廣西特有植物麗萼熊巴掌開花物候與繁育系統(tǒng)研究

陳宇嬌, 王滿蓮, 唐 輝, 李 虹, 張秀姣, 劉寶玉, 郝 敏

(1.桂林理工大學(xué), 廣西 桂林 541006; 2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所, 廣西 桂林 541006;3.廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541006)

麗萼熊巴掌(PhyllagathislongiradiosaC. Chen var.pulchellaC. Chen)為野牡丹科(Melastomataceae)錦香草屬(Phyllagathis)多年生草本植物,屬大葉熊巴掌(P.longiradiosa)的一個變種,常生于海拔200～900 m的石灰?guī)r闊葉林下或蔭濕處,屬廣西特有植物,喀斯特專性植物,局限分布在廣西壯族自治區(qū)崇左市的馬山縣、龍州縣、大新縣[1-2],該物種是廣西傳統(tǒng)壯藥,壯名果媽那產(chǎn),全株入藥,具有清熱利濕、活血調(diào)經(jīng)等功效[3],植株株型緊湊,葉色常年為綠色或淡紫色,葉背紫紅色,花色鮮艷,花期早于同科植物,具有極高的園林開發(fā)潛力,可馴化后用作地被或室內(nèi)觀賞植物。課題組在桂林植物園對麗萼熊巴掌進(jìn)行了多年的引種馴化,發(fā)現(xiàn)麗萼熊巴掌在桂林生長良好,花期集中,花量大,群體花期1月左右,觀賞性很強(qiáng),但其落花落果嚴(yán)重,結(jié)實(shí)極少甚至不結(jié)實(shí),極大限制了對該種的研究和開發(fā)利用。

植物繁育系統(tǒng)是包括花部特征、開花、傳粉、受精、種子發(fā)育、花器官各部位壽命、傳粉者種類和頻率、自交親和程度以及交配系統(tǒng)等有性特征總和[4]。系統(tǒng)研究植物的開花物候和繁育系統(tǒng)有利于了解限制其繁育過程的影響因子,從而通過人為干預(yù),促進(jìn)生物多樣性保護(hù)。目前,已有對同科的細(xì)葉野牡丹(MelastomaintermediumDunn)[5]、毛菍(MelastomasanguineumSims)[6]、枝毛野牡丹(Melastomadendrisetosum)[7]、白花野牡丹(Melastomacandidumf.albiflorumJ. C. Ou)[8]等繁育系統(tǒng)的研究,但尚未見有關(guān)麗萼熊巴掌繁育系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究以麗萼熊巴掌引種居群為試驗(yàn)對象,觀測其花部形態(tài)、花期物候、花粉活力,柱頭可授性等特征,并結(jié)合套袋實(shí)驗(yàn),探究其繁育系統(tǒng)類型及結(jié)實(shí)率較低的限制因素,為該種的種質(zhì)資源保育和雜交育種研究提供基礎(chǔ)材料,便于今后對麗萼熊巴掌進(jìn)行藥用開發(fā)和園林應(yīng)用研究,豐富廣西藥用植物景觀資源種類,建立廣西特色鄉(xiāng)土植物景觀。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及研究地概況

2012 年將采自廣西壯族自治區(qū)左崇市馬山縣石山的麗萼熊巴掌,扦插繁殖后,2013年露地栽培于廣西植物研究所內(nèi)(110°18′ E、25°4′ N,海拔162 m),現(xiàn)已形成人工種群。試驗(yàn)地屬亞熱帶季風(fēng)氣候,氣候溫和、雨量充沛、光照充足、四季分明,無霜期316 d,年均溫19.1 ℃,年有效積溫6.34 ℃,雨水集中于夏季,秋季干旱多風(fēng),年均降雨量1 750 mm。

1.2 研究方法

1.2.1花期物候觀察

2022年的3月隨機(jī)選取50株麗萼熊巴掌,記錄始花期(植株花朵開放約5%的日期)、盛花期(植株花朵開放約50%的日期)及末花期(植株約95%花朵凋謝的日期);并對單株始花日(第一朵花開放的日期)、終花日(最后一朵花開放的日期)、單花序始花日、終花日、每日開花數(shù)、開花高峰期進(jìn)行觀察記錄[9]。

1.2.2花部形態(tài)觀測

隨機(jī)選取50株麗萼熊巴掌,從中標(biāo)記100朵單花,每天觀察記錄單花花部形態(tài)變化,包括花瓣、雌雄蕊空間位置的變化、柱頭顏色變化直至凋謝[9]。隨機(jī)選取20朵已經(jīng)完全盛開的花朵,用游標(biāo)卡尺測量花冠直徑、雌蕊長度、花絲長度、雄蕊藥粉囊長度、萼筒長度、花梗長,記錄雄蕊數(shù)、花萼顏色、花瓣數(shù)量、柱頭顏色。隨機(jī)選取50個花序統(tǒng)計(jì)單花序花蕾數(shù)[7]。

1.2.3花蜜分泌狀況檢測

隨機(jī)選取20朵即將開放的花朵用細(xì)眼網(wǎng)紗袋套袋?；ㄩ_后在07:00—17:00時之間,每隔2 h用10 μL微吸管檢測是否分泌花蜜[8]。

1.2.4雜交指數(shù)的估算

隨機(jī)選取20朵花,測量記錄花朵直徑、柱頭和花藥的空間位置、花藥開裂與柱頭可授性的時間間隔。依據(jù)Dafni[10]的標(biāo)準(zhǔn)估算雜交指數(shù)值。

1.2.5花粉-胚珠比測定

隨機(jī)摘取即將開放的花蕾帶回實(shí)驗(yàn)室,選取3朵花各取1枚花藥,細(xì)心解剖,將花粉全部移至刻度試管中,用蒸餾水定容至1.5 mL。在振蕩機(jī)內(nèi)充分搖勻后,用移液槍吸取0.1 μL的花粉懸液于血球計(jì)數(shù)板上,在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉數(shù),每個重復(fù)3次,計(jì)算單花藥平均花粉數(shù),乘以花藥數(shù)即為單花花粉數(shù)。隨機(jī)選取10朵花的子房進(jìn)行解剖,于體視顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)單花胚珠數(shù)[5]。

花粉胚珠比=單花花粉總量/單花胚珠數(shù)。

1.2.6花粉粒、柱頭形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

摘取完全盛開的花朵,用鑷子夾取雄蕊,彈花粉至載玻片上,在顯微鏡下觀察花粉粒形態(tài)。隨機(jī)選取100個花粉粒,測量極軸和赤道軸,計(jì)算平均值與兩者比值(P/E)。在體視顯微鏡下觀察柱頭形態(tài)并拍照。

表1 麗萼熊巴掌種群開花進(jìn)程Table 1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella population

1.2.7花粉活力與柱頭可授性

晴天隨機(jī)采集松蕾期(柱頭剛冒出,花瓣還未伸展開)、盛花期(柱頭完全冒出,花瓣完全展開)、末花期(柱頭完全冒出,花瓣合攏)以及謝花期(花瓣及雄蕊脫落,僅余柱頭)的花朵,帶回實(shí)驗(yàn)室。盛花期和末花期的花粉活性測定用I2-KI法、MTT染色法和TTC法[9],5次重復(fù)。用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性。將不同花期的花朵柱頭切下,浸入聯(lián)苯胺反應(yīng)液(V1%聯(lián)苯胺∶V3%過氧化氫∶V蒸餾水=4∶11∶22),若柱頭處有大量氣泡出現(xiàn),則證明柱頭具可授性,5次重復(fù)。

1.2.8套袋實(shí)驗(yàn)

參照林秋金等[5]的方法進(jìn)行以下6種處理:

1) 對照,不做任何處理,檢測自然條件下的傳粉情況;

2) 不去雄、不授粉,在柱頭伸出前進(jìn)行套袋(硫酸紙,下同),檢測是否存在主動自交;

3) 不去雄,人工自花授粉后套袋,檢測是否自交親和;

4) 去雄,不同植株異花授粉后套袋,檢測雜交是否親和;

5) 去雄,套40目尼龍網(wǎng)紗袋,檢測其結(jié)實(shí)率是否受傳粉者限制;

6) 去雄,套袋,檢測是否存在無融合生殖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 花部形態(tài)與開花習(xí)性

通過花期物候觀察,麗萼熊巴掌的花期為4月中旬至5月中旬。3月下旬花芽開始萌動,4月中旬開花,4月下旬到達(dá)盛花期,5月中旬為末花期(表1)。在實(shí)際觀察過程中,發(fā)現(xiàn)麗萼熊巴掌的開花進(jìn)程受光照影響較大,向陽區(qū)域的植株花期普遍較背陰區(qū)域植株花期提早2～4 d。

麗萼熊巴掌傘形花序頂生,花冠紫色,廣卵形,具緣毛。單花直徑(2.182±0.161)cm,雌蕊長(1.369±0.091)cm,花瓣數(shù)多為四、稀三瓣或五瓣;雄蕊數(shù)與花瓣數(shù)對應(yīng),多為八、稀六或十;花絲白色,長(0.709±0.079)cm;花藥紫紅色,長(0.807±0.059)cm,柱頭淡粉色或淡紫色;花萼紫紅色或透明,萼筒長(0.685±0.059)cm;花梗紫紅色,長(1.009±0.145)cm。葉片紙質(zhì)或近膜質(zhì),基部心形。葉片廣卵形或近橢圓形,具疏緣毛。葉背常紫紅色,葉柄具槽,槽兩側(cè)被微柔毛。單株具(5±2)個花序,單花序(25±9)朵花。單花序花期持續(xù)(18.6±3.1)d,單花花期1～2 d。

根據(jù)麗萼熊巴掌花的發(fā)育進(jìn)程,將花期分為以下5個時期:

1) 花蕾期(圖1 A):花被苞片覆蓋,花被片突破苞片顯露紫紅色,萼片綠色,尖端呈紫紅色,花萼白色或紫紅色,該時期持續(xù)17～25 d;

2) 松蕾期(圖1 B、C):柱頭已經(jīng)從即將開放的花朵中伸出,分泌少許粘液,花瓣折疊,按逆時針方向排列,花內(nèi)雄蕊彎折,這一時期持續(xù)2～3 d;

3) 盛花期(圖1 D、E):花朵完全盛放,花瓣紫色,雄蕊呈環(huán)形空間排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不變,花藥開裂,盛開時間1～2 d;

4) 末花期(圖1 F、G):花瓣開始閉合,雌蕊位置不變,雄蕊往中間聚合,雄蕊頂部花藥呈褐色,這一時期持續(xù)1～2 d;

5) 謝花期(圖1 H):花瓣開始萎蔫,隨后花瓣和雄蕊開始依次凋落,僅雌蕊宿存,雌蕊柱頭由淡粉色變?yōu)楹稚?宿存1～3 d后也開始凋落。

注:A為花蕾期;B,C為松蕾期;D,E為盛花期;F,G為末花期;H為謝花期。箭頭指示為柱頭。圖1 麗萼熊巴掌花的開放進(jìn)程Fig.1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella

通過花蜜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),麗萼熊巴掌的花不分泌花蜜。

2.2 雜交指數(shù)

麗萼熊巴掌花直徑(2.182±0.161)cm,花兩性,雌蕊比雄蕊先熟,柱頭與花藥空間分離。根據(jù)Dafnia[10]提出的標(biāo)準(zhǔn),麗萼熊巴掌雜交指數(shù)值為4(表2),該物種的繁育系統(tǒng)為異交,部分自交親和且需要傳粉者。

表2 麗萼熊巴掌雜交指數(shù)測定Table 2 Determination for out-crossing index of P. longiradiosa var. pulchella

2.3 花粉胚珠比

麗萼熊巴掌花具雄蕊8個,單花藥平均含花粉(177 778±11 111)粒,單花平均花粉粒數(shù)(1 422 222±88 889)粒,單花胚珠數(shù)平均為(294±45)個,花粉胚珠比值為4 977±895,依據(jù)Cruden[11]提出的標(biāo)準(zhǔn),麗萼熊巴掌的繁育系統(tǒng)屬于專性異交(表3)。

表3 麗萼熊巴掌花粉胚珠比Table 3 Pollen-ovule ratios of P. longiradiosa var. pulchella

2.4 花粉與柱頭的生物學(xué)特性

2.4.1柱頭形態(tài)結(jié)構(gòu)與柱頭可授性

麗萼熊巴掌花柱長(1.36±0.09)cm,柱頭頂端呈圓形,淡粉色至淡紫色,直徑約0.3 mm,柱頭花粉接受面密布透明狀乳突,表面分泌粘液(圖2),這樣的結(jié)構(gòu)能使它更容易接受花粉。松蕾期柱頭乳突不明顯,而盛花期、末花期和謝花期柱頭均能看到較為明顯乳突,末花期和謝花期柱頭有明顯褐色且謝花期柱頭褐色較深(圖2 C、D),將4個時期的柱頭浸泡至聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液中,柱頭周圍均有氣泡產(chǎn)生(圖3)。其中,松蕾期柱頭產(chǎn)生的氣泡較少,其余3個時期均產(chǎn)生大量氣泡,說明4個時期的柱頭都具有授粉活性,松蕾期柱頭授粉活性最低,盛花期授粉活性最高。

注:A為松蕾期;B為盛花期;C為末花期;D為謝花期。下同。圖2 麗萼熊巴掌4個時期柱頭形態(tài)對比Fig.2 Comparison for stigma morphology of P. longiradiosa var. pulchella in four periods

2.4.2花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)與花粉活力

麗萼熊巴掌花粉呈橢圓形或卵圓形,花粉粒大小(16.99±1.46)μm×(17.95±1.27)μm,P/E比值為1.06±0.06。通過3種染色法(I2-KI、MTT、TTC)檢測盛花期、末花期的花粉活性,發(fā)現(xiàn)花粉對MTT染色法反應(yīng)明顯,有活力的花粉明顯變?yōu)樗{(lán)紫色。其余2種染色法反應(yīng)不明顯,應(yīng)用I2-KI染色法所有花粉均被染為黃褐色,無法判斷花粉活性。使用TTC染色法的花粉幾乎不上色,難以分辨花粉活力。綜上,最終選擇MTT染色法測定麗萼熊巴掌的花粉活力。

圖3 麗萼熊巴掌的柱頭可授性Fig.3 Stigma receptivity of P. longiradiosa var. pulchella

各時期取5個樣本,統(tǒng)計(jì)其花粉活力。由圖4可知,盛花期花粉活力均高于95%,平均為(95.97±0.56)%,末花期平均花粉活力(60.85±3.51)%,花粉活性最低為58%。盛花期大多數(shù)花粉被染成深紫色,

圖4 盛花期與末花期花粉活力對比Fig.4 Comparison of pollen activity between flowering and terminal stage

少數(shù)為淡紫色,極少部分不染色(圖5 A),末花期花粉大部分被染成淡紫色或不染色,少部分為深紫色(圖5 B),說明末花期花粉仍具有活力,只是相較于盛花期花粉活性較低。

2.5 套袋實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知,麗萼熊巴掌人工異花授粉的坐果率為30%,高于人工自花授粉的坐果率(8%),說明該物種具有較強(qiáng)的異花傳粉傾向,同時證明其繁育系統(tǒng)主要為異交型,存在部分自交親和。直接套袋處理不結(jié)實(shí),說明麗萼熊巴掌的自然自交需要傳粉者,不存在主動自交現(xiàn)象。去雄直接套袋的坐果率為0,表明麗萼熊巴掌不存在無融合生殖。在自然授粉條件下,麗萼熊巴掌坐果率為12%,低于人工異花授粉坐果率,說明麗萼熊巴掌傳粉活動受傳粉者限制;去雄直接套網(wǎng)紗袋坐果率僅2%,表明其存在風(fēng)媒傳粉現(xiàn)象,但主要自然傳粉方式還是通過昆蟲訪花。

表4 麗萼熊巴掌套袋實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The test result of emasculation of P. longiradiosa var. pulchella

3 討 論

3.1 麗萼熊巴掌的開花動態(tài)及花部形態(tài)

花作為被子植物的繁殖器官,為保證其物種的繁殖與延續(xù),會根據(jù)環(huán)境變化形成多樣的花部活動[12]。麗萼熊巴掌柱頭成熟與花藥開裂時間存在差異,柱頭成熟在前,花藥開裂在后,這樣的選擇既能有效避免自

花傳粉,又能提高其傳粉的準(zhǔn)確性,延長異花授粉時間。麗萼熊巴掌松蕾期(圖1 B、C)柱頭從花朵中伸出,分泌少許粘液,花瓣折疊,按逆時針方向排列,花內(nèi)雄蕊彎折,2～3 d后達(dá)到盛花期(圖1 D、E),此時花瓣完全展開,雄蕊呈環(huán)形空間排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不變,花藥開裂,持續(xù)1～2 d后到達(dá)末花期(圖1 F、G),此時花瓣開始閉合,雌蕊位置不變,雄蕊往中間聚合,這一時期持續(xù)1～2 d,這表明其花部器官在空間上呈現(xiàn)動態(tài)式雌雄異位[13-14],兩者結(jié)合為異花授粉提供了可能。柱頭主要分為可產(chǎn)生溢出物黏著花粉的濕型柱頭和不產(chǎn)生溢出物的干型柱頭[15-16]。通過觀察可知麗萼熊巴掌為濕型柱頭,柱頭表面有許多帶粘液乳突,可有效黏著花粉,并且麗萼熊巴掌直至開花末期,柱頭仍具有可授性,而同科植物枝毛野牡丹、毛菍的柱頭在花后才具有活性[6-7],多樣的傳粉機(jī)制和較長的傳粉時間可為麗萼熊巴掌繁殖提供多種保障措施。

值得注意的是檢測麗萼熊巴掌花粉活力時,使用I2-KI法所有花粉均被染為黃褐色,使用TTC法花粉幾乎不上色,均不能判斷花粉活性。I2-KI法無法測定麗萼熊巴掌的花粉生活力,說明其花粉中淀粉含量較低或不含淀粉。同科植物毛菍使用TTC法可將具有活性的花粉染為紅色[6],表明同科植物的不同種之間花粉活力測定方式存在差異。使用MTT法測定麗萼熊巴掌花粉活性,有活性的花粉均被染成藍(lán)紫色,根據(jù)其上色的深淺能夠清晰地分辨花粉的活力強(qiáng)弱(圖5)。因此,建議采用MTT染色法測定麗萼熊巴掌花粉活力。

3.2 麗萼熊巴掌的繁育系統(tǒng)

綜合雜交指數(shù)、套袋實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),麗萼熊巴掌的繁育系統(tǒng)屬異交,部分自交親和且需要傳粉者,這一研究結(jié)果還存在于同科植物細(xì)葉野牡丹、白花野牡丹、毛菍、枝毛野牡丹中。而花粉胚珠比值顯示麗萼熊巴掌的繁育系統(tǒng)屬于專性異交,這種根據(jù)花粉胚珠比值得出的繁育系統(tǒng)與實(shí)際不符并不是個例,如喜樹(Camptothecaacuminata)[17]、大花黃牡丹(Paeonialudlowii)[18]等也有類似的現(xiàn)象,故植物繁育系統(tǒng)的確定還需綜合雜交指數(shù)與套袋實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮。

自然界中,并非所有花都可授粉、坐果并產(chǎn)生種子,授粉成功性的大小可直接影響坐果率的高低,植物坐果率受花粉和資源限制[19]。套袋實(shí)驗(yàn)中,麗萼熊巴掌的人工異花授粉坐果率高于人工自花授粉,自然授粉坐果率略高于人工自花授粉坐果率,說明其自花授粉親和性較低;人工異花授粉坐果率高于自然授粉坐果率,說明其存在花粉限制,這可能與昆蟲傳粉頻率低有關(guān)。同時,研究中發(fā)現(xiàn),盛花期開花植株坐果率高于始花期和末花期,說明麗萼熊巴掌還存在著資源限制,始花期和末花期的花序無法獲得足夠的資源而落花落果嚴(yán)重,從而較難達(dá)到生殖成功。查閱相關(guān)標(biāo)本及實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn),原生生境麗萼熊巴掌坐果率高于引種地,結(jié)合試驗(yàn)地氣候推測,麗萼熊巴掌花期引種地桂林正處于雨季,連續(xù)性降雨影響昆蟲訪花,同時影響花粉的生命力,導(dǎo)致柱頭部分粘液流失,后續(xù)研究將通過調(diào)節(jié)降雨變量,探究是否受這一因素影響。其引種結(jié)實(shí)率低下的原因除了非生物因素(陰雨天氣)外,是否還存在群落環(huán)境(傳粉者)制約,即其野外生境是否存在該種專性傳粉昆蟲,還有待進(jìn)一步研究。

3.3 麗萼熊巴掌觀花應(yīng)用前景

麗萼熊巴掌開花進(jìn)程觀察顯示,麗萼熊巴掌在花蕾期具有較高的觀賞性,花蕾呈玫瑰紅色,或白色頂部點(diǎn)綴一些突出的紫紅色花瓣(圖1 A),可持續(xù)約1個月,加上花期,整個觀賞期可達(dá)2個月。麗萼熊巴掌花期4—5月,而同科其他已開發(fā)的園林花卉植物如野牡丹、細(xì)葉野牡丹,地菍的花期多為6—8月[20]。野牡丹科植物花部觀賞價值很高,很適合用于建立專類觀賞植物區(qū),麗萼熊巴掌花期與已開發(fā)的同科植物花期不同,正好可延長整個野牡丹科觀賞植物的觀花期。麗萼熊巴掌高30～100 cm,花朵十分美麗,喜陰,但需要一定的光照,水邊、闊葉林下長勢及花數(shù)明顯優(yōu)于蔭蔽林下,自然條件下,背陰區(qū)域的麗萼熊巴掌開花較晚。在實(shí)際園林應(yīng)用中可將其種植于湖邊或溪邊巖石旁與水景相映成趣,亦可將其配植于林下,喬、灌、草搭配種植。我國本土種的花境植物應(yīng)用較少,開發(fā)麗萼熊巴掌花卉資源,對其開花物候及繁育系統(tǒng)進(jìn)行研究,并將其應(yīng)用于城市環(huán)境美化及盆栽欣賞,對于廣西乃至我國建立特色觀賞花卉植物資源具有重要意義。