不同工藝制備金錢草茶對體外消解結(jié)石效果的影響

蔣永波 張華 閻睿 孟琦 邱遷 文方秀 肖雅芳

摘要 ［目的］分析不同金錢草茶制備工藝對體外消解結(jié)石的影響，同時探究金錢草茶中總多糖和總黃酮與體外消解結(jié)石的相關(guān)性。［方法］采用噴霧干燥法、高溫漂燙法、烘箱烘干法和日曬法4種工藝制備金錢草茶，結(jié)石消解試驗采用顯微鏡觀察法記錄一水草酸鈣消解情況，采用硫酸蒽酮法測定總多糖含量，硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量。［結(jié)果］顯微觀察結(jié)果顯示4種制備工藝的金錢草茶均具有明顯的一水草酸鈣消解效果，其中日曬法效果最佳。不同濃度總多糖和總黃酮提取液具有消解一水草酸鈣的效果，并且隨濃度增大對一水草酸鈣消解效果均增強，日曬法中總多糖和總黃酮含量顯著高于其他制備工藝。［結(jié)論］4種工藝消解試驗整體對比表明，日曬法制備工藝消解一水草酸鈣效果最優(yōu)，且總多糖和總黃酮是主要消解成分。

關(guān)鍵詞 金錢草；制備工藝；結(jié)石消解；總多糖；總黃酮

中圖分類號 R 285? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）07-0175-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.040

Effect of Lysimachia christinae Tea Prepared by Different Processes on Calculus Digestion in vitro

JIANG Yong-bo， ZHANG Hua，YAN Rui et al

（College of Biology and Food Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404120）

Abstract ［Objective］To analyze the effect of different preparation processes of Lysimachia christinae tea on the calculus dissolution in vitro， and to explore the correlation between total polysaccharides and total flavonoids in Lysimachia christinae tea and the calculus dissolution in vitro.［Method］The spray drying method， high temperature blanching method， oven drying method and sunlight method were used to prepare Lysimachia christinae tea. The calculus digestion test recorded the calcium oxalate monohydrate digestion by microscope observation method， the total polysaccharide content was determined by anthrone sulfate method， and the total flavones content was determined by aluminum nitrate color method.［Result］The microscopic observation results showed that the four preparation processes of Lysimachia japonica tea had obvious calcium oxalate monohydrate digestion effect， and the best effect was the sunlight method.Different concentrations of total polysaccharides and total flavonoids had the effect of digesting calcium oxalate monohydrate， and the effect of digesting calcium oxalate monohydrate increased with the increase of concentration. The content of total polysaccharides and total flavonoids in the solarization method was significantly higher than that in other preparation processes.［Conclusion］The overall comparison of the digestion tests of the four processes showed that the preparation process of sunlight method had the best digestion effect of calcium oxalate monohydrate， and the total polysaccharides and total flavonoids were the main digestion components.

Key words Lysimachia christinae;Preparation process;Calculus digestion;Total polysaccharide;Total flavonoids

基金項目 重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項（cstc2020jscx-kjfpX0011）；重慶市萬州區(qū)科技計劃項目（wzstc-2020041）。

作者簡介 蔣永波（1995—），男，重慶人，碩士研究生，研究方向：植物化學(xué)物質(zhì)鑒定及抗氧化活性。

通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物化學(xué)物質(zhì)鑒定及抗氧化活性研究。

收稿日期 2022-05-06；修回日期 2022-06-21

金錢草又稱大金錢草，為報春花科植物過路黃（Lysimachia christinae Hance）的干燥全草，別名過路黃、真金草、走游草、鋪地蓮，植株為多年生草本［1］，也是一種藥食同源植物［2］。通過人們的實踐經(jīng)驗和科學(xué)研究［3］均顯示金錢草有較好地清除體內(nèi)泌尿系統(tǒng)結(jié)石的效果。泌尿系統(tǒng)結(jié)石是一種人體常見的疾病，泌尿系統(tǒng)結(jié)石的主要成分為草酸鈣結(jié)晶，尿石中純草酸鈣晶體約占40%。草酸鈣晶體有3種不同的水合物形式，包括一水合草酸鈣、二水合草酸鈣和三水合草酸鈣。其中一水合草酸鈣熱力學(xué)最穩(wěn)定，是泌尿系統(tǒng)結(jié)石的主要成石成分［4］。研究顯示金錢草中主要含有黃酮類化合物、多糖類化合物、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、內(nèi)脂類等成分，其中黃酮類化合物具有消解結(jié)石的效果，消解結(jié)石的主要原理是黃酮類化合物中羰基及酚羥基可以與尿液中的鈣離子絡(luò)合，將一水合草酸鈣絡(luò)合成二水合草酸鈣再絡(luò)合成三水合草酸鈣，排出體外，降低鈣離子的濃度，起直接性作用減少草酸鈣的過飽和度，從而抑制草酸鈣晶體的生長［5］。有研究表明由水提醇沉得到的多糖部分對一水草酸鈣結(jié)晶的生長抑制作用較好［6］，并且抑制作用會隨多糖濃度的增加而增強［7］，其中多糖類起間接抑制草酸鈣結(jié)石的作用，主要是通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而間接性抑制草酸鈣結(jié)石的形成［8］。目前金錢草提取液有不同的制備方式，但是關(guān)于不同制備方式對泌尿系統(tǒng)結(jié)石的影響研究較少?；隗w外模擬結(jié)石消解試驗具有省時、方便的優(yōu)點，且能直觀地展現(xiàn)出作用物質(zhì)對草酸鈣的消解效果，筆者主要研究不同金錢草茶制備工藝對體外模擬消解結(jié)石效果的影響，篩選出較好的制茶工藝；并且通過體外模型試驗直接探索金錢草茶中總多糖［9］、黃酮類化合物［10-11］與結(jié)石體外消解效果的關(guān)系，為金錢草茶進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。供試樣品來源于重慶市豐都縣，一般于夏季、秋季采收，全草干凈，無病斑、蟲斑，葉片完整，無斷葉、殘葉，采后試驗不宜超過36 h，也可于-80 ℃左右保存鮮草。

1.1.2

試劑。麥芽糊精、β-環(huán)狀糊精，鄭州安康食品化工有限公司；二氧化硅，柘城縣耕道貿(mào)易有限公司；木糖醇，山東福田藥業(yè)有限公司；一水草酸鈣，上海邁昆化工有限公司；無水乙醇、氯仿、硫酸、30%過氧化氫，重慶川東化工集團有限公司；亞硝酸鈉、正丁醇，成都市科龍化工試劑廠；蒽酮，中國試劑網(wǎng)；葡萄糖（批號20180701，供總多糖含量測定用），合肥博美生物科技有限公司；蘆丁（批號20180803，供總黃酮類化合物含量測定用），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；氫氧化鈉，斯百全化學(xué)有限公司；無水碳酸鈉，滄州凱林化工產(chǎn)品有限公司；硝酸鋁，萬州化工貿(mào)易有限公司。雙蒸餾水，實驗室自制。

1.1.3

儀器與設(shè)備。zxfd-5250十段編程鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；YC-015實驗型噴霧干燥機，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機，上海申鹿均質(zhì)機有限公司；美吉斯Elite500 Puls真空包裝封口機，溫州恒豪包裝機械有限公司；標準檢驗篩60目孔徑0.3 mm，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；FW80型高速試樣粉碎機，河北省黃市新興電器廠；FA1004型號電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH.S精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；OPTIKA 顯微鏡，上海伯建生物科技有限公司；HT-K219P粉末顆粒包裝機，武漢海泰機械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金錢草茶的制備工藝。

1.2.1.1 噴霧干燥法制備金錢草茶。工藝流程：前期處理→金錢草水提法提取液的制備→添加輔料→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→調(diào)配→包裝。金錢草采摘后置于陽光下暴曬2 h加工，上籠蒸2～3 min，然后曬干即可［12］。金錢草經(jīng)干燥粉碎后過50目篩，保存于自封袋中，置于干燥器中備用［13］。之后按羅蘭等［14］的方法稍加優(yōu)化，稱取金錢草全草干燥粉50 g（已過50目篩），第一次加入1 L水煮沸后小火慢煎60 min，趁熱過4層紗布，第二次加入800 mL蒸餾水同上慢煎40 min，趁熱過濾合并2次濾液，用2個燒杯平分濾液，100 ℃分別濃縮到500 mL（以干重質(zhì)量計即金錢草含量0.1 g/mL）。之后添加輔料20%麥芽糊精（100 g）、β-環(huán)狀糊精2 g。制備好的金錢草茶速溶攪拌好進行高壓均質(zhì)（參數(shù)設(shè)置為壓強30 MPa，t=10 min）及噴霧干燥得噴霧干燥原粉。之后按噴霧粉∶木糖醇=1∶0.5的比例調(diào)配。每份10 g進行包裝。

1.2.1.2

高溫漂燙法制備金錢草茶。工藝流程：高溫漂湯（脫苦脫澀）→冷浸護色（漂洗）→風(fēng)干脫水→殺青→烘干成型→包裝。1 L燒杯加水，待水沸騰后，將鮮葉500 g（已截段2～3 cm）適量（25～35 g）投入燒杯中，煮沸1 min，迅速過涼水進行冷卻護色及除雜。將護色處理后的金錢草取出來，散開擺置在有孔隙的篩子上風(fēng)干全草表面水分，之后進行殺青［15］。將抖散后的葉片投入烘箱（溫控80～90 ℃），除去60%～70%的水分，略濕不沾手。然后溫控在 120～130 ℃，除去剩余15%的水分，松開手即散為宜，每袋50 g，用包裝袋抽真空熱塑封包裝得到本品。

1.2.1.3

烘箱烘干法制備金錢草茶。工藝流程：前期處理→初次烘干→再次烘干→包裝保存。新鮮金錢草清水洗凈，瀝干水分，切成2 cm左右短竿條。置于熱風(fēng)循環(huán)干燥箱中［16］，溫控50 ℃將水分烘干至50%。之后再調(diào)溫至60 ℃充分烘干，每0.5 h觀察一次保證徹底烘干。每袋50 g，用包裝袋抽真空熱塑封包裝得到本品。

1.2.1.4

日曬法制備金錢草茶。工藝流程：前期處理→陽光晾曬→包裝保存。新鮮金錢草清水洗凈后，薄攤晾曬，在10：00以前攤開，中午強光時放置陰涼處，下午光線不強時再晾曬，晾曬需多次翻動，直至徹底曬干為止。每袋50 g，用包裝袋抽真空熱塑封封口包裝得到本品。

1.2.2

金錢草茶水提液的制備及模擬體外模型一水草酸鈣消解觀察試驗。

1.2.2.1

金錢草水提液的制備。噴霧干燥法參照“1.2.1.1”方法，取一定量噴霧前濃縮液作為消解液，其余3種工藝同樣取適量干茶葉，水提濃縮制成最終分別含生藥0.05和0.10 g/mL梯度的水提液。

1.2.2.2

載玻片親水性處理。第一步進行食人魚溶液的配制，將（濃）H2SO4∶H2O4按3∶7比例充分混勻［17］，濃硫酸用玻璃棒引流緩慢倒入且勻速攪拌；第二步載玻片表面清潔先用洗潔精清洗再用超純水沖洗至無泡；第三步載玻片表面羥基化處理是將需處理的載玻片輕放入食人魚溶液中75 ℃加熱1 h；第四步取出冷風(fēng)直接吹干［18］待用。

1.2.2.3

消解試驗。稱取0.365 g CaC2O4·H2O，定容至500 mL容量瓶，配制成5 mmol/L的一水草酸鈣濁液?？瞻捉M為50 mL一水草酸鈣濁液+50 mL雙蒸水；試驗組為50 mL一水草酸鈣濁液+50 mL金錢草水提液（分別含金錢草0.10和0.05 g/mL，以金錢草干粉計）。將空白組和試驗組均用保鮮膜密封于（37±1）℃恒溫室箱放置48 h，小心取出載玻片，自然風(fēng)干，整個過程需在無菌室內(nèi)進行操作，防止微生物污染，用OPTIKA高倍光學(xué)顯微鏡觀察晶體變化。

1.2.3

4種工藝制備金錢草茶總多糖提取液和總黃酮提取液對結(jié)石消解效果比較。

1.2.3.1

總多糖提取液制備。噴霧干燥法取“1.2.1.1”中100 mL濃縮液（含10 g金錢草），其余3種方法取10 g制品粉末，水提濃縮至100 mL，置燒杯中加入3～4倍無水乙醇4 ℃下沉淀12 h，5 000 r/min離心得沉淀并用Sevage法除蛋白［19］，蒸餾水定容到100 mL得總多糖提取液，即為含生藥0.1 g/mL的金錢草總多糖提取物，用于總多糖含量測定。

1.2.3.2

總黃酮提取液制備［20］。噴霧干燥法取“1.2.1.1”中100 mL濃縮液冷凍干燥，其余3種均取10 g制品粉末，加95%乙醇充分攪拌，靜置24 h，過濾離心收集上清液得含生藥0.1 g/mL總黃酮提取物，用于總黃酮含量測定。

1.2.3.3

總多糖含量梯度試驗設(shè)計。在通過日曬工藝獲得的樣品中，分別取0（空白）、5、10、15、20、25 g，按“1.2.3.1”中方法提取總多糖，定容到100 mL［20］，即得到含金錢草0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的總多糖提取物消解液，待總多糖含量測定和消解試驗備用。

1.2.3.4

總黃酮含量梯度試驗設(shè)計。分別取0（空白）、5、10、15、20、25 g金錢草全草干草粉末（已過20目篩），按“1.2.3.2”提取總黃酮，定容到100 mL得到含生藥0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的總黃酮消解液。取其中50 mL再次濃縮到20 mL測定總黃酮。

1.2.3.5

一水草酸鈣含量測定。消解試驗方法同“1.2.2.3”，區(qū)別是無須添加載玻片進行顯微觀察。通過滴定試驗測定一水草酸鈣含量，具體操作如下：酸液配制參照GB/T? 601—2016，取36%～37%的HCl（濃）9 mL，注入1 000 mL水搖勻，密閉儲存，使用前或者每14 d標定一次，用無水碳酸鈉進行標定，溴甲基綠-甲基紅作指示劑標定后HCl濃度為0.097 75 mol/L。一水草酸鈣測定用紫色石蕊作指示劑，滴5滴紫色石蕊入待滴定液中，邊滴定邊搖勻，待溶液顯紅色且0.5 min內(nèi)不褪色則為滴定終點。

1.2.4

總多糖測定。先稱取0.1 g葡萄糖標準品溶解定容到100 mL配制成1 mg/mL的葡萄糖溶液，分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標準溶液加雙蒸水補至10 mL，制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL葡萄糖溶液，通過測定繪制得葡萄糖標準曲線Y=6.288 7X+0.017 7（R2=0.999 0），表明葡萄糖濃度在0～0.14 mg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。噴霧干燥法取濃縮液20 mL（近似于草干粉2 g），補水到60 mL（近似于2 g料液比為1∶30的水量）置于燒杯中加入3～4倍無水乙醇，再經(jīng)過后續(xù)處理得總多糖溶液。其余3種各取2 g茶制品，通過提取進行總多糖含量的測定。在具塞試管加入5 mL蒽酮-硫酸溶液，取1 mL樣品或標準品，輕微搖勻，沸水水浴10 min，流水冷卻。在620 nm下測吸光度［20］，根據(jù)標準曲線計算總多糖，每個樣品測3次且每次3個平行，分別計算平均值和RSD。

1.2.5

總黃酮測定。稱量蘆丁對照品5.1 mg，加入60%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶，得蘆丁標準樣液，通過計算濃度為0.102 mg/mL。精確吸取蘆丁標品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mL于10 mL比色管中，加入60%乙醇1 mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，輕輕搖勻后放置10 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，再次搖勻后放置10 min；最后加入4%氫氧化鈉溶液2.0 mL，用60%乙醇定容至10 mL，搖勻靜置15 min，在510 nm下檢測繪制標準曲線［14］。得出蘆丁標準曲線為Y=0.85X-0.0029（R2=0.999 5），表明蘆丁標準液濃度在0.204～1.428 mg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。噴霧干燥法取50 mL濃縮液，參照“1.2.3.2”制備樣品，其余制品取5 g進行提取測定。該試驗總黃酮的測定原理是采用硝酸鋁比色法［21-22］，用蘆丁作為標準樣。根據(jù)蘆丁標準曲線方程計算金錢草總黃酮含量，每個樣品測3次且每次3個平行，分別計算平均值和RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種工藝制備金錢草茶體外消解結(jié)石效果對比

由10×40高倍顯微觀察圖（圖1）分析可知，4種工藝制備的金錢草茶與空白對照組（A0、B0、C0、D0）對比，均顯示一水草酸鈣有被消解的現(xiàn)象，并且消解現(xiàn)象隨著樣液濃度增高消解現(xiàn)象明顯。烘箱烘干法（C組）和日曬法（D組），當(dāng)濃度梯度達到0.10 g/mL時，一水草酸鈣晶體幾乎以很小的聚合分子形式存在，其次是高溫漂湯法（B組），最后是噴霧干燥法（A組）。相比4種制備工藝，烘箱烘干法和日曬法較其他2種制備工藝的消解效果較好。產(chǎn)生這樣的原因有可能是制備工藝對消解結(jié)石的活性成分含量或成分影響的現(xiàn)象。

注：A.噴霧干燥法；B.高溫漂燙法；C.烘箱烘干法；D.日曬法。A0、B0、C0、D0代表50 mL一水草酸鈣濁液+50 mL雙蒸餾水；A1、B1、C1、D1代表50 mL一水草酸鈣濁液+50 mL的0.05 g/mL樣液；A2、B2、C2、D2代表50 mL一水草酸鈣濁液+50 mL的0.10 g/mL樣液。顯微鏡觀察倍數(shù)10×40。

Note：A.Spray drying method；B.High temperature blanching method；C.Oven drying method；D.Sunlight method.A0，B0，C0 and D0 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL double distilled water；A1，B1，C1 and D1 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL 0.05 g/mL sample solution；A2，B2，C2 and D2 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL 0.10 g/mL sample solution.Microscopic magnification is 10 × 40.

2.2 4種工藝制備茶總多糖提取液和總黃酮提取液結(jié)石消解效果對比

由圖2可知，日曬法制備工藝所提取的總多糖提取液和總黃酮提取液均對一水草酸鈣清除效果最好，其次是噴霧干燥法和烘箱烘干法，而高溫漂湯法提取的總多糖提取液和總黃酮提取液對一水草酸鈣清除效果較差。這可能與制備過程中總多糖和總黃酮的損失有關(guān)。

2.3 不同濃度總多糖和總黃酮提取液與結(jié)石消解效果相關(guān)性

由圖3可知，隨著總多糖含量與總黃酮含量的增加，一水草酸鈣含量逐漸降低，總多糖和總黃酮均與一水草酸鈣含量呈現(xiàn)良好的負相關(guān)。很好地證明了總多糖和總黃酮可能是一水草酸鈣消解的主要作用成分。

2.4 4種工藝制備金錢草茶總多糖和總黃酮含量測定

由表1可知，4種工藝得到的金錢草茶制品中總多糖含量為0.71%～0.78%，總黃酮含量為3.05%～4.01%。其中日曬法制備的總多糖和總黃酮含量最高，其次是噴霧干燥法和烘箱烘干法，高溫漂燙法制備的總多糖和總黃酮含量最低，其分析可能是由于經(jīng)過一系列高溫漂燙和殺青等工藝，導(dǎo)致總多糖和總黃酮物質(zhì)穩(wěn)定性下降從而受到破壞。這與4種工藝方法其消解之后一水草酸鈣含量對比所得結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

該試驗主要通過對4種金錢草制備工藝進行體外模擬消解試驗，證明這種常用于治療結(jié)石的中草藥金錢草具有很強的消解結(jié)石的效果，且通過顯微鏡直觀地觀察到4種工藝制備金錢草茶水提物對結(jié)石的消解程度。另外，該研究分別提取金錢草中總多糖和總黃酮并進行體外消解結(jié)石相關(guān)性試驗驗證，結(jié)果顯示，總多糖和總黃酮對于體外模擬消解結(jié)石均具有極強的消解效果，并且隨著濃度的增加，消解效果增加，這與林瑤等［6，8］的研究結(jié)果一致。馮麗華等［23］研究得出金錢草總黃酮的超聲提取工藝的提取率在4.84%～6.33%，與該研究結(jié)果接近。通過該試驗探索得出4種制備工藝（噴霧干燥法、高溫漂燙法、烘箱烘干法、日曬法）中，日曬法制備工藝所制備的金錢草茶對體外消解結(jié)石效果最好，其中總多糖和總黃酮是其主要消解作用成分。

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