貯藏和液體培養(yǎng)條件對文冠果花粉萌發(fā)的影響

黃曉梅 李春雨 邢加浩 劉洪慧 張錦 李佳宸

摘要 ［目的］優(yōu)化改善文冠果花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基。［方法］以新鮮文冠果花粉為試驗(yàn)材料，采用液體培養(yǎng)法，測定蔗糖、硼酸和鈣對文冠果花粉離體萌發(fā)特性及花粉管長度的影響，篩選適合文冠果花粉離體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基成分的最佳濃度。測定不同貯藏溫度（-70、-20、4、25 ℃）及不同貯藏時(shí)間（2、5、10 d）下，文冠果花粉萌發(fā)率的變化。［結(jié)果］通過控制單一因素變量試驗(yàn)，文冠果花粉離體萌發(fā)的液體培養(yǎng)基最佳組分為15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%鈣離子（硝酸鈣），萌發(fā)率達(dá)92.5%，花粉管長達(dá)1.61 mm；而在花粉管生長過程中需要的鈣離子濃度為0.04%。-70 ℃超低溫貯藏花粉有利于保持花粉生活力，-20 ℃冷凍貯藏次之，4 ℃低溫貯藏不利于保持花粉生活力，25 ℃恒溫貯藏會(huì)大大降低花粉生活力。［結(jié)論］該研究可為文冠果花粉離體培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基最佳組分配方提供參考依據(jù)，也為文冠果花粉貯藏研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 文冠果；花粉萌發(fā)；貯藏；生活力

中圖分類號(hào) S 565.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）07-0131-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.031

Effects of Storage and Liquid Culture Conditions on Xanthoceras sorbifolium Pollen Germination

HUANG Xiao-mei， LI Chun-yu， XING Jia-hao et al

（Weifang University， Weifang， Shandong 261061）

Abstract ［Objective］In order to optimize and improve the culture medium of Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro. ［Method］The effects of sucrose， boric acid and calcium ion on the germination rate of Xanthoceras sorbifolium pollen and pollen tube length were measured by liquid culture method， which fresh pollen was used as experimental material. So as to screen out the best concentration of liquid medium components suitable for Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro. At the same time， the changes of pollen germination rate of Xanthoceras sorbifolium were measured under different storage temperatures （－70， －20， 4， 25 ℃） and different storage times （2， 5， 10 d）. ［Result］The results showed that through controlling the single factor variable test， the optimal medium group that promoted in vitro germination rate of pollen of Xanthoceras sorbifolium was 15% sucrose +0.02% boric acid +0.01% calcium ion （calcium nitrate）， the germination rate was 92.5%， and the pollen tube length was 1.61 mm. While the concentration of calcium ion needed in the process of pollen tube growth was 0.04%. The statistics indicates that -70 ℃ cryogenic storage of pollen was beneficial to keep the vitality of pollen， and 20 ℃ refrigerated storage times， 4 ℃ low temperature storage was not conducive to maintain vitality of pollen， 25 ℃ constant temperature storage will greatly reduce the vitality of pollen. ［Conclusion］This study can provide reference basis for the optimal formula of liquid medium for Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro， and lay a foundation for the study of Xanthoceras sorbifolium pollen storage.

Key words Xanthoceras sorbifolia;Pollen germination;Storage;Pollen vitality

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301733）；濰坊學(xué)院博士基金資助項(xiàng)目（2012BS19）；山東省高等學(xué)校科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（J18KA157）;濰坊學(xué)院大學(xué)生研究計(jì)劃項(xiàng)目（WFUSRTP-2020L24）。

作者簡介 黃曉梅（1997—），女，廣西藤縣人，從事植物花粉發(fā)育與萌發(fā)研究。

收稿日期 2022-06-03；修回日期 2023-01-04

文冠果（Xanthoceras sorbifolia）是我國北方常見落葉灌木，屬無患子科。其根系發(fā)達(dá)且分布面積廣，有利于水分吸收和貯藏，在多種極端土壤環(huán)境條件下都能夠生長，是防治風(fēng)沙、治理荒漠的首選優(yōu)良樹種；文冠果花期由于滿樹繁花、鮮艷美麗而具有很高的觀賞性；其果實(shí)集保健與藥用價(jià)值一身［1］。因此，目前對文冠果的研究較為熱點(diǎn)，對其花粉離體萌發(fā)的研究也有不少報(bào)道，但在花粉培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法方面存在較大差異。如劉武林等［2］采用懸滴法進(jìn)行文冠果花粉培養(yǎng)；有學(xué)者采用半固體培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基中均加入了瓊脂，如吳月亮等［3］加入5%～6%瓊脂，李強(qiáng)峰等［4］采用1%瓊脂。李強(qiáng)峰等［4］研究表明，培養(yǎng)基中最佳蔗糖濃度為0.2%，而劉武林等［2-3］所測得的結(jié)果為10%～15%，二者蔗糖溶液濃度相差較大。硼酸是文冠果花粉萌發(fā)最重要的元素之一，0.01%～0.02%硼酸可較好地促進(jìn)文冠果花粉萌發(fā)，但是過高濃度會(huì)導(dǎo)致花粉萌發(fā)數(shù)量下降。針對培養(yǎng)基中鈣離子的研究，吳月亮等［5］研究表明，鈣離子對文冠果花粉離體萌發(fā)促進(jìn)作用不大，培養(yǎng)基中可不加入鈣離子。在文冠果花粉貯藏溫度和貯藏時(shí)間試驗(yàn)中，吳月亮等［3，5］控制貯藏時(shí)間和貯藏溫度2個(gè)因素變量，測定了文冠果花粉最適貯藏溫度。

筆者采用與前人不同的液體培養(yǎng)基對文冠果花粉進(jìn)行培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基中蔗糖、硼酸、鈣離子（硝酸鈣）的最佳濃度，同時(shí)對文冠果花粉貯藏溫度和貯藏時(shí)間進(jìn)行探究，以期為研究文冠果雜交育種及花粉長期貯藏提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為濰坊市人民廣場種植的文冠果樹，于每天06：00采集當(dāng)天開放的花朵，取下花粉進(jìn)行不同處理。試驗(yàn)中采用的花粉均為當(dāng)天采集的同一批次花粉，貯藏花粉為第一批次采集的花粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉離體萌發(fā)預(yù)試驗(yàn)。

文冠果花粉離體培養(yǎng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，目的是觀察花粉離體培養(yǎng)過程是否需要光照。

將新鮮花粉接種到15%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%鈣離子液體培養(yǎng)基上，在光照和黑暗環(huán)境下25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)1、2、3、4、5 h分別取出觀察。

文冠果花粉離體培養(yǎng)在光照條件下花粉萌發(fā)率要高于黑暗條件下（圖1），同時(shí)文冠果花粉萌發(fā)在4 h時(shí)即可觀察。

1.2.2 花粉培養(yǎng)最適培養(yǎng)基組分測定。

蔗糖濃度設(shè)為0（CK，空白對照組）、5%、10%、15%、20%、25%、30%，培養(yǎng)基中硼酸和鈣離子濃度均為0.01%。硼酸濃度設(shè)置為0（CK）、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%；將第1步測定的最適蔗糖濃度加入培養(yǎng)基中，同時(shí)將鈣離子濃度設(shè)置為0.01%最低水平。最后，鈣離子（硝酸鈣）濃度設(shè)置為0（CK）、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%。將以上2步測定蔗糖和硼酸濃度作為測定最適鈣離子濃度培養(yǎng)基成分的濃度。

在涂有凡士林凹槽的載玻片上滴配置好的培養(yǎng)基，用鑷子輕輕夾起開裂的花藥將新鮮花粉抖落在培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿中放置1張濕濾紙，保持濕度，然后將載玻片放在培養(yǎng)皿濾紙上，25 ℃恒溫培養(yǎng)4 h后，顯微鏡下記錄并觀察，同時(shí)測量花粉管長度。

1.2.3 花粉最適貯藏溫度測定。

將文冠果花粉用鑷子取下用硫酸紙包好后貼上標(biāo)簽，分別裝入4個(gè)藥品袋中，然后將藥品袋分別放入-70 ℃超低溫冷凍箱，-20和4 ℃冰箱冷藏，25 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中。分別在第2天、第5天、第10天取出，在培養(yǎng)基中放置適量花粉，采用上述方法培養(yǎng)4 h后，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果花粉培養(yǎng)最適培養(yǎng)基篩選

2.1.1 蔗糖對文冠果花粉萌發(fā)的影響。

由表1可知，不同濃度蔗糖對文冠果花粉萌發(fā)率影響較大，與CK對比可知，蔗糖能明顯提升文冠果花粉離體萌發(fā)率，其中蔗糖濃度為15%時(shí)，最有利于花粉萌發(fā)（圖2A），花粉萌發(fā)率達(dá)92.9%。蔗糖濃度為5%～20%時(shí)，文冠果花粉萌發(fā)率在82.1%～92.9%，相差不大。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為25%時(shí)，文冠果花粉萌發(fā)率為48.6%，萌發(fā)率大幅下降，花粉萌發(fā)嚴(yán)重受到抑制。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30%時(shí)，萌發(fā)率很低，僅2.1%（圖2B）。

低濃度蔗糖有利于文冠果花粉管的生長，花粉管生長的最佳蔗糖濃度為10%，長度達(dá)1.86 mm。當(dāng)蔗糖濃度在5%～15%時(shí)，花粉管的生長快速，長度較長，為1.24～1.86 mm。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到25%及以上時(shí)，由于文冠果花粉萌發(fā)受到抑制，因此花粉管的伸長也受到影響，僅0.08～0.56 mm（表1）。

2.1.2 鈣對文冠果花粉萌發(fā)的影響。

由表2可知，鈣（硝酸鈣）可促進(jìn)文冠果花粉萌發(fā)，鈣濃度為0.01%時(shí)最有利于文冠果花粉萌發(fā)。對比CK可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中加入鈣后文冠果花粉萌發(fā)率均有一定程度的提高，0.01%～0.10%鈣濃度對文冠果花粉萌發(fā)均表現(xiàn)出提升效果，無抑制作用產(chǎn)生。因此，若研究文冠果花粉萌發(fā)試驗(yàn)，可添加0.01%最低水平鈣離子溶液，從而使花粉萌發(fā)率有一定提高。從花粉管長度數(shù)據(jù)可見，鈣離子對文冠果花粉管生長有一定影響。與CK相比，添加0.04%鈣離子后，花粉管長度達(dá)1.10 mm（圖3A），遠(yuǎn)長于CK的0.45 mm（圖3B）；在鈣離子達(dá)0.10%時(shí)，花粉管長0.47 mm，與CK相差不大，說明高鈣會(huì)抑制花粉管的生長。因此，研究花粉管生長的最適培養(yǎng)基中需添加0.04%鈣離子。

2.1.3 硼酸對文冠果花粉萌發(fā)的影響。

由表3可知，硼酸可促進(jìn)文冠果花粉萌發(fā)，相比CK，低濃度硼酸能刺激花粉萌發(fā)，提高花粉萌發(fā)率。硼酸濃度為0.01%～0.05%時(shí)，花粉萌發(fā)率為89.7%～92.5%，低濃度硼酸對文冠果花粉萌發(fā)均具有一定促進(jìn)作用。當(dāng)硼酸濃度為0.10%時(shí)，文冠果花粉萌發(fā)率大幅度降至56.3%，遠(yuǎn)低于CK（82.5%），說明硼酸濃度過高會(huì)產(chǎn)生抑制效果。因此，文冠果花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%硝酸鈣。

硼酸可加速文冠果花粉管的生長速度，利于花粉管伸長的硼酸濃度為0.02%，該濃度下花粉管粗細(xì)均勻，長度達(dá)1.61 mm（圖4A）；0.10%高硼酸環(huán)境會(huì)導(dǎo)致花粉管彎曲且尖端膨大，長度較短，僅有0.87 mm（圖4B）。與CK相比可以看出，硼酸濃度0.01%～0.10%對花粉管的伸長均具有促進(jìn)效果，但高濃度硼酸反而會(huì)導(dǎo)致花粉管生長畸形。

2.2 文冠果花粉貯藏條件

由圖5可知，文冠果同一批次新鮮花粉初始時(shí)的花粉萌發(fā)率為89.12%，隨著貯藏溫度升高，貯藏時(shí)間延長，花粉萌發(fā)率均出現(xiàn)不同程度降低。

-70 ℃超低溫貯藏條件下文冠果花粉萌發(fā)率變化不大，在2和5 d時(shí)花粉萌發(fā)率為88.75%和87.32%，在貯藏10 d時(shí)花粉萌發(fā)率仍可以達(dá)到86.51%。-20 ℃低溫冷凍條件下，文冠果花粉的萌發(fā)率在短時(shí)間內(nèi)仍能保持較高水平，在貯藏2和5 d花粉萌發(fā)率分別為87.82%和85.54%，10 d花粉萌發(fā)率為80.53%，可見在貯藏10 d文冠果萌發(fā)率出現(xiàn)較大下降。4 ℃低溫冷藏條件下，文冠果花粉萌發(fā)率出現(xiàn)略微降低，在2、5和10 d時(shí)花粉萌發(fā)率分別為85.72%、78.65%和70.28%。25 ℃常溫貯藏條件下，文冠果花粉萌發(fā)率明顯下降，在貯藏2 d時(shí)文冠果花粉萌發(fā)率為71.36%，較初始情況下有明顯下降，在貯藏5 d時(shí)花粉萌發(fā)率為56.75%，還有近50%的花粉具有生活力，在10 d后文冠果花粉萌發(fā)率僅4.87%，表示文冠果花粉大量失去活力，說明常溫不利于文冠果花粉的貯藏?？梢?，文冠果花粉在-70 ℃條件下有利于長期保存，-20和4 ℃次之，適合短期文冠果花粉保存，25 ℃常溫條件不利于文冠果花粉的保存，在貯藏10 d后花粉基本失去活力。

3 討論

相關(guān)研究表明，多數(shù)植物［6-9］所需的蔗糖濃度為10%～25%，而在文冠果培養(yǎng)基中蔗糖濃度為0.2%［4］，文冠果所需蔗糖濃度為10%～15%［2-3，5］，對此差異較大的蔗糖濃度可能是不同地區(qū)、不同氣候下植物生長差異所致。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，文冠果花粉離體萌發(fā)過程中，蔗糖濃度過低，會(huì)使文冠果花粉管在培養(yǎng)前期吸水膨脹，甚至出現(xiàn)破裂等情況。該試驗(yàn)中文冠果花粉萌發(fā)最適蔗糖溶液濃度為15%，花粉管生長蔗糖溶液最適濃度為10%，這與劉武林等［2-3，5］研究結(jié)果一致。

植物花粉離體萌發(fā)過程一般都需在培養(yǎng)基中添加適量硼酸［10-12］，而在文冠果花粉培養(yǎng)中，劉武林等［2］研究指出，培養(yǎng)液中不加入硼酸溶液時(shí)，文冠果花粉基本不會(huì)萌發(fā)，萌發(fā)率低于3%。但該試驗(yàn)中不加入硼酸時(shí)，花粉萌發(fā)率仍可以高達(dá)82.5%，這與劉武林等［2］的研究結(jié)果不同，可能是由于該試驗(yàn)中液體培養(yǎng)基組分中含有鈣離子（硝酸鈣），而劉武林等［2］的培養(yǎng)基中未加入鈣離子，推測在文冠果花粉離體萌發(fā)過程中，鈣離子可在某種程度上替代硼酸，從而促進(jìn)硼酸離子空白對照組中的花粉萌發(fā)率仍可以達(dá)到較高水平。該試驗(yàn)0.02%硼酸最適合文冠果花粉萌發(fā)和花粉管生長。

吳月亮等［5］研究結(jié)果表明，文冠果花粉培養(yǎng)基中不需要加入鈣；而蘆娟等［13］研究認(rèn)為，文冠果花粉培養(yǎng)需要較高濃度的鈣參與。該試驗(yàn)結(jié)果表明，適量的鈣會(huì)增加文冠果花粉離體萌發(fā)的數(shù)量，最適濃度為0.01%；而花粉管的生長需要更多鈣的參與，低鈣會(huì)導(dǎo)致花粉管頂端膨大破裂，這與對百合、海仙花的研究結(jié)果一致［14-15］。因此，若只探究文冠果花粉萌發(fā)率，可在培養(yǎng)基中添加少量的鈣溶液，若需要探究文冠果花粉管生長情況，則需加入0.04%鈣，從而使文冠果花粉管能夠正常生長。

低溫有利于花粉活力的保存已在多種植物中得到證實(shí)［16-18］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，-70 ℃超低溫最有利于文冠果貯藏，-20 ℃冷凍貯藏次之，4 ℃低溫貯藏可在短時(shí)間內(nèi)保持文冠果花粉萌發(fā)率，25 ℃恒溫貯藏不利于文冠果花粉貯藏，該環(huán)境下文冠果花粉萌發(fā)率降低過快，10 d后基本不再萌發(fā)，這與吳月亮等［5，19］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。因此，若要長期保存需要的文冠果花粉，-70 ℃超低溫貯藏保存效果較好，若短期保存文冠果花粉，-20 ℃低溫貯藏可達(dá)到較好的效果，既可保持花粉活力，又簡單經(jīng)濟(jì)有效。

綜上，文冠果花粉體外萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%硝酸鈣，培養(yǎng)時(shí)間為4 h；長期貯藏花粉使用-70 ℃超低溫保存，活力保持最好。

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