōu)的溫度、pH以及培養(yǎng)天數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)組，每個(gè)組合3個(gè)重復(fù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理。利用Microsoft Excel 2020對各組單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理以及繪圖。利用IBM SPSS Statistics 26的ANOVA功能對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析以及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳黑色素液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究

2.1.1 黑木耳黑色素發(fā)酵生產(chǎn)最適起始pH的篩選。由圖1可知，黑木耳在pH 5.5的條件下黑色素的得率最高，在pH低于5時(shí)黑色素的合成會受到抑制。這和黑木耳的生長環(huán)境有關(guān)，黑木耳菌絲的生長環(huán)境呈微酸性，黑木耳在生長過程分解蛋白質(zhì)、淀粉以及纖維素等碳源和能源供于自身生長時(shí)，所需要的纖維素酶以及其他生長合成所需要的酶在偏酸的條件下活性高，但是酸性過強(qiáng)條件下可能會發(fā)生酪氨酸酶結(jié)構(gòu)的異變從而影響黑色素得率。這與侯若琳等人的研究結(jié)果較為一致，侯若琳等[20]在采用纖維素酶聯(lián)合超聲提取的方法對黑木耳黑色素進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，在pH為5時(shí)，黑木耳菌絲獲得率較高，因而黑木耳黑色素得率最高。

2.1.2 黑木耳黑色素發(fā)酵生產(chǎn)最適培養(yǎng)溫度的篩選。由圖2可見，溫度是考察黑色素培養(yǎng)工藝路線的一個(gè)重要指標(biāo)，在25～33 ℃這個(gè)范圍內(nèi)黑色素得率較高，29 ℃時(shí)，黑木耳黑色素得率最高，這與黑木耳的生長習(xí)性有關(guān)，黑木耳是中溫性真菌，溫度過高或過低都會抑制菌絲體的生長以及其體內(nèi)酪氨酸酶的活性[21]。但本試驗(yàn)液體發(fā)酵過程中，雖然29 ℃下所提取的黑色素含量最高，但其黑色素得率與在25 ℃處理之間差異不顯著。所以，從節(jié)約能源和降低成本方面考慮，生產(chǎn)中應(yīng)選擇25 ℃作為黑木耳液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的最佳溫度。

2.1.3 黑木耳黑色素發(fā)酵生產(chǎn)最適培養(yǎng)時(shí)間的篩選。圖3結(jié)果表明，培養(yǎng)天數(shù)對結(jié)果影響比較顯著，在第9 d時(shí)提取的黑色素得率最高，低于7 d以及高于11 d時(shí)黑色素含量明顯下降。這與菌絲的生長規(guī)律有關(guān)，培養(yǎng)時(shí)間過短黑色素未充分合成，時(shí)間過長黑色素被分解因此得率較低。張穎等[22]在通過研究刺五加水提液對黑木耳發(fā)酵及其胞內(nèi)多糖的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)規(guī)律，隨著黑木耳菌絲體液體發(fā)酵時(shí)間的延長，菌量不斷增加，但在第9 d后，菌絲體干重開始趨于穩(wěn)定，說明發(fā)酵9 d能滿足黑木耳菌株菌絲體的充分生長，繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間對菌絲體生長意義不大，因此選擇9 d為最適發(fā)酵時(shí)長。

2.2 黑木耳發(fā)酵菌絲體中黑色素的提取工藝研究

2.2.1 黑木耳發(fā)酵菌絲體最佳浸提時(shí)間的篩選。結(jié)果表明（見圖4），隨著浸提時(shí)間的延長，黑色素得率不斷增加，1.5 h時(shí)達(dá)到最高，但當(dāng)浸提時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，黑色素得率卻開始下降。究其原因可能是因?yàn)楹谏氐奶崛》蛛x需要一定的時(shí)間，時(shí)間過短提取不充分，時(shí)間過長黑色素可能發(fā)生解離，且隨著浸提時(shí)間的延長，提取液的濃度和料液比發(fā)生變化，對黑色素的提取效果也會造成影響[5]，因此最佳浸提時(shí)間為1.5 h。

2.2.2 黑木耳發(fā)酵菌絲體中黑色素提取的最佳浸提NaOH濃度的篩選。鑒于堿溶液對黑色素選擇性高，溶解力強(qiáng)，提取率高，所以本試驗(yàn)采用堿溶的方法對黑色素進(jìn)行溶解分離，結(jié)果表明（圖5），NaOH濃度在2 mol/L時(shí)，提取效果最好。超過這個(gè)濃度，黑色素得率呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，這是由于堿性過強(qiáng)會造成黑色素等活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，而堿性過低時(shí)無法充分溶解菌絲體中的黑色素，因此都會導(dǎo)致黑色素的得率降低。綜上所述，選擇2 mol/L作為黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中黑色素提取的最佳NaOH濃度。

2.2.3 黑木耳發(fā)酵菌絲體中黑色素提取的最佳料液比篩選。由圖6可知，在1∶20～1∶40的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，黑色素的得率不斷上升，這是由于隨著料液比的比例不斷增加，體系中NaOH的占比逐漸升高，對黑色素的析出效果逐漸增強(qiáng)。因此，本試驗(yàn)選用1∶40為最佳提取料液比。

2.3 黑木耳黑色素液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取最佳溫度、起始pH、培養(yǎng)時(shí)間等3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)組，每個(gè)組合3個(gè)重復(fù)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

黑木耳黑色素液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中的黑色素得率影響的主次排序?yàn)锳（pH）>B（培養(yǎng)天數(shù)）>C（溫度），說明pH對黑色素得率的影響最大，為主要影響因素，溫度對黑色素得率的影響最小。3種因素最佳組合為A2B2C1，即pH為5.5，培養(yǎng)天數(shù)為9 d、溫度為25 ℃，此時(shí)的黑木耳黑色素得率可達(dá)1.55%。

3 結(jié)論與討論

黑色素作為黑木耳的主要活性成分之一，在其生物功效上發(fā)揮著重要作用，如何高效生產(chǎn)和提取黑木耳黑色素對生產(chǎn)應(yīng)用十分重要。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果表明，黑木耳黑色素的最優(yōu)液體發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)條件為起始pH 5.5、25℃、培養(yǎng)9 d。針對黑色素在堿性溶液中溶解度高，而酸性溶液中溶解度往往較小的原理，我們采用堿溶酸沉法提取黑色素。堿溶酸沉法是黑色素提取中最常用的方法，具有操作簡便、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，從黑木耳液體發(fā)酵菌絲體中提取黑色素的最佳提取工藝條件為NaOH濃度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h，黑木耳黑色素得率可達(dá)1.55%。

王謙等[23]采用單因子分析和正交實(shí)驗(yàn)，對黑木耳深層液體發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并得到了適合液體發(fā)酵的最佳條件為pH 5.0，培養(yǎng)溫度28 ℃。范心樂等[5]通過對毛木耳的提取工藝優(yōu)化研究，表明在NaOH濃度為1.5 mol/L時(shí)黑色素提取率最高。李琦等[24-26]通過研究黑木耳黑色素的得率影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)在浸提時(shí)間為1.5 h時(shí)黑色素得率較高；吳晨霞等[27]通過對木耳黑色素的提取優(yōu)化發(fā)現(xiàn)料液比為1∶40時(shí)，黑色素提取率最高，與本研究結(jié)果比較一致。目前對于黑木耳黑色素的研究主要集中在生物醫(yī)藥、食品工業(yè)以及微生物發(fā)酵方面，而對于其提取條件的優(yōu)化以及成分結(jié)構(gòu)等方面的研究較少[28]。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)黑木耳黑色素的提取優(yōu)化及結(jié)構(gòu)分析等方面的研究，同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)黑色素應(yīng)用方面的研究。

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（責(zé)編：張 蓓）

基金項(xiàng)目 安徽省科技廳科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化鄉(xiāng)村振興科技項(xiàng)目（202107d06020018）；安徽省高等學(xué)校本科質(zhì)量工程項(xiàng)目（2020jyxm1322、2020xsxxkc314）；滁州學(xué)院開放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（kfsy2130）。

收稿日期 2022-05-08