不同粒徑聚苯乙烯微球對長額象鼻溞的毒性效應

于國欣，邵旭東，曾平平，張清靖，曲疆奇，劉青*

(1.大連海洋大學 遼寧省水生生物重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.北京市農(nóng)林科學院水產(chǎn)科學研究所 漁業(yè)生物技術北京市重點實驗室，北京 100068)

塑料制品在人類生活中的應用越來越廣泛，并發(fā)揮著不可替代的作用。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球塑料制品總量超過3.95 億t。生活中被遺棄的塑料制品，經(jīng)過物理、化學和生物降解作用，會進一步分解形成粒徑小于5 mm的塑料碎片，即微塑料[1]，并進入水環(huán)境[2]。微塑料垃圾遍及全球水域，在太平洋、大西洋及印度洋均已被檢測到。其中，南太平洋微塑料的豐度達到2.7×104個/km2[3]。北美五大湖流域，漂浮在水面的微塑料平均豐度高達4.3×104個/km2[4]。中國近海岸、海灘及各淡水流域亦有許多微塑料分布的報道[5-6]。其中，廣東沿海沉積物中微塑料的豐度高達6 838 個/m3[7]，長江三峽水庫水體表層的微塑料豐度為12.611～1 597 個/m3[8]，武漢北湖水體中的微塑料豐度達到(8 925±1 591)個/m3[9]，位于青藏高原東部農(nóng)業(yè)區(qū)的湟水河中，微塑料的豐度高達 665～8 780 個/m3[10]。

微塑料具有粒徑小、比表面積大、疏水性強和難降解等物理化學特性[11]，水體大量賦存會對生物產(chǎn)生毒性效應，包括改變攝食和繁殖量，降低存活率和誘導氧化應激反應，甚至導致生物死亡[12-13]。Chae等[14]研究表明，微塑料富集在浮游動物大型溞(Daphniamagna)的腸道內(nèi)，可從大型溞轉移到較高營養(yǎng)級的中華青鳉(Oryziassinensis)魚體中，即微塑料不僅對生物產(chǎn)生毒性效應，還可以沿著食物鏈傳遞，對更高營養(yǎng)級的生物產(chǎn)生影響。此外，微塑料的成分、形狀、尺寸和表面特征等性質(zhì)的差異，均會對水生生物造成不同程度的毒性效應。據(jù)Eltemsah等[15]報道，在粒徑為6 μm 的聚苯乙烯微球下暴露48 h，對大型溞無急性毒性，但暴露120 h后會引起大型溞死亡；Rehse等[16]研究了兩種粒徑范圍的聚乙烯微粒(PE)對大型溞的毒性效應，結果表明，1～10 μm PE對大型溞有毒性作用，90～100 μm PE對大型溞無明顯毒性作用；方海燕等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在聚氯乙烯微粒(PVC)暴露下，大型溞繁殖能力下降；Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在納米級微塑料暴露下，蚤狀溞(Daphniapulex)的繁殖能力減弱且繁殖模式發(fā)生改變。但De Felice等[19]研究卻發(fā)現(xiàn)，在微米級微塑料暴露下，大型溞體形變大，后代數(shù)量明顯增加。上述研究結果均表明，微塑料對水生生物的毒性效應還存在著較多不確定因素，故需要進一步研究。

長額象鼻溞(Bosminalongirostris)為節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)枝角目(Diplostraca)象鼻溞科(Bosminidae)象鼻溞屬(Bosmina)的浮游動物，其個體小，不及溞屬的大型溞、蚤狀溞的1/3[20]，廣泛分布于湖泊、水庫等水體中，營養(yǎng)豐富，為濾食性魚類的天然餌料，在中、富營養(yǎng)水體中密度較高[21]，但微塑料對其毒性的研究鮮見報道。本研究中，分析了不同粒徑聚苯乙烯微球對長額象鼻溞的生物毒性效應，以期為水域生態(tài)風險評價提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3種聚苯乙烯微球(PS)粒徑分別為0.5、5、20 μm，密度均為1.05 g/cm3，購自上海輝質(zhì)生物科技有限公司，置于4 ℃冰箱中避光保存。長額象鼻溞采自北京市密云水庫，分離后單種培養(yǎng)，每日投喂離心斜生柵藻(Tetradesmusobliquus)，每3 d換水1次，在光照培養(yǎng)箱暫養(yǎng)6個月以上。

1.2 方法

1.2.1 PS對長額象鼻溞的急性毒性試驗 試驗開始前，將長額象鼻溞置于(22±1)℃、光暗比12L∶12D的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將不同粒徑的PS配制成質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的儲備液，經(jīng)超聲波均勻處理30 min后，于4 ℃冰箱中避光保存。

根據(jù)預試驗結果，3種粒徑的PS對長額象鼻溞的急性毒性試驗濃度設置略有不同，0.5 μm與5 μm粒徑的PS質(zhì)量濃度均設置為0、5、10、15、20、25、30 mg/L，20 μm粒徑的PS質(zhì)量濃度設置為0、10、20、30、40、50 mg/L。

將配制的PS儲備液稀釋至試驗濃度，并用超聲波處理30 min后置于培養(yǎng)箱(22 ℃)中。在體式顯微鏡下挑選出溞齡小于24 h的長額象鼻溞，并將其饑餓處理24 h。在6孔細胞培養(yǎng)板的每孔中添加10 mL PS稀釋液，每孔放入10只長額象鼻溞，每個PS濃度設置3個細胞培養(yǎng)板，即3組平行。試驗持續(xù)72 h，每隔24 h觀察長額象鼻溞的死亡情況，長額象鼻溞在15 s內(nèi)不發(fā)生活動即判定為死亡，試驗結束后，將所有試驗長額象鼻溞固定保存。

1.2.2 PS對長額象鼻溞的慢性毒性試驗 根據(jù)急性毒性試驗48 h LC50的千分之一濃度設置慢性毒性試驗濃度[22]，在6孔細胞培養(yǎng)板的每孔中添加10 mL PS稀釋液，在體式顯微鏡下挑選出溞齡小于24 h的長額象鼻溞，置于對應濃度的6孔細胞培養(yǎng)板中(每孔1只)，每個PS濃度設置5個細胞培養(yǎng)板，即5組平行，每天更換稀釋液，攝食密度為0.6 mg C/(L·d)的離心斜生柵藻，觀察并記錄每板每孔中長額象鼻溞母體的存活及產(chǎn)幼情況，及時取出死亡長額象鼻溞母體和新產(chǎn)出的幼溞固定保存。待所有母體死亡后結束試驗，并用顯微鏡觀察測量所有長額象鼻溞母體、第一胎和第二胎幼溞的體長(BL)、體高(BH)、觸角長(AL)及殼刺長(SL)等形態(tài)參數(shù)。

1.2.3 內(nèi)稟增長率及種群增長參數(shù)的計算 采用Lotka提出經(jīng)Birch和林昌善簡化的公式[23]計算內(nèi)稟增長率。內(nèi)稟增長率(rm)、凈生殖率(R0)、世代周期(T)和周限增長率(λ)計算公式為

T=lnR0/rm，λ=erm。

其中：x為日齡(d)；lx為x日齡時的存活率(%)；mx為x日齡時的出生率(%)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同粒徑PS處理下長額象鼻溞的急性致死效應

從表1可見：粒徑為0.5 μm的PS對長額象鼻溞的24 h急性致死率較低，最高為24.45%，各PS濃度組間無顯著性差異(P>0.05)，但PS組與對照組間有顯著性差異(P<0.05)；48 h時致死率隨PS濃度的增加而增大，高質(zhì)量濃度組(25、30 mg/L)與低質(zhì)量濃度組(5～20 mg/L)間有顯著性差異(P<0.05)；當試驗進行至72 h時，除對照組外，其余各組的死亡率均超過70%，最高達到85.56%。

表1 0.5 μm PS對長額象鼻溞的急性致死率Tab.1 Acute mortality of 0.5 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

從表2可見：粒徑為5 μm 的PS對長額象鼻溞的24 h時急性致死率最高為24.44%，各PS濃度組間無顯著性差異(P>0.05)；48 h時致死率隨PS濃度的增加而增大，高質(zhì)量濃度組(25、30 mg/L)與低質(zhì)量濃度組(5～20 mg/L)間有顯著性差異(P<0.05)；當試驗進行至72 h時，各PS濃度組均表現(xiàn)出較高的致死率，最高達90.00%。

表2 5 μm PS對長額象鼻溞的急性致死率Tab.2 Acute mortality of 5 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

從表3可見：粒徑為20 μm 的PS對長額象鼻溞的24 h時急性致死率隨PS質(zhì)量濃度的升高而上升，30 mg/L以上高質(zhì)量濃度組與10 mg/L質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P>0.05)；48、72 h時的急性致死率較粒徑為5 μm 時有所降低，最高分別為48.89%和85.56%。

表3 20 μm PS對長額象鼻溞的急性致死率Tab.3 Acute mortality of 20 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

圖1為3種粒徑的PS對長額象鼻溞48 h急性致死率的回歸曲線，3種不同粒徑的PS濃度與長額象鼻溞的急性致死率間存在線性關系，且不同粒徑PS對應的曲線斜率不同，其中，5 μm PS對應曲線斜率最大，20 μm PS對應曲線斜率最小。由回歸方程計算出粒徑為0.5、5、20 μm 的PS 48 h LC50分別為21.65、19.26、47.61 mg/L。

圖1 3種粒徑PS對長額象鼻溞的48 h急性致死效應Fig.1 48 h acute lethal effect of polystyrene microplastics with three particle sizes on Bosmina longirostris

2.2 不同粒徑PS處理下長額象鼻溞形態(tài)的變化

在PS質(zhì)量濃度為21.65(粒徑為0.5 μm)、19.26(粒徑為5 μm)、47.61 μg/L(粒徑為20 μm)下進行長額象鼻溞形態(tài)及種群變化試驗。各粒徑PS組長額象鼻溞母體體形較對照組變大，其體長和體高均顯著大于對照組(P<0.05)，體長最大值出現(xiàn)在20 μm PS組，為348.76 μm，體高最大值出現(xiàn)在0.5 μm PS組，為308.38 μm；各粒徑PS組母體的觸角長度較對照組顯著縮短(P<0.05)；殼刺長度亦呈縮短趨勢，5 μm PS組與對照組間有顯著性差異(P<0.05)(圖2(a))。

標有不同字母者表示同一指標下不同組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters in the same index are significant differences in different groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.圖2 不同粒徑PS對長額象鼻溞母體及子代形態(tài)的影響Fig.2 Effects of polystyrene microspheres with different particle sizes on the morphology of parent and offspring of Bosmina longirostris

各粒徑PS組第一胎幼溞的體長、體高均顯著小于對照組(P<0.05)；5 μm PS組觸角長度較對照組顯著增大(P<0.05)；各粒徑PS組殼刺長度均顯著長于對照組(P<0.05)(圖2(b))。

各粒徑PS組第二胎幼溞的體長與對照組無顯著性差異(P>0.05)；體高也趨于恢復，除5 μm PS組與對照組間有顯著性差異(P<0.05)外，其他組均與對照組無顯著性差異(P>0.05)；觸角長與殼刺長變化基本一致，均為0.5、5 μm PS組較對照組顯著增大(P<0.05)(圖2(c))。

2.3 不同粒徑PS處理下長額象鼻溞繁殖和種群的變化

從表4 可見：各粒徑PS組長額象鼻溞的存活時間、一生生殖次數(shù)與總生殖量均顯著大于對照組(P<0.05)；對照組長額象鼻溞的產(chǎn)前發(fā)育時間約為6 d，顯著長于PS組(P<0.05)；0.5、5 μm PS組的每胎生殖量顯著大于對照組(P<0.05)。

表4 不同粒徑PS處理下長額象鼻溞的生活史參數(shù)Tab.4 Life cycle parameters of Bosmina longirostris treated with polystyrene microplastics with different particle sizes

從表5可見，3個PS組長額象鼻溞的內(nèi)稟增長率、凈生殖率和周限增長率均顯著高于對照組(P<0.05)，而世代周期則顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 不同粒徑PS處理下長額象鼻溞的內(nèi)稟增長率及種群增長參數(shù)Tab.5 Intrinsic growth rate and population growth parameters of Bosmina longirostris under polystyrene microplastics treatment with different particle sizes

3 討論

3.1 聚苯乙烯對長額象鼻溞急性致死的影響

水環(huán)境中賦存的微塑料對藻類的光合作用、生長，以及水生動物的攝食、繁殖和生存均造成了較大的影響。目前，有關微塑料對浮游動物的研究主要集中在溞屬(大型溞、蚤狀溞)和網(wǎng)紋溞屬(Ceriodaphnia)，且隨微塑料成分、粒徑和暴露時間不同，結果不同。Eltemsah等[15]報道，在質(zhì)量濃度為0～300 mg/L的PS下暴露48 h，對大型溞無急性毒性，但暴露120 h后可引起大型溞死亡；李勤等[24]研究了聚氯乙烯對大型溞的急性毒性，發(fā)現(xiàn)大型溞在24～48 h時死亡率較低，72～96 h時毒性上升，大型溞的心率隨聚氯乙烯濃度的升高而降低，當質(zhì)量濃度達到400 mg/L時，96 h時幼溞全部死亡。本研究表明，PS對長額象鼻溞的急性毒性均隨PS濃度和暴露時間的延長而增大，與上述研究結果類似。

在本研究中，長額象鼻溞在0.5、5、20 μm 3種粒徑下的48 h LC50分別為21.65、19.26、47.61 mg/L，表明3種粒徑的PS毒性由大至小依次為5 μm>0.5 μm>20 μm，說明PS的粒徑對長額象鼻溞的存活率均有顯著影響。枝角類為濾食性生物，其濾食的食物大小隨個體大小有一定差異。鞏寧等[25]研究表明，大型溞可以攝入粒徑為2、20、50 μm的PE，且對大型溞的毒性效應隨粒徑的增大而增大；Rehse等[16]也發(fā)現(xiàn)，大型溞可攝入粒徑為1～10 μm的PE，但無法攝入粒徑為90～100 μm的PE，這與大型溞可以攝食的藻類粒徑范圍為0.7～70 μm有關[26]。

長額象鼻溞個體小，體長通常為400～600 μm，為溞屬大型溞、蚤狀溞體長的1/3～1/4[20]，對于大粒徑的食物難以攝取，在顯微鏡下也觀察到，粒徑為0.5、5 μm的PS在長額象鼻溞腸道內(nèi)出現(xiàn)，說明長額象鼻溞可以攝入0.5、5 μm的PS，而20 μm大粒徑的PS大多出現(xiàn)在其附肢、體表周圍，難以被攝取，因而粒徑為20 μm的PS對長額象鼻溞的急性毒性最弱。此外，微塑料的毒性與其在水蚤體內(nèi)的含量及滯留時間有關。涂燁楠等[27]研究發(fā)現(xiàn)，大型溞對0.1、1.0、9.9 μm 3種不同粒徑PS的平均排泄速率分別為8.2、7.8、3.4 個/min，即在可攝入范圍內(nèi)，排泄速率與微塑料粒徑成反比，粒徑越大排泄速率越低，積累量越大，因而其毒性越強。本研究中，長額象鼻溞可以攝入0.5、5 μm兩種粒徑的PS，相比0.5 μm粒徑的PS，5 μm粒徑的PS更加難以排泄，造成腸道的積累，故出現(xiàn)5 μm比0.5 μm PS毒性強的現(xiàn)象。

3.2 聚苯乙烯對長額象鼻溞形態(tài)的影響

微塑料會影響大型溞母體與子代的形態(tài)，但不同種類的微塑料影響卻不同。李勤等[24]研究發(fā)現(xiàn)，暴露在PVC的大型溞，母體和子代的體長會變短；Besseling等[28]研究發(fā)現(xiàn)，納米級微塑料(粒徑為70 nm)對大型溞體長會產(chǎn)生負面影響，與對照組相比體長縮小了3.1%。而De Felice等[19]卻得到了不同的研究結果，在低濃度的微塑料下暴露21 d后，大型溞的體長顯著增加，比對照組增大了5%。該作者認為，體形增大的原因可能是在脅迫的環(huán)境條件下，大型溞能感知微塑料顆粒的存在，這些顆粒會阻塞消化道或抑制運動行為。為了清理腸腔、體腔和附著在身體表面及附肢上的微塑料顆粒，大型溞會增加自身運動行為，尋找利于生存的水環(huán)境，從而提高了對食物的攝取和吸收效率，故出現(xiàn)大型溞體形變大的現(xiàn)象。本研究結果與De Felice等[19]的研究結果類似，在低質(zhì)量濃度(19.26～47.61 mg/L)的PS暴露下，PS組長額象鼻溞母體的體長和體高均顯著大于對照組，這也可能是長額象鼻溞為保護種群生存的一種策略；但第一胎幼溞的體形卻縮小，隨著時間的延長，第二胎幼溞體形有恢復的趨勢，這表明隨著時間的延長，母體對水環(huán)境中的微塑料逐漸適應，從而減弱了PS對其的毒性作用，使得產(chǎn)出的后代逐漸恢復到正常水平，這也間接表明，水中低濃度的微塑料對長額象鼻溞的毒性持續(xù)時間較弱。

3.3 聚苯乙烯對長額象鼻溞繁殖和種群增長的影響

目前，關于微塑料對浮游動物繁殖的影響存在爭議，不同研究者有不同的研究結果。有研究認為，微塑料可降低浮游動物的繁殖能力，如Besseling等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在納米級微塑料(粒徑為70 nm)暴露下，大型溞的子代數(shù)量會降低；Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)，在粒徑為75 nm的微塑料暴露下，蚤狀溞的繁殖能力降低且繁殖模式也發(fā)生改變；Iguchi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在苯乙烯二聚體和三聚體暴露下，網(wǎng)紋溞的繁殖率降低。也有研究認為，微塑料可增加浮游動物的繁殖能力，如De Felice等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在微米級微塑料暴露下，大型溞的繁殖率會增加；Rist等[22]發(fā)現(xiàn)，在粒徑為100 nm的微塑料暴露下，大型溞子代數(shù)量略有增加。還有研究認為，微塑料對浮游動物的繁殖能力無影響，如Canniff等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在粒徑為63～75 μm的微塑料暴露下，大型溞的生殖不產(chǎn)生顯著變化。本研究表明，聚苯乙烯微球可以縮短長額象鼻溞產(chǎn)前發(fā)育期和世代周期，增加長額象鼻溞的一生生殖次數(shù)和總生殖量，并提高該溞的內(nèi)稟增長率和凈生殖率，說明PS可增加長額象鼻溞產(chǎn)幼數(shù)量。

物種以通過改變后代數(shù)量來抵御環(huán)境的變化是生物普遍的規(guī)律。長額象鼻溞產(chǎn)前發(fā)育時間的縮短及一生生殖次數(shù)的增加，直接造成PS組的子代數(shù)量高于對照組，這可能是長額象鼻溞對環(huán)境的適應性調(diào)節(jié)和對種群的保護策略[31]，這表明PS的存在確實會對長額象鼻溞的繁殖和種群產(chǎn)生影響。

4 結論

1)不同粒徑的聚苯乙烯微球對長額象鼻溞的急性毒性均隨著時間的延長和濃度的增加而增大。

2)0.5、5、20 μm 3種粒徑聚苯乙烯微球對長額象鼻溞的48 h LC50分別為21.65、19.26、47.61 mg/L，表明粒徑為5 μm 的聚苯乙烯微球對長額象鼻溞的急性致死率最高。

3)在聚苯乙烯微球暴露下，長額象鼻溞母體體形變大，第一胎幼溞體形縮小，隨著繁殖代數(shù)的增加影響逐漸減弱，第二胎幼溞的體形有所恢復。

4)在聚苯乙烯微球暴露下，長額象鼻溞的壽命延長，產(chǎn)前發(fā)育期、世代周期縮短，凈生殖率和內(nèi)稟增長率提高，并產(chǎn)生更多的子代，這種影響與聚苯乙烯微球的粒徑相關，并隨粒徑的增大而減弱。