具有分子伴侶功能的抗體*

林景也 李 森

（1）北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875；2）北京師范大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 100875）

在生物體中，即使是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的大分子在正常情況下也能精確、保真地進(jìn)行自組裝，蛋白質(zhì)自發(fā)折疊成緊湊的三維結(jié)構(gòu)是其中最普遍的例子。蛋白質(zhì)折疊對于生命活動具有重大意義，除了產(chǎn)生正常的生物活性外，其還與許多生物進(jìn)程密切相關(guān)，包括將分子運(yùn)輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞位置以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化等［1］。毫無疑問，只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能在擁擠的生物環(huán)境中具有長期穩(wěn)定性并承擔(dān)正常的生理功能。蛋白質(zhì)無法正確折疊或者無法維持正確折疊的結(jié)構(gòu)是多種病理狀況的根源［2］。體外及體內(nèi)的多肽鏈在某些情況下會產(chǎn)生缺乏生物學(xué)活性的錯誤折疊構(gòu)象，蛋白質(zhì)的錯誤折疊常常伴隨著蛋白質(zhì)的異常聚集。這不僅給蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)帶來了困難，也是體內(nèi)蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的根源。

在蛋白質(zhì)的折疊過程中，分子伴侶發(fā)揮了重要作用，一些分子伴侶與新生肽鏈相互作用，另一些分子伴侶則會參與蛋白質(zhì)折疊過程的后期階段，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［3-4］。天然的分子伴侶通常是多功能的，具有非特異性。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些抗體也具有分子伴侶功能，這無疑是令人驚喜的，因?yàn)榭贵w天然具備了對靶蛋白的高親和力及高特異性的優(yōu)點(diǎn)。對這一類抗體的研制和應(yīng)用將有助于在工業(yè)生產(chǎn)中提高包涵體等蛋白質(zhì)產(chǎn)品的復(fù)性效率，也有利于研發(fā)用于治療蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的生物藥物。本文主要介紹了具有分子伴侶功能的抗體的發(fā)現(xiàn)、研究進(jìn)展及具體應(yīng)用。

1 分子伴侶的發(fā)現(xiàn)、概念與基本功能

分子伴侶（molecular chaperone） 一詞源于1978 年，Laskey 等［5］首次在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一種核內(nèi)酸性蛋白（nucleoplasmin）是組蛋白和DNA組裝成核小體的必需物質(zhì)，他們將這種蛋白質(zhì)命名為“molecular chaperone”。后來Ellis 等［6］在研究高等植物葉綠體中的核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）時也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，在葉綠體中合成的8 個大亞基與在細(xì)胞質(zhì)中合成的8 個小亞基必須先和一種蛋白質(zhì)結(jié)合后，才能在葉綠體內(nèi)組裝成活性酶分子。1987 年Ellis［7］正式提出了“molecular chaperone”的概念，經(jīng)幾度修正，1993 年Ellis［8］給了“分子伴侶”更確切的定義：即一大類相互之間沒有關(guān)系的蛋白質(zhì)，它們具有的共同功能是幫助其他含多肽類結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行正確的非共價組裝，但不是這些物質(zhì)在發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能時的永久組成成分。分子伴侶廣泛存在于各類細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)當(dāng)中，并參與多個細(xì)胞進(jìn)程，包括幫助蛋白質(zhì)從頭折疊、防止錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集、參與寡聚蛋白質(zhì)的組裝、變性蛋白質(zhì)的重折疊、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸以及協(xié)助蛋白質(zhì)的水解［9］。

分子伴侶目前已被發(fā)現(xiàn)具有很多重要的生理功能與實(shí)用價值。首先，其可用于預(yù)防和治療蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病，一方面通過幫助蛋白質(zhì)正確折疊、防止錯誤折疊和聚集，從根本上降低蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的發(fā)病可能，另一方面結(jié)合新生肽鏈并穩(wěn)定其構(gòu)象，幫助蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，避免因蛋白質(zhì)無法正確轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致折疊病的發(fā)生。其次，分子伴侶是一類具有重要生理意義的分子，參與生物機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)、遺傳物質(zhì)的復(fù)制轉(zhuǎn)錄、生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期與凋亡的調(diào)控、腫瘤細(xì)胞的增殖等過程。此外，在工業(yè)與醫(yī)藥業(yè)生產(chǎn)中，分子伴侶可用于幫助化學(xué)變性劑變性的包涵體蛋白進(jìn)行正確折疊，從而提高包涵體蛋白的復(fù)性效率［10-11］。

2 分子伴侶范圍的擴(kuò)大

自分子伴侶的概念提出以來，分子伴侶的范圍實(shí)際上一直在擴(kuò)展。

王志珍院士對二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerse，PDI）進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)PDI既是酶又是分子伴侶，其不僅可以催化天然二硫鍵的形成，還可以作為分子伴侶來促進(jìn)多肽鏈的正確折疊［12］。一些研究也發(fā)現(xiàn)肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶（peptidyl prolyl isomerse，PPI）家族的部分成員同樣具有一定的伴侶功能，比如SlyD 可作為融合伴侶以及溶解度增強(qiáng)劑，在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，顯著增強(qiáng)了許多易于聚集的異源蛋白質(zhì)的溶解性［13］。大腸桿菌周質(zhì)伴侶SurA同樣也是一種肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶，已有研究表明，它可以促進(jìn)外膜孔的正確折疊和成熟［14］，且其自身結(jié)構(gòu)可選擇性地結(jié)合特定底物［15］。本課題組研究了人親環(huán)素18（human cyclophilin 18，hCyp18，一種分子質(zhì)量為18 ku 的肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶）對人肌肌酸激酶（human creatine kinase，HCK）去折疊的影響作用，發(fā)現(xiàn)hCyp18能夠抑制HCK的失活與構(gòu)象變化，并有效緩解其在變性過程中的聚集，從而推斷hCyp18 具有針對HCK 的分子伴侶功能［16］。

隨著研究的逐漸深入，分子伴侶的范圍也不再僅局限于蛋白質(zhì)，核糖體、RNA 乃至一些磷脂都被鑒定出具有分子伴侶的活性。核糖體被認(rèn)為是強(qiáng)大的伴侶，可幫助其上蛋白質(zhì)合成過程中多肽鏈的折疊［17］。DNA和RNA在體外都表現(xiàn)出強(qiáng)的伴侶活性，其抑制經(jīng)典的伴侶底物聚集的效率被報(bào)道比蛋白質(zhì)類分子伴侶GroEL 高300 倍［18］。RNA 在體外行使伴侶功能的研究實(shí)例表明，傳統(tǒng)伴侶以外的其他分子對于生物分子（包括核酸）的體內(nèi)折疊可能具有重要作用［19-20］。

在以大腸桿菌突變體為模型來改變膜磷脂的組成時，缺乏磷脂酰乙醇胺（PE）會導(dǎo)致多聚膜蛋白乳糖通透酶LacY的錯誤折疊，PE可與部分變性的蛋白質(zhì)在其重折疊時發(fā)生相互作用，表明磷脂可以作為非蛋白質(zhì)類分子伴侶起作用［21-22］。變性的大腸桿菌外膜蛋白OmpA只在脂多糖（LPS）存在的情況下發(fā)生重折疊［23-24］，大腸桿菌周質(zhì)蛋白DegP會依賴于特定的磷脂酰甘油（PG）發(fā)生構(gòu)象變化，來防止未折疊蛋白質(zhì)在低溫下的自聚集［25-26］。具有分子伴侶功能的脂分子被命名為脂伴侶（lipochaperone）［26］。

一些蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑（如甘油和其他多元醇）可通過增加蛋白質(zhì)的水化作用而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，從而提高蛋白質(zhì)折疊的效率，被稱為“化學(xué)分子伴侶”（chemical chaperones），它們作為小分子通常不直接與錯誤折疊的蛋白質(zhì)相結(jié)合，具有非特異性且在高濃度下發(fā)揮作用［27-28］?；瘜W(xué)分子伴侶一般可分為兩類：滲透劑和疏水化合物。真核生物體內(nèi)的滲透劑主要包括游離的氨基酸及氨基酸衍生物（例如甘氨酸、牛磺酸等）、多元醇（例如甘油、蔗糖等）和甲基胺（例如三甲基胺N-氧化物等）［27］。滲透劑通過結(jié)合水分子來增加蛋白質(zhì)折疊態(tài)的穩(wěn)定性［29］，已在體外和體內(nèi)被廣泛用于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的錯誤折疊與聚集的研究中，且具有一定的治療效果［30-31］。本課題組已有的研究結(jié)果表明，蔗糖可在擁擠環(huán)境中抑制人肌肌酸激酶于折疊過程中產(chǎn)生的聚集，促進(jìn)其正確折疊［32］，蔗糖也可在擁擠環(huán)境中提高肌酸激酶的穩(wěn)定性［33］。蔗糖或甘油的添加能夠有效抑制阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）相關(guān)的Tau 蛋白在稀溶液和大分子擁擠環(huán)境中的聚集［34］。毒性較低的疏水化合物也被作為治療劑進(jìn)行研究，例如4-苯基丁酸鈉（PBA）已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于尿素循環(huán)障礙的治療，PBA 可以作為口服補(bǔ)充劑使用且目前沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，但服用所需的高劑量問題仍待解決［27］。越來越多的研究表明，化學(xué)分子伴侶可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，糾正抑癌蛋白p53的錯誤折疊并恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，抑制蛋白質(zhì)和肽淀粉樣蛋白的形成并穩(wěn)定錯誤折疊的酶［28］。

一些蛋白水解酶的前導(dǎo)肽序列被稱為“分子內(nèi)分子伴侶”（intramolecular chaperone），這些前導(dǎo)肽對于水解酶的折疊和成熟是必需的，來自各種蛋白質(zhì)的大量前導(dǎo)肽已被鑒定為分子內(nèi)伴侶［35-36］。根據(jù)對蛋白質(zhì)折疊的作用，分子內(nèi)伴侶可分為兩類：I 型分子內(nèi)伴侶包括那些輔助蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成的分子伴侶，大多由N端序列延伸產(chǎn)生；II型分子內(nèi)伴侶不直接參與三級結(jié)構(gòu)的形成，但引導(dǎo)四級結(jié)構(gòu)的組裝，它們大多位于蛋白質(zhì)的C端。與普通的分子伴侶相比，這種分子內(nèi)分子伴侶具有高度的專一性［37］。

后來的研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶幫助的對象不局限于蛋白質(zhì)，分子伴侶也可幫助其他生物大分子進(jìn)行折疊。與DNA結(jié)合、幫助DNA分子進(jìn)行預(yù)折疊或預(yù)扭曲，從而把DNA 穩(wěn)定在一個適合與蛋白質(zhì)結(jié)合的特定構(gòu)象內(nèi)的蛋白質(zhì)，被稱為“DNA 分子伴侶”［38］。幫助RNA 分子折疊的蛋白質(zhì)被稱為“RNA分子伴侶”，這些蛋白質(zhì)與RNA結(jié)合后可以防止RNA 的錯誤折疊，或消除它們的錯誤折疊，從而促進(jìn)RNA的正確折疊［39］。

3 具有分子伴侶功能的抗體

分子伴侶行使伴侶功能的基礎(chǔ)是與靶蛋白的結(jié)合，而抗體通常對于抗原分子具有高度的親和力，締合常數(shù)在10-7~10-10mol/L范圍內(nèi)，因此天然具備了行使分子伴侶功能的可能。

早在1969 年就有研究發(fā)現(xiàn)，從用乙酰膽堿酯酶作為抗原免疫的動物中獲得的抗體在與熱失活的酯酶相互作用后，使其靶蛋白部分恢復(fù)了酶活性［40］，這提示可以利用抗體來誘導(dǎo)其靶蛋白的變性構(gòu)象向近似天然的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而使其復(fù)性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)，其中包括還原的S-蛋白（核糖核酸酶A 的片段）［41］、羧肽酶A［42］、辣根過氧化物酶［43-44］、螢火蟲熒光素酶［45］等在變性后，可以被其抗體誘導(dǎo)，發(fā)生重折疊。一些抗體被發(fā)現(xiàn)可以抑制靶蛋白的折疊，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶和肌酸激酶的部分單克隆抗體可以抑制它們在復(fù)性過程中的折疊［46-47］?？贵w對于蛋白質(zhì)折疊的影響依賴于其表位特性和蛋白質(zhì)特定的折疊途徑，并沒有通用的機(jī)制。目前主要有三種假設(shè)的機(jī)制：a. 抗體穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，使其靶蛋白的去折疊構(gòu)象和天然構(gòu)象之間的平衡向天然構(gòu)象方向移動；b. 抗體通過屏蔽疏水表面來抑制靶蛋白折疊中間體的聚集；c. 抗體通過穩(wěn)定過渡態(tài)結(jié)構(gòu)降低折疊的活化屏障［48］。這些機(jī)制的確定需要根據(jù)具體情況來分析。

一些抗體在促進(jìn)其靶蛋白正確折疊的同時還可以防止其聚集現(xiàn)象的發(fā)生［49-50］。值得注意的是，具有分子伴侶功能的抗體對于底物通常具有嚴(yán)格的特異性，而這恰恰與天然的分子伴侶相反，這使其在蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的治療中具有更大的應(yīng)用潛力。錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)是神經(jīng)退行性疾病治療中的重要靶點(diǎn)，已有不少抗體被研發(fā)出來作為分子伴侶與錯誤折疊的蛋白質(zhì)單體、寡聚體或聚集體相結(jié)合，有效緩解了相關(guān)疾病的發(fā)病進(jìn)程（將在下文中進(jìn)行詳細(xì)敘述）。這其中針對全長抗體的大量研究表明，大尺寸的抗體不利于對血腦屏障的穿越及向組織的滲透，且容易被人體免疫系統(tǒng)所識別清除［51］。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，許多重組抗體的片段被開發(fā)出來，其中最受青睞的是單鏈抗體。

4 具有分子伴侶功能的單鏈抗體

4.1 單鏈抗體

單 鏈 抗 體（single-chain fragment variable，scFv）是具有抗體活性的最小結(jié)構(gòu)功能單位，由抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過一段柔性肽（linker）連接而成。單鏈抗體的主要優(yōu)點(diǎn)在于分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、特異性高等，與完整抗體及相關(guān)Fab片段相比，scFv能更好地穿透血腦屏障和滲透更大的實(shí)體腫瘤，scFv 的快速分布可加速其與靶位點(diǎn)的結(jié)合，且因缺少抗體的恒定區(qū)而減少了與其他非靶位點(diǎn)的結(jié)合，具有更小的免疫原性［52］。此外，由于scFv 不需要糖基化，它們可以在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，從而可以進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)［53］。近10年來，單鏈抗體已經(jīng)成為被動免疫療法的一種重要選擇［54］，其在靶向治療、影像診斷、細(xì)胞免疫、生物檢測方面都有著重要應(yīng)用［52］。

4.2 單鏈抗體的篩選方法

scFv可以根據(jù)其結(jié)合抗原的特異性從特定的文庫中篩選出來，然后在多種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。噬菌體展示文庫和核糖體展示文庫是目前常用的文庫，但每種文庫都有其局限性，可依據(jù)篩選所需要的抗原性質(zhì)和預(yù)期抗體的親和力及數(shù)量來選擇不同的文庫。

噬菌體展示技術(shù)是用來篩選scFv 最常用的方法，根據(jù)抗體基因的來源，展示文庫可分為免疫、天然、合成三種。免疫庫（immune libraries）由不同種類的動物或人類的B淋巴細(xì)胞抗體基因構(gòu)建而成，可以產(chǎn)生具有高親和力和特異性的抗體，富集的抗體偏向于用于預(yù)防接種的抗原，其缺點(diǎn)是需要為每種新的抗原構(gòu)建新的抗體庫；天然庫（native libraries）不偏向于任何抗原，單個庫的容量若足夠大且多樣化便可以用于所有抗原，其主要缺點(diǎn)是必須克隆更大的文庫；合成庫（synthetic libraries）又稱隨機(jī)肽庫（random peptide libraries），是將種系基因序列與負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的隨機(jī)互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining regions ，CDRs）基因序列融合在一起，在噬菌體表面表達(dá)出具有隨機(jī)序列的短肽，已被廣泛用于生產(chǎn)高親和力的單克隆抗體、鑒定線性抗原表位或具有各種結(jié)合能力的其他分子［54-56］。噬菌體展示技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢在于實(shí)驗(yàn)表型（展示的蛋白質(zhì)）與其封裝的基因型（編碼蛋白質(zhì)的DNA）之間存在直接聯(lián)系［57］。

核糖體展示技術(shù)也在逐漸成熟，因其是一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，克服了基于細(xì)胞方法的局限性，可以創(chuàng)建更大的文庫并避免表達(dá)偏差［57-58］。核糖體展示技術(shù)在對一些具有聚集傾向的蛋白質(zhì)篩選方面表現(xiàn)不佳，分泌蛋白也通常通過噬菌體展示技術(shù)來篩選。但也存在將兩種技術(shù)合并的替代方法，例如在核糖體展示技術(shù)中從天然庫或合成庫中選擇，這種方法可以在幾天內(nèi)用無細(xì)胞系統(tǒng)模擬抗體的生成和親和力成熟過程，獲得了比大多數(shù)天然抗體具有更高親和力的分子［59-60］。

除此之外，微生物細(xì)胞展示技術(shù)也被用于scFv的篩選中，該系統(tǒng)的展示水平為每個細(xì)胞3×104個scFv，并且通過熒光激活細(xì)胞分選（fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS）技術(shù)可以快速、定量地篩選及富集特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。與噬菌體和核糖體展示技術(shù)相比，F(xiàn)ACS 消除了洗脫回收后緊密結(jié)合的克隆的不確定性，并消除了噬菌體展示中可能發(fā)生的非特異性結(jié)合［57］。酵母、大腸桿菌及蘇云金芽孢桿菌孢子展示技術(shù)已被用于構(gòu)建scFv 文庫［61-63］，其中酵母展示系統(tǒng)應(yīng)用得較為廣泛［57］。

4.3 具有伴侶功能的單鏈抗體的篩選與應(yīng)用

重組的單鏈抗體已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)及治療診斷領(lǐng)域，而具有分子伴侶功能的單鏈抗體可以幫助靶蛋白進(jìn)行正確折疊，這使其在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)純化及蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的藥物開發(fā)等方面具有較好的應(yīng)用前景。

本課題組利用一個大容量的人源噬菌體單鏈抗體庫，以人肌肌酸激酶為靶蛋白，篩選出一株具有雙重伴侶功能的單鏈抗體（scFv A4），該抗體能顯著抑制肌酸激酶在折疊過程中的聚集，并促進(jìn)肌酸激酶天然構(gòu)象的恢復(fù)，該抗體同時能抑制天然肌酸激酶在熱變性過程中的失活與聚集，可視為針對肌酸激酶的專一性分子伴侶［64］。我們采用計(jì)算機(jī)模擬方法構(gòu)建了scFv A4 與肌酸激酶的復(fù)合物模型，探索了肌酸激酶可被scFv A4識別的表位和scFv A4的作用機(jī)制［65］。在上述工作的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用固相多肽膜篩選技術(shù)、表面等離子體共振技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，獲得了可與scFv A4 特異結(jié)合的肌酸激酶多肽片段，這些多肽片段作為競爭者，可促使肌酸激酶-scFv A4復(fù)合物解離，釋放肌酸激酶，成功實(shí)現(xiàn)肌酸激酶的高效折疊與復(fù)性。分子機(jī)制研究表明，scFv A4 與篩選出的多肽可組成一套完整的伴侶體系，先加入的scFv A4 負(fù)責(zé)結(jié)合靶蛋白的折疊中間體，阻止其聚集，后加入的多肽促進(jìn)靶蛋白的釋放與復(fù)性（圖1）。這種單鏈抗體-多肽體系是一種全新的分子伴侶體系，其最大的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng)，只幫助其靶蛋白進(jìn)行折疊［66］。應(yīng)用該伴侶體系，結(jié)合親和層析技術(shù)，我們設(shè)計(jì)了一套柱上復(fù)性的體系，用于幫助人肌肌酸激酶包涵體的純化與制備，取得了較好的成效［67］。

Fig. 1 Construction and mechanism of scFv A4-peptide chaperone system圖1 scFv A4-多肽伴侶體系的構(gòu)建與作用機(jī)制

5 抑制蛋白質(zhì)聚集的抗體的伴侶功能

基于廣義的分子伴侶概念來說，能夠抑制折疊病相關(guān)蛋白質(zhì)聚集的抗體等生物分子也可以視為具有伴侶功能。錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病中的關(guān)鍵事件，這些疾病也被稱為折疊病，比如帕金森?。≒arkinson's disease，PD）被發(fā)現(xiàn)與α突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的異常聚集有密切關(guān)聯(lián)［68］，AD 則 與β淀粉樣肽（amyloid β，Aβ）和Tau 蛋白的聚集關(guān)系緊密［69］，肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）與Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）、TAR DNA 結(jié)合蛋白43（TDP-43）等蛋白質(zhì)的聚集密切相關(guān)［70-71］。異常聚集形成的淀粉樣蛋白最開始是由富含天然α螺旋的可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓虏⌒驭?折疊的蛋白質(zhì)，通過成核和生長形成寡聚體、原纖維纏結(jié)等，最后形成淀粉樣纖維聚集體。寡聚體和原纖維是導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的毒性物質(zhì)，目前折疊病的治療目標(biāo)主要針對于蛋白質(zhì)單體、寡聚體和原纖維［72］。針對上述蛋白質(zhì)篩選出的抗體研究進(jìn)展如下所述。

5.1 α突觸核蛋白

PD 是僅次于AD 的常見神經(jīng)退行性疾病，目前暫無有效的治療方法［73］。α-syn 的聚集體是PD病理相關(guān)的路易體和路易神經(jīng)突的主要成分，可溶性的α-syn 錯誤折疊并聚集成寡聚體，繼而形成淀粉樣原纖維，最后形成路易體。寡聚體形式是目前認(rèn)為具有較強(qiáng)毒性的狀態(tài)［74］，寡聚體已被證實(shí)可以通過多種方式產(chǎn)生細(xì)胞毒性，包括導(dǎo)致線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、蛋白質(zhì)平衡喪失、突觸障礙、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥［75］。

之前針對α-syn 的研究主要集中在篩選能夠抑制其單體聚集的抗體方面，在體外通過噬菌體展示或酵母表面展示技術(shù)篩選出與人重組單體α-syn 具有高親和力的scFv D10、NAC32 等單鏈抗體，其與α-syn在哺乳動物細(xì)胞中的共表達(dá)可穩(wěn)定α-syn單體，防止其聚集并改善了α-syn 過表達(dá)引起的細(xì)胞毒性［76-77］。

隨著寡聚體的毒性被證實(shí)，以寡聚體為治療目標(biāo)的研究逐漸增多。Emadi 等［78］利用噬菌體展示技術(shù)和原子力顯微鏡（AFM）等技術(shù)分離出了與α-syn的寡聚形式特異性結(jié)合的scFv D5，其可以有效抑制α-syn 的聚集并阻斷聚集的α-syn 的細(xì)胞毒性。更多靶向α-syn 寡聚體的特異性單克隆抗體被研發(fā)，它們不識別線性表位，只識別具有特定構(gòu)象的寡聚α-syn［79］。一種單鏈抗體scFv W20 被發(fā)現(xiàn)可以識別Aβ、α-syn、淀粉樣蛋白、朊病毒蛋白等蛋白質(zhì)組裝而成的各種寡聚體，抑制寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，同時改善AD、PD和亨廷頓病小鼠模型的運(yùn)動和認(rèn)知功能，并通過減少相應(yīng)蛋白質(zhì)的聚集負(fù)荷和防止突觸變性來減弱許多神經(jīng)病理學(xué)特征［80-82］。特異性識別α-syn 原纖維和寡聚體的scFv-pF 和scFv-pC 可以抑制胞內(nèi)α-syn 種子的毒性傳播并阻斷α-syn的聚集［83］。

5.2 β淀粉樣肽（Aβ）

AD 作為最常見的神經(jīng)退行性疾病，主要的病理特征為胞外的Aβ 沉積形成的斑塊和胞內(nèi)Tau 蛋白過度磷酸化后形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。被動免疫療法是目前治療AD 的研究中常用的方法。針對Aβ開發(fā)的抗體依據(jù)識別的抗原表位的位置可分為4類：a. 靶向Aβ N 端區(qū)域（氨基酸1~16）的抗體，其可以識別Aβ 形成過程中所有的結(jié)構(gòu)形式，如單體、寡聚體、原纖維、淀粉樣蛋白等；b. 靶向Aβ中間區(qū)域（氨基酸17~32）的抗體，只識別Aβ 單體；c. 靶向Aβ C 端區(qū)域（氨基酸33~42）的抗體，其可以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及在外周發(fā)揮作用，促進(jìn)Aβ 的清除；d. 靶向構(gòu)象表位（寡聚物與原纖維）的抗體［84-85］。

早期使用的常規(guī)單克隆抗體證實(shí)了免疫療法的潛力，但也有很大的局限性，比如穿過血腦屏障的滲透性低，在鼠和人類中引起了一系列不良反應(yīng)，包括腦膜炎、血管源性水腫、腦微出血等，而重組抗體因其結(jié)構(gòu)的獨(dú)特優(yōu)勢使其在AD模型鼠和靈長類動物的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好［84］。靶向Aβ不同表位的scFv單鏈抗體在各種AD小鼠模型中都表現(xiàn)出了治療功能，F(xiàn)ukuchi 等［86］將抗Aβ 的scFv59 基因利用腺相關(guān)病毒（AAV）載入小鼠皮質(zhì)海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)scFv59可以在海馬神經(jīng)元中長期穩(wěn)定表達(dá)并抑制了Aβ的沉積。

ScFv因其較短的半衰期，具有較高的安全性，但同時也影響了治療劑量，目前大部分scFv 都是通過AAV 載體注射進(jìn)小鼠腦區(qū)。Ryan 等［87］用識別Aβ 單體和寡聚體的Aβ-scFv 改善了3×Tg-AD 小鼠的認(rèn)知障礙，Levites 等［88］將scFv9、scFv40.1、scFv42.2 通過AAV 注射進(jìn)新生小鼠P0 腦中，實(shí)現(xiàn)了永久穩(wěn)定的表達(dá)，減少了Aβ 的沉積，且無毒副作用。Roda 等［89］證實(shí)了scFv-h3D6 不僅可以減少3×Tg-AD 小鼠腦中的淀粉樣斑塊，還可以降低腦中病理Tau蛋白的水平。盡管AAV遞送的方法在小鼠模型中取得了不錯的成果，但在人類治療中往往需要侵入性較小的給藥途徑，Wang等［90］采用肌內(nèi)注射方式給藥scFv 到APPSwe/PS1dE9 轉(zhuǎn)基因小鼠中，結(jié)果表明，scFv 顯著減弱了Aβ 斑塊的形成積累、AD病理和認(rèn)知障礙，并且發(fā)現(xiàn)，動物對肌內(nèi)注射有良好的耐受性，不會在表達(dá)位點(diǎn)及腦中引起炎癥或微出血。

5.3 Tau蛋白

病理性Tau蛋白的聚集體是幾種神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分，這類神經(jīng)退行性疾病統(tǒng)稱為Tau蛋白病。根據(jù)AD的病理特征，Tau蛋白也是AD治療的一個重要靶標(biāo)，在目前的scFv被動免疫研究中主要靶向的是總Tau 蛋白、磷酸化Tau 蛋白（pTau）和Tau 寡聚體。已有不少研究在疾病相關(guān)的動物模型中取得了不錯的進(jìn)展，Yanamandra 等［91］先是開發(fā)出了可以有效阻斷Tau蛋白種子傳播活性的、并能改善模型小鼠認(rèn)知障礙的抗Tau 抗體HJ8.5，隨后Ising 等［92］基于HJ8.5 篩選出了兩種抗Tau scFv（SC1和SC3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種scFv均可以顯著降低P301S-tg小鼠病理性的Tau蛋白水平。Krishnaswamy等［93］則證明了可以使用人類Tau 蛋白病R406W 突變的轉(zhuǎn)基因果蠅來表征抗Tau scFv 的治療效果，scFv235 的表達(dá)可以延長R406W 模型果蠅的壽命，并有效阻止了病蠅翅膀和腹部表型的病情發(fā)展，同時減少了果蠅模型中病理性Tau蛋白的表達(dá)水平。

Tau 蛋白根據(jù)其包含的重復(fù)序列數(shù)目可分為3RTau 和4RTau 兩類［94］。它們在Tau 蛋白疾病中差異表達(dá)，其中AD 與額顳葉癡呆?。‵TDP-17T）患者腦內(nèi)均有3RTau和4RTau的積累。目前大部分研究圍繞4RTau 展開，但Spencer 等［95］表明靶向3RTau的scFv也有不錯的治療效果，他們通過構(gòu)建具有腦穿透序列（apoB）的重組3RTau scFv 慢病毒載體來實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)遞送，發(fā)現(xiàn)3RT-apoB scFv 可以滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并有效減弱了3RTau tg模型小鼠中3RTau的積累和神經(jīng)變性的發(fā)生，這在治療富含3RTau的神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏟ick?。┓矫婢哂幸欢ǖ臐撛趹?yīng)用價值。

除了研發(fā)靶向Tau蛋白的抗體以外，以寡聚體和pTau 蛋白為靶點(diǎn)的研究也在不斷發(fā)展。Venkataraman 等［96］篩選出了只識別Tau 寡聚體的三種scFv（F9T、D11C與H2A），并驗(yàn)證了它們可以將AD 小鼠和AD 患者腦組織與正常小鼠和人類腦組織區(qū)分開。Abskharon 等［97］則報(bào)告了一種能夠特異性識別Tau 寡聚體的M204-scFv，其可以有效抑制AD 患者腦提取物中的Tau 蛋白聚集，同時他們還表明該scFv 本身可分為抑制播種的單體、二聚體、三聚體形式，X射線晶體結(jié)構(gòu)暗示了二聚體和三聚體可能具有更好的結(jié)合和抑制Tau寡聚體的能力。Zhang 等［98］獲得一種靶向pTau 蛋白的scFv，并證實(shí)通過AAV 遞送到小鼠腦中可以穩(wěn)定表達(dá)至少22周。

本課題組以pTau 蛋白為靶蛋白，利用大容量的人源噬菌體抗體庫，篩選得到了一種scFv 單鏈抗體，該抗體能特異性地抑制pTau 蛋白的聚集，促進(jìn)pTau 蛋白聚集體的解聚，并且能夠降低pTau蛋白聚集體的細(xì)胞毒性，當(dāng)其在AD模型果蠅眼睛中特異性地表達(dá)后，可以緩解hTauR406W導(dǎo)致的毒性，具有很好的用于治療AD 的潛在應(yīng)用價值（圖2），目前正進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，并利用多種細(xì)胞模型和AD 模型小鼠驗(yàn)證其功能與活性［99］。

Fig. 2 Screening and application of scFv T1 inhibiting aggregation of pTau protein圖2 抑制pTau蛋白聚集的單鏈抗體scFv T1的篩選與應(yīng)用

在抗體的遞送方式上也有不同的選擇，Vitale等［100］先是選用了AAV 將scFv-MC1 遞送至成年JNPL3 小鼠海馬中，scFv-MC1 在皮質(zhì)、海馬和后腦都顯著減少了可溶性、寡聚和不溶性Tau蛋白的表達(dá)水平。為了優(yōu)化遞送方法，他們進(jìn)一步選用肌內(nèi)注射這種外周給藥方式，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)注射AAV1-scFv-MC1 可以持久產(chǎn)生抗Tau 的scFv-MC1，并顯著減少了大腦中的可溶性和不溶性Tau的水平，這為治療AD以及其他神經(jīng)退行性疾病提供了新的思路［101］。除此之外，Guell-Bosch 等［102］使用先前所述的scFv-h3D6對3xTg-AD小鼠進(jìn)行每月腹腔給藥治療，在治療期間他們采取了磁共振成像和光譜學(xué)（MRI/MRS）的手段來跨時間段監(jiān)測小鼠的病情發(fā)展，這種非侵入性的方式為量化抗體的治療效果提供了新的方法。最近的研究還顯示了一項(xiàng)基于雙特異性串聯(lián)scFv（TaFv）的AD 療法，Qian 等［103］利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了可以同時靶向Aβ 和p-Tau 的TaFv，證實(shí)其可以與AD 小鼠模型腦切片中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)元纏結(jié)相結(jié)合。但大多數(shù)免疫療法對于清除胞質(zhì)中的病理性Tau蛋白具有一定的局限性。最近，也有研究選用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體以期望更好地清除胞內(nèi)Tau 蛋白的病理形式。Gallardo 等［104］基于抗Tau scFv 開發(fā)了一種融合突變泛素的抗Tau 嵌合胞內(nèi)抗體（intrabodies，iBs），發(fā)現(xiàn)iBs與突變泛素的融合可以增強(qiáng)蛋白酶體的靶向作用，經(jīng)AAV 遞送后可以顯著降低P301S 轉(zhuǎn)基因小鼠特定海馬亞區(qū)病理性Tau 的表達(dá)水平。隨后，Goodwin 等［105］對scFv 和iBs 進(jìn)行了功效的比較，他們利用pTau蛋白和總Tau蛋白的特異性抗體生成特定的scFv 和iBs，結(jié)果顯示pTau 特異性iBs和scFv的表達(dá)均可預(yù)防JNPL3小鼠中Tau病理的發(fā)生并延緩后肢癱瘓的進(jìn)程，但在rTg4510模型鼠中只有pTau 特異性iBs 有效減弱了病理Tau 蛋白的積累。顯然這些研究提供了一種新型的免疫治療方法，未來有必要進(jìn)行更多的研究來優(yōu)化靶向Tau蛋白的重組抗體片段和遞送載體。

5.4 針對其他蛋白質(zhì)的抗體

ALS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基礎(chǔ)也是蛋白質(zhì)的錯誤折疊與聚集，突變的超氧化物歧化酶1（SOD1）和TDP-43 分別是家族性和散發(fā)性ALS 的主要致病蛋白質(zhì)。單克隆抗體D3H5 和D3-1 都是突變蛋白SOD1G93A的特異性抗體，研究發(fā)現(xiàn)，它們的重組scFv抗體具有更好的治療效果，Patel等［106］通過單次鞘內(nèi)注射重組AAV-scFvD3H5 至SOD1G93A小鼠中，發(fā)現(xiàn)scFv D3H5 有效延遲了疾病發(fā)作的時間，并減緩了神經(jīng)膠質(zhì)的增生和運(yùn)動神經(jīng)元的衰減。最近，Minamiyama 等［107］利用了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）作為scFv D3-1 的藥物遞送載體，發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)單次注射表達(dá)scFvD3-1的OPCs可顯著延遲SOD1H46RALS大鼠模型的疾病發(fā)作并延長壽命，這意味著使用OPCs作為治療性抗體的遞送載體是治療ALS 的一種新選擇。

針對ALS 的另一種關(guān)鍵蛋白TDP-43 錯誤定位或錯誤折疊的分子表位E246 和D247，Tamaki等［108］開發(fā)出了TDP-43 錯誤折疊特異性單克隆抗體3B12A，隨后證實(shí)了3B12A scFv 具有雙重蛋白質(zhì)水解信號，可以加速TDP-43 聚集體的降解，并通過子宮內(nèi)電穿孔的遞送方式進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)3B12A scFv可以減少胚胎小鼠大腦中的TDO-43聚集體，且沒有出現(xiàn)異常的產(chǎn)后腦部病理和發(fā)育異常。

朊蛋白相關(guān)折疊病的標(biāo)志是正常細(xì)胞表達(dá)的朊蛋白PrPC轉(zhuǎn)化成了病理性構(gòu)象PrPSc，多項(xiàng)研究使用scFv 靶向PrPSc，抑制其聚集并降低了PrPSc的相關(guān)毒性［72］。Filesil 等［109］用PC12 細(xì)胞表達(dá)抗朊病毒的8H4-scFv，發(fā)現(xiàn)其可以抑制細(xì)胞中PrPSc的積累。Fujita 等［110］建立了穩(wěn)定表達(dá)抗-PrP 3S9 scFv的Ra2小膠質(zhì)細(xì)胞系，將其注射到小鼠腦區(qū)，發(fā)現(xiàn)其顯著延長了小鼠的壽命，且未觀察到自身免疫反應(yīng)。這些結(jié)果同時也展現(xiàn)了真核細(xì)胞作為scFv 遞送途徑的治療潛力。

目前針對各種折疊病相關(guān)靶蛋白抗體的篩選和研究正在積極進(jìn)行，相信在這一領(lǐng)域，將會出現(xiàn)具有重要應(yīng)用價值的治療性生物藥物，對具有伴侶功能的抗體的研究也將產(chǎn)生重要的理論研究和應(yīng)用價值。