脫腺苷酸酶與RNA代謝調(diào)控*

廖小燕 閆永彬

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

真核基因轉(zhuǎn)錄后的直接產(chǎn)物是核內(nèi)不均一RNA （heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），需要經(jīng)過(guò)一系列的加工和修飾后才能成熟和發(fā)揮功能［1］。成熟真核mRNA的5'端通常存在7-甲基鳥(niǎo)嘌呤帽子結(jié)構(gòu)（cap），而3'端存在長(zhǎng)度不等的多聚腺苷酸（poly（A））尾結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物mRNA 的poly（A）尾平均長(zhǎng)度約為200 nt［2］，酵母中約70 nt［3］。poly（A）尾的長(zhǎng)度是由聚腺苷酸化和脫腺苷酸化共同調(diào)節(jié)，影響著真核生物mRNA 的轉(zhuǎn)錄、質(zhì)量控制、運(yùn)輸、翻譯、沉默和降解等過(guò)程［4-6］。非編碼RNA的生物合成途徑中也常常伴隨著3'末端寡聚腺苷酸的修飾加工。脫腺苷酸酶（EC 3.1.13.4）屬于3'-5'核酸外切酶，特異性地催化RNA 3'端poly（A）或oligo（A）的水解。絕大多數(shù)真核mRNA 的降解途徑依賴于脫腺苷酸化，脫腺苷酸酶作為mRNA 穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子，在細(xì)胞的RNA穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用。

到目前為止，人們已經(jīng)鑒定出了十幾種不同的脫腺苷酸酶。其中，CCR4、CAF1、PAN2 和ANGEL 等普遍存在于絕大多數(shù)真核生物中，而PARN、PNLDC1、Nocturnin 以及PDE12 等主要存在于高等生物中［7-14］。根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的特征，已知的脫腺苷酸酶屬于DEDD/類DnaQ（CDD ID：cl10012）和EEP（CDD ID：cl00490）兩個(gè)超家族。除了高等生物中的CAF1，其他幾乎所有已知的脫腺苷酸酶都包含一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域。值得一提的是，釀酒酵母以及一些低等生物中，CAF1 的兩種同工酶（CAF1a 和CAF1b/POP2）在N 端也具有富含Q/N 的固有無(wú)序區(qū)域。非催化結(jié)構(gòu)域可能具有兩個(gè)潛在的功能：一是參與調(diào)控核酸酶結(jié)構(gòu)域的催化特性；二是介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用從而調(diào)控脫腺苷酸酶的生理功能。在細(xì)胞中，PARN和PNLDC1等脫腺苷酸酶以同源寡聚體的形式存在，PAN2 與調(diào)控亞基PAN3 形成PAN2-PAN3 復(fù)合體才能發(fā)揮催化功能，而CCR4和CAF1通常與多個(gè)NOT蛋白形成大的CCR4-NOT復(fù)合體。不同物種中，CCR4-NOT 復(fù)合體NOT 蛋白（哺乳動(dòng)物中的同源物為CNOT蛋白）的種類和數(shù)量也存在多樣性。細(xì)胞中執(zhí)行同一催化功能的多種脫腺苷酸酶同時(shí)存在，暗示細(xì)胞需要對(duì)脫腺苷酸酶的活性進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，從而維持細(xì)胞內(nèi)RNA 的穩(wěn)態(tài)。非催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)亞基的存在也暗示脫腺苷酸酶可能具有復(fù)雜的分子調(diào)控。脫腺苷酸酶的種類、結(jié)構(gòu)、催化特性、生化性質(zhì)以及生理功能已經(jīng)被詳盡總結(jié)［15-16］，本文將主要介紹脫腺苷酸酶的分子調(diào)控、生化功能和生理、病理意義。

1 脫腺苷酸酶的酶學(xué)特征

1.1 酶學(xué)性質(zhì)與催化特點(diǎn)

脫腺苷酸酶的發(fā)現(xiàn)和命名來(lái)源于其對(duì)poly（A）的高度底物偏好性［17-19］，但一些脫腺苷酸酶也被發(fā)現(xiàn)能較低效地降解非poly（A）底物。研究發(fā)現(xiàn)，人CAF1的兩種同工酶具有不同的底物選擇性：CAF1a/CNOT7 高度特異催化poly（A）降解，而CAF1b/CNOT8對(duì)于低濃度的其他三種多聚核苷酸也具有水解的能力［20］。酵母Ngl2p（ANGEL 同源物）參與完成5.8S rRNA 3'加工的最后一步，而Ngl3p也可以降解poly（U）、poly（C）和poly（dA）［21］。人PARN 也具有降解poly（U）和poly （dA） 的能力，盡管其活性比降解poly（A）低很多［22-23］。同時(shí)，人PARN 也可能在體內(nèi)脫尿基化過(guò)程中發(fā)揮潛在作用［22］。值得注意的是，這些脫腺苷酸酶的非poly（A）降解特性大多是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)確定的，其潛在的生理相關(guān)性尚未被表征。

與其他DEDD 和EEP 核酸酶類似，目前鑒定的所有脫腺苷酸酶都采用雙金屬離子催化方式（two-metal ion catalysis），其活性均依賴于生理濃度的Mg2+離子。結(jié)合在活性中心的兩個(gè)Mg2+離子不僅對(duì)脫腺苷酸酶的催化機(jī)制至關(guān)重要，而且還可以調(diào)節(jié)酶的穩(wěn)定性以及核酸酶結(jié)構(gòu)域與非催化結(jié)構(gòu)域之間的相互作用［24-26］。除了Mg2+之外，部分脫腺苷酸酶的活性和底物選擇性也受其他二價(jià)金屬離子如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+和Zn2+調(diào)節(jié)［26-28］，然而目前還不清楚這些二價(jià)金屬離子是否在體內(nèi)起調(diào)節(jié)作用。氨基糖苷類和嘧啶核苷酸類化合物可以與活性中心的鎂離子競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制PARN 的酶活性［29-30］。

不同脫腺苷酸化酶的催化效率具有較大差別。人PARN具有高效的脫腺苷酸化酶活性，比酵母或人源的CAF1 活性高2~3 個(gè)數(shù)量級(jí)［27，31］。PARN 的極高活性可能來(lái)源于其高度持續(xù)性催化方式（processivity），即酶能夠持續(xù)結(jié)合同一條poly（A）并連續(xù)催化末端腺苷酸的水解［32-33］。脫腺苷酸化酶的底物親和力還受到poly （A） 長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)。PARN 對(duì)長(zhǎng)poly（A）底物表現(xiàn)出較高的親和力，但當(dāng)poly（A）長(zhǎng)度小于6 nt 時(shí)，親和力急劇下降［22］。PAN2-PAN3復(fù)合體在酵母中將mRNA 的poly（A）尾巴降解至60~80 nt、在哺乳動(dòng)物中降解至110 nt 左右［8］，其后中短長(zhǎng)度的poly（A）尾巴由CCR4-NOT 復(fù)合體繼續(xù)降解，而CCR4-NOT復(fù)合體對(duì)最后兩個(gè)腺苷酸的降解效率大大降低［34］。

真核細(xì)胞中，現(xiàn)有研究結(jié)果表明不同脫腺苷酸酶可能只降解轉(zhuǎn)錄組中的一個(gè)RNA 子集，但脫腺苷酸酶選擇底物mRNA 的分子機(jī)制還沒(méi)有完全研究清楚。一般認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)中的主要脫腺苷酸酶活性來(lái)自于PAN2-PAN3 復(fù)合體和CCR4-NOT 復(fù)合體，而PARN等酶的活性受到高度調(diào)控。最近的代謝RNA標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，酵母PAN2-PAN3復(fù)合體和CCR4-NOT 復(fù)合體不僅具有不同的poly（A）長(zhǎng)度偏好，而且具有不同的底物偏好，兩種復(fù)合體損傷所引起的mRNA 降解表型也不相同［35］。對(duì)不同脫腺苷酸酶的敲低或敲除實(shí)驗(yàn)也顯示出不同的細(xì)胞或動(dòng)物表型。這些結(jié)果暗示，在細(xì)胞或體內(nèi)脫腺苷酸酶可能具有非常復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，提出了真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)特異mRNA 子集脫腺苷酸化的一個(gè)可能機(jī)制：各種各樣的RNA 結(jié)合蛋白（RBP）作為底物選擇性的中心分子，招募含有特定順式作用元件的mRNAs，并通過(guò)與脫腺苷酸酶的非催化結(jié)構(gòu)域或調(diào)節(jié)亞基的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)含有特定順式作用元件mRNA 子集的特異性降解［15-16］。

1.2 酶活性的調(diào)控

作為細(xì)胞內(nèi)mRNA 穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子，脫腺苷酸酶的活性應(yīng)受到嚴(yán)格調(diào)控。同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化，細(xì)胞為了適應(yīng)新的生存環(huán)境迅速轉(zhuǎn)換基因表達(dá)譜時(shí)，也需要對(duì)脫腺苷酸酶的活性和靶標(biāo)RNA子集進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。到目前為止，體外、細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了脫腺苷酸酶的多種調(diào)控因子。

1.2.1小分子化合物

早期的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，cap 及其類似物和鉀離子等一價(jià)陽(yáng)離子可以別構(gòu)調(diào)節(jié)PARN 的活性［32，36-38］。PARN含有3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（核酸酶結(jié)構(gòu)域、RRM 和R3H）以及一個(gè)C 端固有無(wú)序結(jié)構(gòu)域。與一般的cap結(jié)合蛋白不同，PARN的cap結(jié)合位點(diǎn)位于RRM 表面的非底物結(jié)合區(qū)域［36，39-42］，與cap對(duì)PARN的別構(gòu)調(diào)節(jié)功能一致。

脫腺苷酸酶的小分子抑制劑一般結(jié)合在核酸酶結(jié)構(gòu)域的活性中心附近，通過(guò)與底物或Mg2+競(jìng)爭(zhēng)來(lái)影響活性。研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類和天然核苷酸可以抑制PARN的酶活性。例如，氨基糖苷類新霉素B是一種Mg2+依賴性的脫腺苷酸酶廣譜抑制劑［43］。基于腺苷和胞嘧啶的葡萄糖吡喃糖核苷類似物也可抑制PARN活性，而含有尿嘧啶、5'-氟嘧啶或胸腺嘧啶的葡萄糖吡喃糖核苷類似物是更強(qiáng)的抑制劑［44］。目前關(guān)于CCR4-NOT 脫腺苷酸酶的抑制劑研究相對(duì)較少。早期研究發(fā)現(xiàn)，單核苷酸和RNA底物可以在不同程度上抑制酵母CCR4的活性［45］，最近篩選鑒定的幾種人CAF1a/CNOT7的化學(xué)小分子抑制劑也可以不同程度抑制CCR4b/CNOT6L 和PARN［46-47］。人CCR4b/CNOT6L 和CAF1a/CNOT7脫腺苷酸酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)表明，核苷酸是比氨基糖苷類更有效的抑制劑［48］。天然核苷酸或其代謝中間產(chǎn)物可以作為脫腺苷酸酶的抑制劑，暗示RNA 的生物合成途徑和降解途徑之間存在著交互調(diào)控，但其在體內(nèi)的生理意義還有待進(jìn)一步研究。

1.2.2非催化結(jié)構(gòu)域

如前所述，絕大多數(shù)脫腺苷酸酶都含有至少一個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，然而對(duì)大多數(shù)脫腺苷酸酶的非催化結(jié)構(gòu)域的功能都知之甚少。除了介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用以外，PARN的R3H、RRM和C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑ARN的酶活性、催化方式、寡聚體組裝、穩(wěn)定性和細(xì)胞定位都起著重要的調(diào)節(jié)作用［36，39-42，49-56］。酵母CCR4 和CAF1 的固有無(wú)序區(qū)域可能參與介導(dǎo)了其在P 小體的定位［57］。由于非催化結(jié)構(gòu)域通常具有潛在的酶學(xué)特性調(diào)節(jié)功能，深入探索這些結(jié)構(gòu)域的功能可能有助于更好理解脫腺苷酸酶多樣化的分子調(diào)控機(jī)制。

1.2.3翻譯后修飾

PARN 是翻譯后修飾最多的一種脫腺苷酸酶，但其他脫腺苷酸酶的翻譯后修飾似乎很罕見(jiàn)。PARN的翻譯后修飾主要包括蛋白質(zhì)水解、磷酸化和乙酰化。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞和小牛胸腺提取物中，分別鑒定出了缺少核定位信號(hào)序列和C端結(jié)構(gòu)域的62 ku 和54 ku 蛋白質(zhì)水解片段［32，58］，PARN的蛋白質(zhì)水解可能主要影響其細(xì)胞核定位和C端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互作用。在應(yīng)激、發(fā)育或病理?xiàng)l件下，人PARN存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)［59-61］。血清饑餓誘導(dǎo)PARN 的過(guò)度磷酸化能增強(qiáng)PARN 的cap結(jié)合能力和持續(xù)性催化方式［62］。急性白血病中PARN的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)都發(fā)生了改變，但其病理功能尚不清楚［61］。細(xì)胞中的機(jī)制研究表明，MK2 介導(dǎo)的Ser557 磷酸化通過(guò)調(diào)節(jié)PARN 的細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)相互作用來(lái)促使PARN 參與DNA 損傷應(yīng)答等細(xì)胞過(guò)程［31，50，63］。此外，最近發(fā)現(xiàn)乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 和SIRT1 分別介導(dǎo)了PARN-Lys566 的乙?；腿ヒ阴；?，暗示PARN作為SIRT1的底物蛋白可能參與了端粒維持和細(xì)胞衰老等生理過(guò)程。

雖然PARN之外的脫腺苷酸酶大都沒(méi)有被鑒定出翻譯后修飾，但PAN2-PAN3 和CCR4-NOT 復(fù)合體中的調(diào)節(jié)亞基也存在磷酸化修飾。如，PAN3 的磷酸化并不影響其與PAN2的結(jié)合［64］，但會(huì)干擾其與poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）的相互作用［65］。MK2介導(dǎo)CNOT2的磷酸化抑制CCR4-NOT復(fù)合體的脫腺苷酸酶活性，從而參與滲透脅迫應(yīng)答［66］。酵母中NOT1、NOT4 和CAF1 也存在磷酸化［67］，但目前還不清楚這些磷酸化修飾的功能。

1.2.4相互作用蛋白

根據(jù)其功能，脫腺苷酸酶相互作用蛋白可以分為3 類（圖1）。a. 促進(jìn)脫腺苷酸化的相互作用蛋白，其中最廣泛的蛋白質(zhì)是能夠識(shí)別特定順式作用元件的RBPs。這些RBPs通過(guò)結(jié)合靶mRNA 3'非編碼區(qū)的特定元件和脫腺苷酸酶，提高脫腺苷酸化速率并實(shí)現(xiàn)脫腺苷酸酶對(duì)靶mRNA 分子的特異性降解。b. 抑制脫腺苷酸化的相互作用蛋白，這一類相互作用蛋白既包括RBPs 也包括非RNA 結(jié)合蛋白。第二類相互作用蛋白通過(guò)與脫腺苷酸酶結(jié)合，阻遏脫腺苷酸酶與靶mRNA 的物理接觸，從而保護(hù)靶mRNA免受脫腺苷酸化降解。c. 第三類相互作用蛋白不影響脫腺苷酸酶活性，而是將脫腺苷酸酶招募到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定時(shí)空靶mRNA的精細(xì)脫腺苷酸化。許多脫腺苷酸酶相互作用蛋白是各種信號(hào)通路中激酶的效應(yīng)因子，而磷酸化等翻譯后修飾可以導(dǎo)致第一類和第二類相互作用蛋白的功能轉(zhuǎn)換，從而使得信號(hào)通路能夠通過(guò)直接改變RNA 穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)譜。此外，同一種RBP可能對(duì)不同類型的脫腺苷酸酶具有迥異的影響。如，PABP 抑制PARN 的酶活性，但促進(jìn)PAN2-PAN3和CCR4-NOT復(fù)合體的脫腺苷酸化活性。對(duì)于CCR4-NOT復(fù)合體中的兩種脫腺苷酸酶CCR4和CAF1，PABP卻具有相反的作用，即促進(jìn)CCR4但抑制CAF1的脫腺苷酸化活性［68］。到目前為止已經(jīng)鑒定了相當(dāng)多的脫腺苷酸酶相互作用蛋白，典型的脫腺苷酸酶相互作用蛋白可以參見(jiàn)已發(fā)表的綜述［15-16］。

Fig. 1 Regulation of deadenylase activity by binding proteins and phosphorylation圖1 相互作用蛋白和磷酸化對(duì)脫腺苷酸酶活性的調(diào)控

2 脫腺苷酸酶的生化功能

脫腺苷酸酶通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的poly（A）尾巴或非編碼RNA 的3'端oligo（A）的長(zhǎng)度，參與了細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)RNA 的生物合成、穩(wěn)定性、質(zhì)量控制和mRNA翻譯效率等生化過(guò)程［15-16，69-70］。本文將在以往綜述的基礎(chǔ)上，著重闡述脫腺苷酸酶在mRNA 翻譯效率和非編碼RNA 生物合成途徑中的功能。

2.1 mRNA穩(wěn)定性

一般認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)中mRNA 的非特異性降解或組成性降解主要依賴于PAN2-PAN3 和CCR4-NOT兩個(gè)復(fù)合體的兩階段降解模式。在該模式中，PAN2-PAN3 復(fù)合體起始脫腺苷酸化，將靶mRNA的poly（A）尾降解至約110 nt，而CCR4-NOT 復(fù)合體 繼續(xù)降 解 剩下 的110 nt 至約10 nt［8，68］。當(dāng)mRNA的poly（A）尾小于10 nt時(shí)，mRNA將走向進(jìn)一步的降解途徑。因此，在酵母或哺乳細(xì)胞中敲除pan2并不影響mRNA 半衰期，而敲除CCR4-NOT 復(fù)合體會(huì)全局性延長(zhǎng)mRNA半衰期［68］。大多數(shù)以往研究認(rèn)為PARN并不參與細(xì)胞質(zhì)中mRNA的非特異性降解。最近的研究表明，PARN不影響胞漿mRNA poly（A）的長(zhǎng)度分布，但顯著改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上mRNA poly（A）的長(zhǎng)度分布和平均長(zhǎng)度［31］。這暗示不同類型的脫腺苷酸酶在功能上也許存在冗余，但在細(xì)胞內(nèi)的具體降解靶標(biāo)可能不僅受到PABP 等相互作用蛋白的調(diào)節(jié)，而且受到細(xì)胞定位等多方面因素的影響。

2.2 翻譯效率

脫腺苷酸酶是mRNA 穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子，原則上可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄本豐度負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的表達(dá)水平。然而，研究發(fā)現(xiàn)一些脫腺苷酸酶直接參與了mRNA 翻譯效率的調(diào)控，暗示mRNA的翻譯和降解過(guò)程存在有機(jī)偶聯(lián)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位的PARN 可以降解具有較低翻譯效率的mRNAs，并介導(dǎo)核糖體在結(jié)合有不同數(shù)量核糖體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)mRNAs之間的重新分配，促進(jìn)一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)mRNAs提高翻譯效率［31］。

CCR4-NOT 復(fù)合體中NOT 亞基調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程的作用可能與其脫腺苷酸化活性無(wú)關(guān)。真核生物中，翻譯的延伸速率取決于密碼子適配性（codon optimality）［71-72］。密碼子適配性是指綜合考慮核糖體解讀不同密碼子速率的差異、tRNA 豐度以及側(cè)翼密碼子的識(shí)別對(duì)解碼速率產(chǎn)生的影響［73］。脫腺苷酸酶復(fù)合體和脫帽復(fù)合體可以感知延伸速率。當(dāng)mRNA 結(jié)合移動(dòng)速度較慢的核糖體時(shí)，將以CAF1依賴的方式發(fā)生快速脫腺苷酸化和脫帽；而當(dāng)mRNA結(jié)合快速移動(dòng)的核糖體時(shí)，可避免poly（A）尾降解和脫帽。酵母中，CCR4-NOT 復(fù)合體的NOT4 亞基可以泛素化核糖體40S 亞基蛋白eS7［74-75］，導(dǎo)致解碼變慢從而核糖體A 位缺乏tRNA。與此同時(shí)，NOT5 亞基特異性地結(jié)合到核糖體E 位，縮短含有非最優(yōu)密碼子轉(zhuǎn)錄本的半衰期。刪除NOT5 的核糖體E 位互作結(jié)構(gòu)域或突變eS7的泛素化位點(diǎn)可以穩(wěn)定含有非最優(yōu)密碼子組合的轉(zhuǎn)錄本，并可阻止脫帽激活蛋白Dhh1 的結(jié)合［76］。因此，NOT5 結(jié)合核糖體以及NOT4 介導(dǎo)eS7泛素化可能可以直接感知解碼速率并發(fā)出延伸放緩的信號(hào)。CCR4-NOT 復(fù)合體的NOT1、NOT4和NOT5 還參與了蛋白質(zhì)復(fù)合體的共翻譯組裝過(guò)程［77-78］。此外，凝聚性的mRNA 不易被典型的核糖體或多核糖體親和途徑捕獲，因此其翻譯延伸動(dòng)力學(xué)會(huì)受到影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)，酵母中NOT1和NOT4可以參與可溶性和不可溶mRNA的比例分配，從而調(diào)節(jié)翻譯動(dòng)力學(xué)［79］。

2.3 非編碼RNA

大多數(shù)成熟的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）缺乏3'端poly（A）尾［80］，脫腺苷酸酶似乎對(duì)這些ncRNA 不會(huì)產(chǎn)生影響。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PARN、PNLDC1 等脫腺苷酸酶廣泛參與了ncRNA生物合成的調(diào)控（圖2）。研究表明，PARN 對(duì)miRNA 生物合成過(guò)程中的3'端修剪是不可或缺的［81-83］，但其精確的生化機(jī)制仍然不清楚。其中一種假說(shuō)認(rèn)為，PARN可能去除由PAPD5等末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶添加的3'端延伸或非模板化添加的U或A，從 而 在miRNA生物合成中發(fā)揮作用［83］。PARN是一些核小NA （small nucleolar RNA，snoRNA）3'端的微調(diào)劑［84-85］。PNLDC1 參與了家蠶、秀麗隱桿線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中piRNA（PIWIinteracting RNA）的生物合成［86-88］。PARN和TOE1可促進(jìn)核ncRNA的成熟，尤其是Cajal小體募集的特異性小RNA （small Cajal body-specific RNAs，scaRNAs）。當(dāng)PARN 和TOE1 受損時(shí)，scaRNAs 下調(diào)，導(dǎo)致核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）假尿苷化缺陷［85］。PARN 的功能喪失性突變可能通過(guò)端粒酶活性［84，89-92］、miRNA 成熟［93］、rRNA生物合成［84，94-95］的聯(lián)合損傷引起人類疾病。因此，多功能的PARN 通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA 和ncRNA 代謝，參與了基因組穩(wěn)定性的維持、細(xì)胞周期運(yùn)行和代謝穩(wěn)態(tài)。

Fig. 2 Substrates of deadenylase in the cells圖2 脫腺苷酸酶的細(xì)胞內(nèi)底物

脫腺苷酸酶與miRNA 介導(dǎo)的基因沉默之間具有復(fù)雜的相互關(guān)系。miRNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC）通過(guò)招募PARN促進(jìn)ARE元件依賴的脫腺苷酸化過(guò)程，而PARN 缺失也會(huì)導(dǎo)致靶向p53 mRNA 的多個(gè)miRNA的下調(diào)［93］。在G0期細(xì)胞中，PARN 被鑒定為特化復(fù)合物FXR1a 相關(guān)miRNA 的組分，以激活mRNA 的非常規(guī)翻譯［96］。CCR4-NOT 復(fù)合物也參與了miRNA 介導(dǎo)的基因沉默。Ago-miRNA 和TNRC6（GW182）家族蛋白結(jié)合，通過(guò)識(shí)別位于mRNA 3'非編碼區(qū)域的miRNA 互補(bǔ)序列結(jié)合到靶標(biāo)mRNA 上。與此同時(shí)，TNRC6 通過(guò)直接相互作用招募CCR4-NOT 與PAN2-PAN3 兩種脫腺苷酸酶復(fù)合體，促進(jìn)mRNA 的脫腺苷酸化和降解［97］。miRNA 介導(dǎo)的mRNA 脫腺苷酸化中PAN2 幾乎沒(méi)有作用，起主要作用的是CCR4-NOT 復(fù)合體中的CAF1 和CCR4。CNOT1 直接招募CAF1，CAF1 招募CCR4 協(xié)同作用，起始了CAF1 依賴的脫腺苷酸化過(guò)程［98］。

3 脫腺苷酸酶在生殖和發(fā)育中的功能

通過(guò)調(diào)節(jié)RNA 代謝穩(wěn)態(tài)，脫腺苷酸酶廣泛參與了眾多生理過(guò)程。脫腺苷酸酶在DNA損傷應(yīng)答、基因組穩(wěn)定性、發(fā)育和免疫應(yīng)答中的功能可參見(jiàn)最近的綜述［15-16，99-101］。本文主要闡述脫腺苷酸酶在生殖、發(fā)育和干細(xì)胞干性維持中所發(fā)揮的生理功能。

多種脫腺苷酸酶都屬于RNA 代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的管家基因，敲除或敲低會(huì)導(dǎo)致明顯的生長(zhǎng)缺陷或高等生物的胚胎致死。如，在釀酒酵母中，雖然CCR4-NOT復(fù)合體純合缺失菌株是可存活的，但其后代具有明顯的生長(zhǎng)缺陷［102］。由于細(xì)胞周期出現(xiàn)異常，ccr4缺失的釀酒酵母突變株比野生型細(xì)胞大很多［103］。在果蠅中，在胚胎到幼蟲(chóng)的階段缺失NOT3和CAF1蛋白都顯現(xiàn)出致死表型［104］，而not1基因的神經(jīng)元特異性敲低也會(huì)導(dǎo)致果蠅致死［105］。在小鼠中，cnot3的缺失導(dǎo)致胚胎致死［104］。在人細(xì)胞中，CAF1a/CNOT7 和CAF1b/CNOT8 可以阻遏增殖抑制基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［106］，而敲低PARN、CCR4或CAF1的任何一種同工酶都可能導(dǎo)致人細(xì)胞系生長(zhǎng)缺陷［12，107］。

多種脫腺苷酸酶在生殖過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用。Twin（果蠅編碼CCR4的基因）純合突變體導(dǎo)致雌性果蠅不育［108］。CAF1a/CNOT7 與核視黃醇受體RXRB結(jié)合可增強(qiáng)其活性，對(duì)精子的生成至關(guān)重要，cnot7基因缺失導(dǎo)致雄性小鼠不育［109-110］。CCR4b/CNOT6L對(duì)于雌性生殖和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)是必需的，敲除cnot6l導(dǎo)致雌性小鼠不育，并且卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)降低［111-112］。在果蠅和小鼠中的機(jī)制研究表明，NANOS、Pumilio、DND1 等RBPs 通過(guò)招募CCR4-NOT 復(fù)合體靶向降解Mei-P26 等重要因子的mRNAs，從而維持生殖干細(xì)胞的自我更新和定向分化［113-115］。此外，PARN參與了非洲爪蟾卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的脫腺苷酸化過(guò)程［18］。PNLDC1 通過(guò)參與piRNA 加工影響減數(shù)分裂和精子形成，pnldc1敲除導(dǎo)致雄性小鼠不育［86，116-117］，人pnldc1基因的錯(cuò)義突變或移碼突變會(huì)導(dǎo)致無(wú)精癥［118］。

除了參與生殖干細(xì)胞維持，CCR4-NOT復(fù)合體中的多個(gè)亞基還參與了多能干細(xì)胞的干性維持和分化調(diào)控。CNOT1、CNOT2 和CNOT3 被發(fā)現(xiàn)參與小鼠和人胚胎干細(xì)胞的干性維持和自我更新［119-122］。RNF219 招募CCR4-NOT 復(fù)合體參與了二細(xì)胞胚胎特異性轉(zhuǎn)錄本以及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控［122］。在多能干細(xì)胞從原始態(tài)到活化態(tài)的轉(zhuǎn)變過(guò) 程（na?ve-to-formative transition） 中，CAF1b/CNOT8 通過(guò)脫腺苷酸化清除原始態(tài)干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄本［123］。胚胎干細(xì)胞核內(nèi)，miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中的AGO 蛋白結(jié)合在靶mRNA 的編碼區(qū)和內(nèi)含子，AGO 蛋白通過(guò)招募CCR4-NOT 復(fù)合體清除核內(nèi)mRNA以調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化［124］。淡水渦蟲(chóng)再生過(guò)程中的轉(zhuǎn)分化過(guò)程也受到CCR4-NOT 復(fù)合體調(diào)節(jié)［125］。

在不同發(fā)育階段，脫腺苷酸酶被不同的RBPs招募，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因表達(dá)譜的快速切換，從而影響細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育過(guò)程［16］。如在非洲爪蟾、果蠅、小鼠和人等物種的早期發(fā)育階段，CCR4-NOT復(fù)合體、PARN 和nocturnin 等會(huì)被Smagug 等RBPs招募，特異性地對(duì)母源mRNA 進(jìn)行脫腺苷酸化［126-131］。在胚胎發(fā)育階段，發(fā)育過(guò)程中起重要作用的RBPs 會(huì)招募CCR4-NOT 復(fù)合體等脫腺苷酸酶，調(diào)節(jié)組織特異性基因、細(xì)胞周期和代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平從而影響細(xì)胞分化過(guò)程［100，122，132-133］。

4 脫腺苷酸酶與疾病

早期研究主要集中在脫腺苷酸酶的生化性質(zhì)和所參與的生理功能，對(duì)CCR4-NOT 和PAN2-PAN3復(fù)合體的研究也長(zhǎng)期集中在模式生物酵母中。最近20 年來(lái)，隨著對(duì)生理功能研究的深入和分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)展，脫腺苷酸酶的突變和異常表達(dá)被發(fā)現(xiàn)廣泛參與了端粒相關(guān)疾病、心血管疾病、神經(jīng)發(fā)育疾病、癌癥，以及代謝相關(guān)疾病等多種重大疾病或罕見(jiàn)病的發(fā)生發(fā)展（圖3）。

4.1 端粒相關(guān)疾病

端?？s短是衰老的基本特征之一，端粒的異?？s短與許多遺傳病密切相關(guān)，但到目前為止僅有極少的端粒相關(guān)疾病的分子機(jī)制得到了較好闡釋［134］。2015 年，兩個(gè)研究組分別在3 個(gè)先天性角化不良遺傳家系和76 個(gè)原發(fā)性肺纖維化的遺傳家系中發(fā)現(xiàn)，PARN遺傳突變與端粒相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)［91-92］。后續(xù)研究鑒定了更多的嚴(yán)重先天性角化不良相關(guān)的PARN 錯(cuò)義突變［95，135］。機(jī)制研究表明，PARN遺傳突變可能破壞了PARN參與DNA損傷應(yīng)答、核小RNA 生物合成、rRNA 合成、miRNA 生物合成、細(xì)胞周期運(yùn)行和細(xì)胞應(yīng)激等多種功能［92，94］，而最令人驚訝的表型是與健康人群相比，患者的端粒長(zhǎng)度顯著縮短。攜帶PARN突變的患者體內(nèi)，端粒維持相關(guān)基因明顯下調(diào)［92］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PARN參與了端粒RNA組分TERC的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程，PARN 負(fù)責(zé)移除轉(zhuǎn)錄后添加的3'端oligo（A），促進(jìn)TERC 的成熟和端粒結(jié)構(gòu)的組裝［89］。

在酵母和人細(xì)胞系中的研究表明，CCR4-NOT復(fù)合體通過(guò)多種途徑參與了基因組穩(wěn)定性維持和端粒相關(guān)基因的調(diào)控［16］，但到目前為止還沒(méi)有CCR4-NOT復(fù)合體與端粒相關(guān)疾病的報(bào)道。

4.2 心血管疾病

心血管疾病是導(dǎo)致全球死亡人數(shù)最多的疾病。CCR4-NOT 復(fù)合體可能與擴(kuò)張型心肌?。╠CM）、短QT 綜合征和長(zhǎng)QT 綜合征等多種原發(fā)性心血管疾病相關(guān)［104，136-137］。如前所述，脫腺苷酸酶的生理功能包括了心肌細(xì)胞在內(nèi)的各種類型細(xì)胞的分化調(diào)控。除此之外，在溫度應(yīng)激條件下，果蠅NOT3參與了心臟功能調(diào)節(jié)。敲除not3的雜合子小鼠表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)張型心肌病表型，如心臟收縮力降低和心力衰竭幾率增加，而組蛋白脫乙酰酶（HDACs）抑制劑能拯救not3+/-小鼠的心臟缺陷，暗示NOT3可能參與了心臟相關(guān)的染色質(zhì)重塑等表觀遺傳修飾［104］。

Cnot3和cnot1心臟細(xì)胞條件敲除小鼠中，自噬途徑關(guān)鍵蛋白ATG7表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨著心肌細(xì)胞死亡，心臟收縮力下降，QT 間期延長(zhǎng)和心力衰竭等表型［136］。研究發(fā)現(xiàn)，CNOT3 介導(dǎo)了atg7mRNA 的脫腺苷酸化。在CNOT3 缺乏的心臟細(xì)胞中，ATG7 與p53 相互作用促進(jìn)細(xì)胞死亡相關(guān)基因的表達(dá)，而同時(shí)敲除atg7和cnot3可部分修復(fù)小鼠心臟缺損。這暗示在脫腺苷酸化水平低的心臟細(xì)胞中，ATG7 與p53 的異常相互作用促進(jìn)心臟細(xì)胞凋亡和心肌功能受損。除了CNOT1 和CNOT3，CCR4-NOT 復(fù)合體的其他組分也參與了心臟結(jié)構(gòu)和功能的維持［137］。雖然模式生物中的機(jī)制研究取得了一些進(jìn)展，但CCR4-NOT 復(fù)合體在心血管疾病中的臨床意義還需進(jìn)一步探索。

4.3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

最近，多種脫腺苷酸酶基因的遺傳突變被發(fā)現(xiàn)與智力發(fā)育障礙和自閉癥譜系障礙（ASDs）等神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)。人類遺傳學(xué)研究表明，CNOT1功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的多個(gè)錯(cuò)義突變都可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙［138-140］。在果蠅中的機(jī)制研究表明，9個(gè)NOT1突變體都觀察到了求愛(ài)障礙、學(xué)習(xí)和記憶受損等神經(jīng)發(fā)育障礙表型，而在突變體果蠅中表達(dá)野生型人源CNOT1 cDNA可以在一定程度上拯救以上表型。與單基因敲除相比，CNOT1和其他已知ASDs基因的聯(lián)合敲除導(dǎo)致更嚴(yán)重的記憶缺陷。CNOT2 被發(fā)現(xiàn)與染色體12q15微缺失綜合征、全面發(fā)育延遲和特征性顱面異常的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)［141-142］。CNOT3錯(cuò)義或截短突變也在ASDs患者［143］和智力發(fā)育障礙患者［144］中被報(bào)道。CCR4-NOT復(fù)合體亞基突變導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙可能來(lái)源于CCR4-NOT復(fù)合體在早期發(fā)育階段就參與了神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的穩(wěn)定性調(diào)控［122，138-140］。此外，PAN2 突變被發(fā)現(xiàn)與智力缺陷有關(guān)［145-146］，攜帶PARN 遺傳突變的純合子患者具有骨髓衰竭和嚴(yán)重的神經(jīng)缺陷，而雜合子患者具有相對(duì)較輕的發(fā)育遲緩和精神疾?。?4］。脫腺苷酸酶突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機(jī)制和病理功能還知之甚少，需要進(jìn)一步研究。

4.4 腫瘤

與脫腺苷酸酶在細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡和基因組穩(wěn)定性調(diào)控的功能一致［15-16］，脫腺苷酸酶的異常表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但不同脫腺苷酸酶在不同腫瘤中的作用機(jī)制可能各不相同。在乳腺癌小鼠模型中，CNOT2 敲低導(dǎo)致體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移增加，而CNOT2 過(guò)表達(dá)影響多種腫瘤惡性表型相關(guān)因子的表達(dá)［147］。TOB1 介導(dǎo)CAF1a/CNOT7 參與了多種促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控［148］。CCR4b/CNOT6L 直 接 調(diào)節(jié)了抑癌 基 因p27Kip1的mRNA 和蛋白質(zhì)水平［10］。在一些胃癌患者中，PARN、CCR4a/CNOT6、CCR4b/CNOT6L、CAF1a/CNOT7 和CAF1b/CNOT8 等脫腺苷酸酶可能高表達(dá)。在胃癌細(xì)胞系中，敲低這些脫腺苷酸酶都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，但其所靶向的抑癌基因（如p53、p27、p21、mdm2等） mRNA可能各不相同［12，107］。CNOT1 和CCR4a/CNOT6 基因表達(dá)情況與B 細(xì)胞急性淋巴性白血病易感性高度相關(guān)［149］，而原發(fā)性急性骨髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病患者樣本中PARN和CNOT6 的表達(dá)均有升高［150］。在肺癌中，CCR4a/CNOT6 的高表達(dá)預(yù)示著更好的患者生存率，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率偏低［151］。在浸潤(rùn)性乳腺癌中，PARN 表達(dá)下調(diào)［152］。在過(guò)表達(dá)CNOT2 的6DT1 乳腺癌細(xì)胞小鼠模型中，乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移和腫瘤增殖均被抑制［147］。在人大腸癌中，CNOT2 和CAF1b/CNOT8 的表達(dá)也有升高［153-154］，CNOT3 也參與了調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞自我更新［155］。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，脫腺苷酸酶可能以多種途徑參與了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在不同類型的腫瘤組織中，不同脫腺苷酸酶的主要靶標(biāo)mRNAs 和調(diào)控機(jī)制可能存在較大差異，這些差異可能源于不同腫瘤組織基因表達(dá)譜之間的差別。此外值得注意的是，脫腺苷酸酶作用機(jī)制的復(fù)雜性還體現(xiàn)在各種脫腺苷酸酶的功能冗余和代償性表達(dá)，需要在臨床和機(jī)制研究中予以重視。

4.5 代謝類疾病

脫腺苷酸酶調(diào)節(jié)RNA 穩(wěn)態(tài)，其功能缺陷可能會(huì)導(dǎo)致代謝相關(guān)基因的表達(dá)異常。CCR4-NOT復(fù)合體的正常功能對(duì)維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)非常重要，CNOT1 在小鼠肝臟中的特異性缺乏會(huì)引起肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本poly（A）尾的過(guò)度延伸，最終導(dǎo)致致命性肝炎［156］。在小鼠脂肪組織中敲除cnot3導(dǎo)致脂肪營(yíng)養(yǎng)不良［157］，而敲除cnot1導(dǎo)致脂肪營(yíng)養(yǎng)不良并伴隨著脂肪組織中出現(xiàn)肌肉樣纖維結(jié)構(gòu)［158-159］。在糖尿病小鼠模型中，CNOT1、CNOT2和CNOT3的表達(dá)下調(diào)，而β 細(xì)胞特異性cnot3基因敲除小鼠具有糖尿病表型并顯示胰島素表達(dá)降低［160］。脫腺苷酸酶在代謝類疾病中的分子機(jī)制還很少得到闡明，推測(cè)可能與細(xì)胞分化過(guò)程中脫腺苷酸酶調(diào)控組織特異性基因的表達(dá)相關(guān)。

5 結(jié)論與展望

通過(guò)調(diào)節(jié)RNA 3'端poly（A）或oligo（A）的長(zhǎng)度，脫腺苷酸化不僅在mRNA 穩(wěn)定性和翻譯效率調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，而且也是多種非編碼RNA 生物合成途徑中必不可少的修飾加工者。作為RNA 水平的重要調(diào)控者之一，脫腺苷酸酶參與了幾乎所有細(xì)胞生命活動(dòng)和多種重要生理和病理過(guò)程。然而，由于RNA 水平的調(diào)控研究還處于發(fā)展時(shí)期，還需要更多研究才能闡明脫腺苷酸酶多種多樣的生理功能和精細(xì)復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

細(xì)胞中多種脫腺苷酸酶的活性受到嚴(yán)格的分子調(diào)控，以維持細(xì)胞內(nèi)的RNA 穩(wěn)態(tài)。脫腺苷酸酶分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可能作用機(jī)制是：細(xì)胞中上千種RBPs作為RNA命運(yùn)調(diào)控的中心分子，一方面根據(jù)RNA 的狀態(tài)或細(xì)胞需求識(shí)別特定的靶RNA 子集，另一方面招募特定脫腺苷酸酶，實(shí)現(xiàn)脫腺苷酸酶對(duì)特定靶RNA 子集3'端的修剪，從而調(diào)控RNA 的最終命運(yùn)。翻譯后修飾和相互作用蛋白表達(dá)譜的變化可以轉(zhuǎn)換脫腺苷酸酶的活性狀態(tài)和靶向的底物RNA 子集，從而響應(yīng)發(fā)育和應(yīng)激過(guò)程中細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)情況的各種需求。由此，細(xì)胞中十余種脫腺苷酸酶同工酶和上千種RBPs 構(gòu)成了復(fù)雜的動(dòng)態(tài)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，幫助細(xì)胞在生長(zhǎng)、增殖、分化、應(yīng)激、死亡等重要生命活動(dòng)中維持RNA 穩(wěn)態(tài)或轉(zhuǎn)換基因表達(dá)譜。

脫腺苷酸酶所介導(dǎo)的RNA 穩(wěn)態(tài)調(diào)控與其他細(xì)胞調(diào)控途徑之間可能存在著廣泛的聯(lián)系。翻譯后修飾和蛋白質(zhì)相互作用偶聯(lián)了細(xì)胞信號(hào)傳遞與RNA穩(wěn)態(tài)調(diào)控，一方面激酶通過(guò)磷酸化修飾等可以改變脫腺苷酸酶的活性和底物選擇，另一方面脫腺苷酸酶也可以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。除此之外，現(xiàn)有的零星研究表明，核苷類化合物可以調(diào)控脫腺苷酸酶活性，而脫腺苷酸酶也調(diào)節(jié)了自噬等過(guò)程，暗示脫腺苷酸酶可能與細(xì)胞內(nèi)的多種生物合成和降解途徑之間存在著交互調(diào)節(jié)。但到目前為止，現(xiàn)有研究所揭示的仍然是RNA-RBP-脫腺苷酸酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的很小一部分，對(duì)于RNA 降解途徑與細(xì)胞其他重要過(guò)程之間的關(guān)系也還需要進(jìn)一步探索。