信號(hào)肽優(yōu)化提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)量

張娜， 閆亞茹， 武運(yùn)*， 張宇宏*， 張偉

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，能夠?qū)Ｒ坏匮趸咸烟巧善咸烟撬岷瓦^(guò)氧化氫，具有脫氧、除葡萄糖、殺菌以及生成葡萄糖酸的作用[1]，近年來(lái)被廣泛用于與人體健康密切相關(guān)的食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等行業(yè)[2]。GOD 能夠有效地改善小麥面筋的組織結(jié)構(gòu)，提高面團(tuán)的持氣性、彈性、韌性和持水性，從而改善面包品質(zhì)[3]；在白葡萄酒生產(chǎn)中加入GOD 可有效防止酚類對(duì)白葡萄酒產(chǎn)生的嚴(yán)重褐變[4]；GOD 催化產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可充當(dāng)漂白劑在紡織品中使用[5]；在口腔護(hù)理產(chǎn)品中添加GOD 可起到抑制微生物的作用[6]；此外，GOD 是新型傳感器中的重要組成部分，可以用來(lái)測(cè)定糖含量[7]。

多種動(dòng)植物和真菌都可產(chǎn)生GOD，而商業(yè)GOD 主要來(lái)源于黑曲霉和青霉菌發(fā)酵[8]。在發(fā)酵過(guò)程中，黑曲霉和青霉菌會(huì)生成過(guò)氧化氫酶和纖維素酶等其他副產(chǎn)物，產(chǎn)生的大量雜蛋白會(huì)使后期的分離純化工作變復(fù)雜，且增加生產(chǎn)成本。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，使用重組基因工程菌株表達(dá)葡萄糖氧化酶有望解決這些問(wèn)題，在這其中，巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是更具高效生產(chǎn)GOD潛力的微生物[9-10]，Valdivieso-ugarte 等[11]克隆了黑曲霉BT18的葡萄糖氧化酶基因，并將其作為表達(dá)盒的一部分整合到釀酒酵母宿主菌株的核糖體DNA中，獲得了含有高達(dá)90%低聚果糖的最終糖漿。Li 等[12]將密碼子優(yōu)化的水仙凝集素（narcissus tazetta lectin，NTL）基因在畢赤酵母中成功表達(dá)，并在5 L 規(guī)模的發(fā)酵罐中發(fā)酵96 h 后得到重組NTL蛋白質(zhì)，產(chǎn)量高達(dá)1.2 g·L-1。周亞鳳等[13]將來(lái)源于黑曲霉的GOD 基因在畢赤酵母中進(jìn)行了重組表達(dá)，誘導(dǎo)所得發(fā)酵液的酶活為30～40 U·mL-1。將克隆的GOD 基因與宿主表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得基因工程菌株，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的方法可得到大量GOD 蛋白。畢赤酵母本身內(nèi)源蛋白的分泌量很少，且可以將外源目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，所以后期的蛋白純化操作較為簡(jiǎn)單[14]。近年來(lái)，許多蛋白質(zhì)在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，但仍然有多種蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)較低[15-16]。提高畢赤酵母外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量是降低工業(yè)化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。

在畢赤酵母表達(dá)體系中，菌株、培養(yǎng)基以及發(fā)酵工藝等已經(jīng)逐漸成熟，構(gòu)建高效表達(dá)的載體是提高外源基因表達(dá)量的重要因素。利用畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，最常見(jiàn)的分泌信號(hào)是釀酒酵母α 信號(hào)肽（α mature factor）[17]。分泌信號(hào)由2 部分組成，一部分是19 個(gè)氨基酸的N-末端信號(hào)序列，指導(dǎo)易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）；另一部分是66 個(gè)氨基酸的蛋白區(qū)，介導(dǎo)受體依賴性包裝進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的COP Ⅱ轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡[18-19]，重組蛋白通過(guò)ER 腔中的Kex 2 蛋白酶去除α 因子信號(hào)序列。α 因子信號(hào)肽在畢赤酵母中能有效分泌多種異源蛋白質(zhì)，但不同蛋白的表達(dá)水平差異較大，因此，人們不斷探索新的方法改造信號(hào)肽，以提高蛋白表達(dá)水平或分泌效率。Tanaka 等[20]使用嗜酸性木聚糖酶自身信號(hào)肽、α 信號(hào)肽、酸性磷酸酶（PHO1）信號(hào)肽在GS115 中分泌表達(dá)顯示，α 信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量是其他信號(hào)肽的2倍。Ghosalkar等[21]用IFN-α2自身信號(hào)肽及α 信號(hào)肽在畢赤酵母GS115 中分泌表達(dá)，結(jié)果表明，α 信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白高效分泌，產(chǎn)量達(dá)200 mg·L-1，而自身信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白不能分泌表達(dá)。應(yīng)用α信號(hào)肽也成功實(shí)現(xiàn)了Insulin、plectasin等多種蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)[22]。以上研究結(jié)果表明，α 信號(hào)肽在應(yīng)用中較其他信號(hào)肽更為有效。為了在原有基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高蛋白表達(dá)和分泌效率，有必要對(duì)α 信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)。Lin-cereghino 等[23]利用釀酒酵母α 因子分泌信號(hào)的缺失誘變確定了可以被去除并改善分泌的氨基酸段，并利用這些結(jié)果為其潛在結(jié)構(gòu)生成模型。熊愛(ài)生等[24]通過(guò)在釀酒酵母的α因子信號(hào)肽序列N 端分別引入1～10 個(gè)畢赤酵母AOX1蛋白質(zhì)的N 端氨基酸構(gòu)建了10種不同的分泌信號(hào)肽序列，結(jié)果以N端加入A、I、P這3個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列對(duì)植酸酶基因的表達(dá)量影響最大。然而，目前關(guān)于通過(guò)改變信號(hào)肽核酸序列（氨基酸序列不變）而改善葡萄糖氧化酶表達(dá)量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以重組表達(dá)GOD 的菌株AGODm-pPICZαA 為出發(fā)菌株，利用畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)α 因子信號(hào)肽序列進(jìn)行改造，重新構(gòu)建連有不同α信號(hào)肽的葡萄糖氧化酶重組表達(dá)酵母菌株，提高GOD 在畢赤酵母中的表達(dá)量，解決原始基因在畢赤酵母中表達(dá)量低的缺陷，進(jìn)一步降低酶蛋白生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115、表達(dá)載體pPICZαA 及帶有葡萄糖氧化酶基因的質(zhì)粒AGODm-pPICZαA 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

PCR 相關(guān)試劑和大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo 公司；抗生素Zeocin（100 mg·mL-1）購(gòu)自Invitrogen 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；重組酶2×Clone Express Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶、鄰聯(lián)茴香胺、生物素和YNB（酵母無(wú)氨基氮源）購(gòu)自Amresco 公司；其他普通化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

10×YNB：YNB 用 蒸 餾水 配 制為134 g·L-1，0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌。

500×生物素：生物素用蒸餾水配制為0.2 g·L-1，0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，葡 萄 糖20 g·L-1，固 體 培 養(yǎng) 基 另 加 入15 g·L-1瓊脂粉，108 ℃下高壓滅菌30 min。

YPDZ固體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，葡 萄 糖20 g·L-1，瓊 脂 粉20 g·L-1，108 ℃下高壓滅菌30 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入Zeocin（300 μg·mL-1）。

LB 培 養(yǎng) 基：蛋 白 胨10 g·L-1，酵 母 提 取 物5 g·L-1，氯 化 鈉10 g·L-1，固 體 培 養(yǎng) 基 另 加 入15 g·L-1瓊脂粉，121 ℃下高壓滅菌20 min。

BMGY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，K2HPO43 g·L-1，KH2PO411.8 g·L-1，甘油1 g·L-1，121 ℃下高壓滅菌20 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入1/10 體積的10×YNB、1/500 體積的500×生物素。

BMMY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，K2HPO43 g·L-1，KH2PO411.8 g·L-1，121 ℃下高壓滅菌20 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入1/10 體積的10×YNB、1/500 體積的500×生物素和1%甲醇（體積分?jǐn)?shù)）。

1.2 儀器

主要儀器包括PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）、JS-680D 凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、立式高速離心機(jī)（日本HITACHI 公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、UV-2800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）、L-550 臺(tái)式大容量離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、平板搖床（德國(guó)Heidolph公司）。

1.3 不同α因子信號(hào)肽的優(yōu)化與載體構(gòu)建

1.3.1 α 因子信號(hào)肽的優(yōu)化與合成 試驗(yàn)用表達(dá)載體為pPICZαA，信號(hào)肽為α 因子。在不改變?chǔ)烈蜃有盘?hào)肽氨基酸序列的前提下，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性和mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)能量，對(duì)α 因子信號(hào)肽DNA 序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，從而得到一系列新的信號(hào)肽DNA 序列。并計(jì)算其對(duì)應(yīng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index, CAI）（BitGene軟件），使用RNAfold WebServer 軟件預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和能量，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行信號(hào)肽DNA合成。

1.3.2 α 因子信號(hào)肽與表達(dá)載體的重組 實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建了葡萄糖氧化酶的重組表達(dá)載體AGODm-pPICZαA。根據(jù)不同信號(hào)肽序列，分別設(shè)計(jì)引物α-signal-F和α-signal-R，詳見(jiàn)表1。引物兩端各含有20 bp 與AGODm-pPICZαA 同源的序列。以α-signal-F 和α-signal-R 為引物，以合成的各信號(hào)肽DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得各信號(hào)肽的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 體系如下：phanta 酶1 μL，2×phanta buffer 25 μL，dNTP 1 μL，引 物α-signal-F 2 μL，引物α-signal-R 2 μL，α 信號(hào)肽質(zhì)粒1 μL，ddH2O 18 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測(cè)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收備用。

表1 基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers for gene amplification

設(shè)計(jì)引物ZT-pPICZαA-F 和ZT-pPICZαA-R（表1），以AGODm-pPICZαA 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR 方法同1.3.2，獲得含有GOD 基因表達(dá)盒的DNA 片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測(cè)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收備用。將上述2種DNA片段與2×Clone Express Mix 重 組 酶 混 合，25 ℃反 應(yīng)15 min 后取出置于冰上靜置5 min，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化操作。

1.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 將10 μL 上述重組產(chǎn)物加入到大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30 min，在42 ℃水浴中熱激60 s 后立即置于冰上冰浴2 min，加入300 μL 的LB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床（200 r·min-1）孵育1 h，取200 μL 菌液，涂布含有Zecion（25 μg·mL-1）的LB 平板，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。待LB 平板轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，通過(guò)PCR 方法進(jìn)行鑒定，PCR 體系如下：Taq DNA 聚 合 酶0.4 μL，10×Easy Taq buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，引物α-signal-F 2 μL，引物3-AOX 2 μL，模板1 μL，ddH2O 10 μL。PCR 程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。陽(yáng)性克隆即為連有不同信號(hào)肽的葡萄糖氧化酶重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，將其命名為α-signal-AGODm-pPICZαA。

1.3.4 重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS115中的表達(dá) 將陽(yáng)性克隆接種到含Zecion（25 μg·mL-1）液體的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床（200 r·min-1）過(guò)夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。使用SacⅠ限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒酶切線性化；然后加入0.8倍體積的異丙醇將線性化后的DNA 片段沉淀，75%乙醇清洗2 次，沉 淀 干燥后用15 μL 超 純水溶解，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取上述處理過(guò)的線性化質(zhì)粒10 μL，加入100 μL 畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰上靜置20 min，2.5 kV 電擊6.0 ms 后，立即加入500 μL冰預(yù)冷的1 mol·L-1山梨醇溶液和500 μL的YPD培養(yǎng)基，28 ℃恒溫?fù)u床（200 r·min-1）中孵育2 h。菌體涂布YPDZ 固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，直至酵母陽(yáng)性克隆子長(zhǎng)出。

1.4 重組葡萄糖氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取酵母陽(yáng)性克隆子接種于含有500 μL BMGY 培養(yǎng)基的48 孔平板中，28 ℃恒溫振蕩（750 r·min-1）培養(yǎng)36 h；離心去除上清，菌體用500 μL BMMY 培 養(yǎng) 基 重 懸，28 ℃恒 溫 振 蕩（750 r·min-1）培養(yǎng)，每隔24 h 補(bǔ)加1%甲醇，培養(yǎng)72 h 后離心去除菌體，上清即為葡萄糖氧化酶粗酶液。

上述酶活力誘導(dǎo)表達(dá)重復(fù)進(jìn)行4 次，用于確認(rèn)篩選結(jié)果。

1.5 GOD酶活力測(cè)定和數(shù)據(jù)處理

在試管中加入除葡萄糖氧化酶之外的其余反應(yīng)底物（1.25 mL 的鄰聯(lián)茴香胺緩沖液；0.15 mL 的18%葡萄糖溶液；0.05 mL 的90 U·mL-1辣根過(guò)氧化物酶溶液），30 ℃保溫2 min 后，加入葡萄糖氧化酶溶液0.05 mL，反應(yīng)3 min 后，加入1 mL H2SO4（2 mol·L-1）終止反應(yīng)，測(cè)定540 nm 處的吸光值，根據(jù)制定的GOD 酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活力。使用Origin 8.5 軟件對(duì)GOD 酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

葡萄糖氧化酶(GOD)酶活單位（U）定義為：30 ℃、pH 6.0 條件下，每分鐘催化1 μmoL β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫所需的酶量。

1.6 重組葡萄糖氧化酶蛋白純化

使用截留分子量為10 kD 的超濾膜包對(duì)重組葡萄糖氧化酶進(jìn)行脫鹽和濃縮，濃縮后的酶液采用陰離子交換層析柱HiTrap CaptoQ（5 mL）進(jìn)行純化，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[6]。將純化后的5 種重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α信號(hào)肽優(yōu)化及分析

2.1.1 5 種不同信號(hào)肽的優(yōu)化設(shè)計(jì) 以野生型信號(hào)肽αWT為基礎(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性和信號(hào)肽mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)能量，設(shè)計(jì)了4 種不同信號(hào)肽α1、α2、α3與α4，5種α 信號(hào)肽序列比對(duì)結(jié)果如圖1 所示。α1和α2信號(hào)肽中使用了大量畢赤酵母最高頻率密碼子，而α3和α4信號(hào)肽則使用了大量畢赤酵母低頻率密碼子。

圖1 5種不同信號(hào)肽DNA序列比對(duì)Fig. 1 DNA sequence alignment of five different signal peptide

2.1.2 5 種不同信號(hào)肽的序列分析 根據(jù)5 種α信號(hào)肽各自的基因序列分析得到對(duì)應(yīng)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖2 所示，左側(cè)為每種信號(hào)肽的最小自由能結(jié)構(gòu)，右側(cè)是最小自由能結(jié)構(gòu)的山形圖。由各個(gè)信號(hào)肽的最小自由能（圖3）和密碼子適應(yīng)指數(shù)（圖4）可知，αWT信號(hào)肽的自由能為-53.8 kcal·moL-1；α1和α2信號(hào)肽中采用了高頻密碼子，密碼子適應(yīng)指數(shù)分別為0.96和0.82，自由能分別為-46.9 和-54.2 kcal·moL-1；而α3和α4信號(hào)肽對(duì)應(yīng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)分別為0.46 和0.40，自由能分別為-91.7和-99.9 kcal·moL-1。

圖2 5種 α 信號(hào)肽mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Secondary structure of five α-signal peptide mRNAs

圖3 5種α信號(hào)肽的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能量Fig. 3 mRNA secondary structure energy of five α-signal peptides

圖4 5種α信號(hào)肽的密碼子適應(yīng)指數(shù)Fig. 4 Codon adaptation indices of five α-signal peptides

2.2 連接不同α 信號(hào)肽的重組菌株的葡萄糖氧化酶活力

將優(yōu)化后的4 種信號(hào)肽與野生型信號(hào)肽分別在畢赤酵母GS115 中進(jìn)行表達(dá)，電擊轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母后，每種信號(hào)肽對(duì)應(yīng)的重組菌株均含有200 個(gè)以上重組子，各隨機(jī)選取24 個(gè)單克隆進(jìn)行酶液誘導(dǎo)。將含各種信號(hào)肽的重組菌株酶活力分別與含野生型信號(hào)肽的重組菌株酶活力進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果（圖5）顯示，αWT信號(hào)肽對(duì)應(yīng)重組菌株的平均酶活力為5.32 U·mL-1；連有α1、α2信號(hào)肽重組菌株的GOD 酶活力明顯高于野生型菌株。其中連有α1信號(hào)肽重組菌株的平均酶活力10.74 U·mL-1，是野生型αWT的2.01 倍；連有α2信號(hào)肽重組菌株的酶活力是9.62 U·mL-1，是野生型αWT的1.80 倍；而連有α3、α4信號(hào)肽重組菌株的酶活力明顯降低，其中α4信號(hào)肽重組菌株酶活力僅為野生型αWT的41%。

圖5 不同信號(hào)肽重組菌株及野生型信號(hào)肽重組菌株的GOD酶活力Fig. 5 GOD enzyme activity of recombinant strains with different signal peptides and recombinant strains containing wild-type signal peptides

上述結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證具有可重復(fù)性（圖6），與αWT信號(hào)肽重組菌株相比，α1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型；而使用低頻率密碼子構(gòu)建的α4信號(hào)肽重組菌株的酶活力最低，遠(yuǎn)低于野生型。

圖6 酶活力平均值Fig. 6 Enzyme activity average

2.3 重組葡萄糖氧化酶SDS-PAGE分析

粗酶液經(jīng)10 kD 的超濾膜包脫鹽及HiTrap CaptoQ 陰離子交換層析柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組GOD與野生型GOD蛋白的分子量大小一致，均為80 kD左右（圖7）。

圖7 重組菌株GOD的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of recombinant strains GOD

3 討論

大多數(shù)氨基酸由多個(gè)密碼子編碼，在各種宿主中，密碼子的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)有重要影響。Goodman 等[25]建立并測(cè)量了大腸桿菌中14 000 多個(gè)合成報(bào)告基因的表達(dá)，表明用N 端稀有密碼子代替普通密碼子可使蛋白表達(dá)量增加14 倍（中位數(shù)4 倍）。mRNA 分子中的同義密碼子突變可改變DNA 序列的化學(xué)特性及其翻譯速率。但是，由于共翻譯錯(cuò)誤折疊，密碼子翻譯速率的變化可能導(dǎo)致新生蛋白質(zhì)發(fā)生功能異常[26]。

釀酒酵母α因子信號(hào)肽目前是畢赤酵母中使用最多且成功率最高的信號(hào)肽。Barrero等[27]設(shè)計(jì)了1 種由釀酒酵母Ost1 信號(hào)序列組成的分泌信號(hào)，與使用原始α 因子分泌信號(hào)肽所獲得的表達(dá)水平相比，該信號(hào)肽序列將紅色熒光蛋白E2-Crimson 提 高 了20 倍，脂 肪 酶BTL2 增 加 了10倍。Lsada-lombana等[28]通過(guò)信號(hào)肽和PMP1t促進(jìn)共同翻譯易位導(dǎo)致蛋白的胞外水平升高，使細(xì)胞外mRFP 和β-葡萄糖苷酶的水平分別提高了5.8和7.1倍。

信號(hào)肽提高了重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)水平，其原因是α 信號(hào)肽能夠介導(dǎo)新生肽翻譯并同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔表面，從而提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。這種效應(yīng)與信號(hào)肽本身共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的功能及信號(hào)肽疏水核心的疏水強(qiáng)度有密切關(guān)系。信號(hào)肽疏水性的增強(qiáng)可以提高信號(hào)肽的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。Oberste等[29]研究發(fā)現(xiàn)，酵母PhoA 信號(hào)肽疏水核心Leu/Ala 值為6∶4 時(shí)，信號(hào)肽分泌能力隨著疏水性的增強(qiáng)而提高，此時(shí)前體蛋白質(zhì)能較好地分泌。

自由能是衡量mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素，能量值越小，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，但越不利于后期的解折疊及翻譯。本研究中，α4信號(hào)肽自由能為-99.9 kcal·moL-1，能量值最小，GOD的表達(dá)量也最低。而對(duì)應(yīng)的，α1信號(hào)肽自由能為-46.9 kcal·moL-1，在各組信號(hào)肽中能量值最高，其GOD 表達(dá)量也最高。本研究并未改變目的蛋白的DNA和氨基酸序列，也未改變信號(hào)肽的氨基酸序列，僅通過(guò)優(yōu)化信號(hào)肽的密碼子改變其mRNA結(jié)構(gòu)，從而改變了GOD蛋白的表達(dá)量，揭示了畢赤酵母表達(dá)框N 端的mRNA 結(jié)構(gòu)可能對(duì)外源蛋白表達(dá)有較大影響。因此本研究提供了1 種新的改善畢赤酵母外源蛋白表達(dá)量的策略，但后期仍需要通過(guò)多種不同外源蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)畢赤酵母α 因子信號(hào)肽進(jìn)行改造，使用畢赤酵母高頻密碼子的α1、α2信號(hào)肽，其對(duì)應(yīng)重組菌株的GOD 酶活力明顯高于野生型，最高可達(dá)野生型的2.01 倍；而使用畢赤酵母低頻密碼子且自由能較低的α3、α4信號(hào)肽，其對(duì)應(yīng)重組菌株的酶活力低于野生型，最低僅為野生型的41%。