OSBPL2介導(dǎo)RhoA/ROCK2信號通路調(diào)控聽覺細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架

張 城，楊 倩，姚 俊，曹 新

南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，江蘇 南京 211166

氧化固醇結(jié)合蛋白樣蛋白2（oxysterol binding protein-like 2，OSBPL2）與氧化固醇結(jié)合蛋白（oxysterol binding protein，OSBP）同源，屬于OSBP 相關(guān)蛋白（OSBP-related protein，ORP）家族成員，作為一種重要的固醇感受器，參與了脂質(zhì)代謝、囊泡運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架調(diào)控等生物學(xué)過程［1］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)OSBPL2是常染色體顯性遺傳性非綜合征型耳聾（DFNA）的致病基因之一［2］，OSBPL2敲除的巴馬小型豬以及小鼠模型均表現(xiàn)為進(jìn)行性聽力損失，并伴隨有毛細(xì)胞靜纖毛的形態(tài)異常［3-4］。毛細(xì)胞靜纖毛是主要由肌動蛋白構(gòu)成的特化細(xì)胞器，靜纖毛以及肌動蛋白骨架功能正常是聽覺發(fā)生的必要條件。OSBPL2在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的靜纖毛中均有定位［5］，提示OSBPL2在聽覺細(xì)胞的肌動蛋白骨架調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，OSBPL2缺失會導(dǎo)致HuH7細(xì)胞中黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的磷酸化水平降低，并進(jìn)一步抑制細(xì)胞肌動蛋白骨架重塑、偽足與細(xì)胞極性形成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和細(xì)胞周期［6］。此外，OSBPL2也可以作為肌動蛋白細(xì)胞骨架的脂質(zhì)感受器，通過介導(dǎo)RhoA信號通路影響肝臟細(xì)胞的遷移、黏附和增殖［7］。RhoA 是Rho GTPase 家族重要成員之一，參與了多種以肌動蛋白為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程，特別在肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排中發(fā)揮重要調(diào)控作用［8］。但在內(nèi)耳組織和聽覺細(xì)胞中，OSBPL2是否存在同樣的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究將從體內(nèi)外水平研究OSBPL2參與聽覺細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控的機(jī)制，為進(jìn)一步探索OSBPL2 生物學(xué)功能及其突變致聾機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠耳蝸感覺上皮永生化細(xì)胞株HEI-OC1 細(xì)胞及其OSBPL2 敲除（Osbpl2-KO）細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存［9］，Osbpl2-KO 小鼠及其同窩野生型（Osbpl2-WT）小鼠由南京醫(yī)科大學(xué)動物中心凈化并配繁［4］。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動物福利倫理委員會同意（倫理編號：IACUC-1801003-1）。

實(shí)驗(yàn)所用抗體：纖維肌動蛋白（fibros actin，F(xiàn)actin）抗體（MA1-80729，上海賽默飛）、OSBPL2抗體（14751-1-AP，武漢Proteintech 公司）、GAPDH（5174S，CST，美國）、RhoA（A19106，武漢愛博泰克）、Rho 激酶2（Rho-associated coiled-coil-containing proteing kinase2，ROCK2）（A5698，武漢愛博泰克）、肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白1（actin depolymeriza factor/cofilin 1，ADF/CFL-1）抗體（5175，CST公司，美國）、Lim激酶1（LIM domain kinase 1，LIMK1）抗體（A16664，武漢愛博泰克），Phospho-LIMK1抗體（APO387，武漢愛博泰克），山羊抗鼠、抗兔IgG二抗（SA00001-1、SA00001-2，武漢Proteintech 公司）、熒光標(biāo)記山羊抗鼠、抗兔二抗（1741782、1748346，上海賽默飛）。

其他試劑：Western 及IP 細(xì)胞裂解液（P0013，南京碧云天）、RIPA 裂解液（P0013B，南京碧云天）、SYBRRGreen Master Mix（Q131，南京諾唯贊）、TGX Stain-FreeTMFastCastTMAcrylamide Kit、基因擴(kuò)增引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清制成完全培養(yǎng)基。將HEI-OC1 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于10%CO2飽和濕度的33 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，用胰酶消化、傳代并凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 耳蝸組織采集

取Osbpl2-KO 小鼠和Osbpl2-WT 對照小鼠，麻醉后用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注。待灌注出的生理鹽水澄清后，給小鼠斷頭，取出耳蝸，體視顯微鏡下用鑷子去除多余肌肉組織并在蝸頂打洞后多聚甲醛固定過夜，第2 天將耳蝸取出用PBS 清洗3 遍后，置于EDTA慢脫鈣液中，脫鈣7～10 d，脫鈣過程中可用鑷子夾一下耳蝸來衡量脫鈣狀態(tài)，鑷子夾起富有彈性則表示脫鈣完成。

1.2.3 掃描電鏡

將完成脫鈣的小鼠耳蝸置于體式顯微鏡下，采用顯微鑷與顯微剪分離基底膜，浸入5%戊二醛固定過夜；將固定后的基底膜依次浸入50%、70%、90%、100%乙醇中脫水各5 min，凍干后噴金；掃描電鏡下觀察毛細(xì)胞靜纖毛的形態(tài)與排列，并在不同觀察視野中選取17～18 個(gè)細(xì)胞，Image J 統(tǒng)計(jì)靜纖毛長度和寬度。

1.2.4 細(xì)胞爬片免疫熒光染色

待細(xì)胞密度為60%～80%時(shí)，吸棄原培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌3 遍；4%多聚甲醛固定爬片30 min，PBS 浸洗玻片3次，每次3 min；0.3%Triton X 室溫穿膜30 min，山羊血清封閉30 min；加稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3遍，每遍5 min，加稀釋后的二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3遍后，DAPI室溫孵育10 min，封片，熒光顯微鏡拍片，在觀察視野中選取8～10 個(gè)細(xì)胞，Image J分析F-actin熒光強(qiáng)度以及ADF/CFL-1的表達(dá)定位。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用直尺在6孔板底部畫間隔1 cm的直線。將消化下來的細(xì)胞重懸移入6孔板，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合成單層狀態(tài)后，用滅菌的200 μL槍頭垂直于6孔板底部橫線劃線，PBS洗滌3遍使得劃痕邊緣清晰，隨后加入無血清培養(yǎng)基。分別在0、12、24 h用倒置熒光顯微鏡拍照保存，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

取處在對數(shù)生長期的細(xì)胞株培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)液后，PBS 清洗3 遍。加入含蛋白酶抑制劑的RIPA強(qiáng)裂解液于冰上裂解15 min；將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，冰浴中超聲破碎處理3 次，每次5 s；12 000 r/min離心10 min（4 ℃），收集上清，采用BCA法測定各樣品蛋白濃度。取等量蛋白，采用12%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，PBS洗滌后加入一抗4 ℃孵育過夜，加入相對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBS 洗滌后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色法顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR

使用TRIzol 提取HEI-OC1 細(xì)胞總RNA，測定RNA 濃度后，取1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT -PCR）檢測。采用20 μL 擴(kuò)增體系：SYBR?Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95 ℃5 min；變性95 ℃10 s，退火/延伸60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)，目標(biāo)基因CT值使用GAPDH 基因CT值校正。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-RCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Osbpl2-KO對HEI-OC1細(xì)胞肌動蛋白骨架形態(tài)和功能的影響

采用Phalloidin 對細(xì)胞F-actin 細(xì)胞骨架進(jìn)行特異性標(biāo)記。在Osbpl2-WT HEI-OC1 細(xì)胞中，細(xì)胞周圍微刺突和絲狀偽足豐富；分布于細(xì)胞周邊的F-actin 外周致密束線條連續(xù)清晰，界限分明；由非極性單行排列的肌動蛋白絲組成的應(yīng)力纖維以及核區(qū)周圍的核骨架線條清晰，分布均勻，輪廓完整，在細(xì)胞中平行排列或者縱橫交錯形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而在Osbpl2-KO HEI-OC1 細(xì)胞中，細(xì)胞外周微刺突和絲狀偽足明顯減少；F-actin 外周較為致密，但輪廓并不連續(xù)完整；核骨架以及應(yīng)力纖維分布明顯減少（圖1A）。對細(xì)胞F-actin骨架的免疫熒光檢測表明，Osbpl2-KO HEI-OC1細(xì)胞的F-actin骨架熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?。?xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Osbpl2-KO HEIOC1 細(xì)胞遷移能力相比Osbpl2-WT 細(xì)胞明顯減弱（圖1B）。以上結(jié)果表明，Osbpl2-KO 顯著影響了HEI-OC1 細(xì)胞的F-actin 細(xì)胞骨架形態(tài)、分布和完整性。

圖1 Osbpl2-WT/KO HEI-OC1細(xì)胞肌動蛋白骨架形態(tài)功能分析Figure 1 Morphological and functional analysis of actin cytoskeleton in Osbpl2-WT/KO HEI-OC1 cells

2.2 Osbpl2-KO 抑制了HEI-OC1 細(xì)胞中RhoA/ROCK2信號通路

基于OSBPL2對HEI-OC1細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的影響，OSBPL2 可能通過介導(dǎo)RhoA/ROCK2 信號通路在聽覺細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能維持中發(fā)揮重要作用。qRT-PCR 和Western blot 檢測結(jié)果表明，在Osbpl2-KO HEI-OC1細(xì)胞中，RhoA、ROCK2和LIMK1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)（圖2），而LIMK1 作為Rho/ROCK 信號通路重要的下游分子，其磷酸化修飾程度影響肌動蛋白細(xì)胞骨架的解聚和聚合。以上結(jié)果表明，OSBPL2 通過介導(dǎo)HEI-OC1 細(xì)胞中RhoA/ROCK2 信號通路來調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架，Osbpl2-KO 抑制了HEI-OC1 細(xì)胞中RhoA/ROCK2 信號通路的活性，導(dǎo)致下游LIMK1 磷酸化水平降低，使得肌動蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性減弱，從而導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架的功能缺陷。

圖2 OSBPL2缺陷導(dǎo)致HEI-OC1細(xì)胞中RhoA/ROCK2信號通路被抑制Figure 2 OSBPL2 deficiency led to the inhibition of RhoA/ROCK2 signaling pathway in HEI-OC1 cells

2.3 OSBPL2對HEI-OC1細(xì)胞中ADF/CFL-1定位和表達(dá)的影響

ADF和CFL-1是肌動蛋白結(jié)合蛋白家族成員中作用于解聚微絲的蛋白群，同時(shí)也是LIMK1下游磷酸化的靶分子。ADF/CFL-1一般定位于細(xì)胞富含肌動蛋白微絲的部位，可切斷微絲并與肌動蛋白單體結(jié)合，在調(diào)控微絲聚合與解聚的動態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。對Osbpl2-WT/KO HEI-OC1 細(xì)胞的免疫熒光染色顯示，ADF/CFL-1 定位于Osbpl2-WT HEIOC1 細(xì)胞外周的微刺突，絲狀偽足以及應(yīng)力纖維和核骨架肌動蛋白絲的末端。而在Osbpl2-KO HEIOC1 細(xì)胞中，定位有ADF/CFL-1 的F-actin 末端的數(shù)量顯著減少（圖3A、B）。此外，Osbpl2-KO HEI-OC1細(xì)胞中，ADF/CFL-1 的表達(dá)水平顯著下降（圖3C、D）。這些結(jié)果表明Osbpl2-KO抑制了HEI-OC1細(xì)胞中RhoA/ROCK2 信號通路的活性，且影響其下游效應(yīng)蛋白ADF/CFL-1在F-actin 末端的定位，導(dǎo)致細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架解聚失衡，從而影響了細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架形態(tài)和功能。

圖3 ADF/CFL-1在HEI-OC1細(xì)胞中的定位和表達(dá)Figure 3 Expression and localization of ADF/CFL-1 in HEI-OC1 cells

2.4 Osbpl2-KO對小鼠耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛形態(tài)的影響及其分子機(jī)制的驗(yàn)證

靜纖毛是耳蝸毛細(xì)胞最先感受聲波刺激的部位，其形態(tài)維持和生理功能的行使是聽覺發(fā)生的必要條件。為此，進(jìn)一步對OSBPL2-RhoA/ROCK2-ADF/CFL1 的分子機(jī)制進(jìn)行了在體水平的驗(yàn)證，并探索了Osbpl2-KO對小鼠耳蝸毛細(xì)胞靜毛形態(tài)的影響。Osbpl2-KO 小鼠耳蝸中，RhoA、ROCK2 和ADF/CFL1 均顯示下調(diào)，這一結(jié)果與Osbpl2-KO HEI-OC1細(xì)胞中相應(yīng)效應(yīng)因子的變化趨勢一致（圖4A）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，與Osbpl2-WT 小鼠相比，Osbpl2-KO 小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛排列較為紊亂，靜纖毛的長度較短較細(xì)（圖4B）。結(jié)果表明，OSBPL2 通過RhoA/ROCK2 信號通路介導(dǎo)了毛細(xì)胞肌動蛋白骨架的調(diào)控，并對耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛微絲骨架的形態(tài)維持和功能具有重要影響。

圖4 OSBPL2介導(dǎo)RhoA/ROCK2信號通路影響小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛形態(tài)Figure 4 OSBPL2 affected stereociliary morphology on mouse cochlear inner hair cells via the mediation of RhoA/ROCK2 signaling pathway

3 討論

本課題組在前期研究中定位和克隆了一個(gè)新的遺傳性耳聾致病基因OSBPL2［2］。在后續(xù)研究中，采用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了Osbpl2-KO 巴馬小型豬模型和小鼠模型，成功模擬了人OSBPL2 的臨床表型。此外，還在巴馬小型豬模型上觀察到耳蝸毛細(xì)胞以及靜纖毛的形態(tài)異常，包括毛細(xì)胞缺失，靜纖毛缺失、倒伏和排列紊亂等［3］。在Osbpl2-KO小鼠中也觀察到異常的耳蝸發(fā)育并伴隨有纖毛缺陷［4］。以上研究結(jié)果提示，OSBPL2突變導(dǎo)致的聽力損失可能與耳蝸毛細(xì)胞肌動蛋白骨架形態(tài)和功能異常有關(guān)。

OSBP/ORP 家族成員在脂質(zhì)代謝、囊泡運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用［10-11］：OSBP/ORP羧基端共有含OSBP 指紋基序“EQVSHHPP”的ORD結(jié)構(gòu)域（OSBP-related ligand-binding domain），在固醇結(jié)合中發(fā)揮重要作用；OSBP/ORP 和囊泡相關(guān)膜蛋白（vesicle associated membrane protein，VAP）相互作用介導(dǎo)胞內(nèi)的膜接觸位點(diǎn)進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流，從而維持細(xì)胞脂質(zhì)的動態(tài)平衡［12］；OSBP/ORP家族成員還參與了細(xì)胞骨架的調(diào)控過程，如ORP3可以調(diào)節(jié)R-Ras 活性，進(jìn)而調(diào)控F-actin 的組裝［13］，ORP4 可以調(diào)控波形蛋白（vimentin）介導(dǎo)微絲組裝過程［14］。OSBPL2（即ORP2）是OSBP/ORP 家族中唯一被發(fā)現(xiàn)與遺傳性耳聾相關(guān)的基因，對其功能的研究最初集中在脂質(zhì)代謝和固醇轉(zhuǎn)運(yùn)方面。近年來有研究發(fā)現(xiàn)OSBPL2可作為特定信號通路的效應(yīng)因子行使其特有的生物學(xué)功能［15］。在HuH7 細(xì)胞中，OSBPL2 是AKT 信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，同時(shí)也與多個(gè)Rho GTPase 信號通路效應(yīng)因子如DIAPH1、MLC12、SEPT9 等存在相互作用，從而影響細(xì)胞肌動蛋白骨架重塑、偽足和細(xì)胞極性形成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和細(xì)胞周期［7］。在Osbpl2-KO HEI-OC1 細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞黏附異?，F(xiàn)象，且FAK 信號通路受到了抑制，而FAK 正位于Rho GTPase 信號通路的上游［9］。以上研究表明OSBPL2在聽覺細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮著重要作用，并且可能是通過Rho GTPase信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

Rho GTPase 家族成員參與了多種以肌動蛋白為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程［16］，包括細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞生長、分化、黏附、遷移等。RhoA 是Rho GTPase 家族重要成員之一，在細(xì)胞微環(huán)境以及各種生長因子的作用下，以GTP結(jié)合的活性形式與GDP結(jié)合的非活性形式發(fā)揮其分子開關(guān)的調(diào)控作用。RhoA 的下游主要效應(yīng)物Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有ROCK1和ROCK2兩種亞型，在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移和應(yīng)力纖維形成等發(fā)面具有重要的調(diào)控作用［17］。當(dāng)RhoA 的活性形式與ROCK 結(jié)合后，ROCK進(jìn)入激活狀態(tài)，調(diào)控LIM 基序的LIMK 的磷酸化［18］。LIMK 又能磷酸化F-actin 并使其解聚活性失活，從而導(dǎo)致肌動蛋白絲的穩(wěn)定［19］。RhoA/ROCK 信號通路及其效應(yīng)因子在聽力的發(fā)育和形成中也發(fā)揮著重要作用［20］。有研究表明ROCK2 是小鼠耳蝸內(nèi)表達(dá)的主要亞型，噪音暴露可引起耳蝸中ROCK2的表達(dá)下調(diào)，引起耳蝸毛細(xì)胞肌動蛋白解聚，從而導(dǎo)致聽力下降［21］。此外，ADF/CFL-1 作為LIMK1 下游磷酸化的靶分子，定位于耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛的頂端，參與調(diào)控毛細(xì)胞細(xì)胞骨架中肌動蛋白的解聚和聚合。其定位、表達(dá)和磷酸化水平的異常會影響肌動蛋白骨架的重塑和機(jī)械信號的傳導(dǎo)，導(dǎo)致聽覺器官發(fā)育異常和聽力障礙［22］。本研究表明，在Osbpl2-KO 小鼠耳蝸和HEI-OC1細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了肌動蛋白骨架形態(tài)異常，RhoA/ROCK2 信號通路的活性均受到抑制，下游LIMK1表達(dá)水平和磷酸化水平顯著降低，并且導(dǎo)致LIMK1下游效應(yīng)蛋白ADF/CFL-1表達(dá)水平明顯下降，其在細(xì)胞微絲骨架中F-actin末端的定位明顯減少。