分子模擬在多黏菌素藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用*

蔣緒愷 肖 敏 王祿山

（1）山東大學(xué)國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，青島 266237；2）山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266237）

抗生素藥物是20 世紀(jì)最偉大的發(fā)明之一，在醫(yī)療、環(huán)境、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［1］。然而，抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥問題卻給人類健康帶來了新的挑戰(zhàn)［2］。世界衛(wèi)生組織已將細(xì)菌抗生素耐藥列為全球最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題［3］，如果不采取積極有效的措施，到2050 年預(yù)計(jì)全球每年將超過1 000 萬人死于耐藥細(xì)菌感染。為此，世界衛(wèi)生大會(huì)在2015 年審議通過了抗生素耐藥性全球行動(dòng)計(jì)劃，呼吁各國(guó)政府和組織采取積極行動(dòng)，緩解細(xì)菌耐藥危機(jī)。2022 年10 月，國(guó)家衛(wèi)健委、國(guó)家藥監(jiān)局等部門聯(lián)合發(fā)布了《遏制微生物耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2022-2025 年）》，文件指出中國(guó)的細(xì)菌耐藥形勢(shì)仍然不容樂觀［4］。因此，深入探究細(xì)菌耐藥的發(fā)生和傳播機(jī)制，加快研發(fā)新一代抗生素藥物勢(shì)在必行。

與革蘭氏陽性菌相比，革蘭氏陰性菌的耐藥問題更加嚴(yán)峻。2021 年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示［5］，在1 434 所醫(yī)院分離的約374.3 萬例臨床菌株中，革蘭氏陰性致病菌占比71.1%，其中大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌均位于總分離率的前5位，而且這些細(xì)菌已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)常用抗生素的高度耐藥性。由于極高的感染率和致死率，世界衛(wèi)生組織將多重耐藥的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌列入極度危險(xiǎn)細(xì)菌名單，亟需開發(fā)新型有效的抗生素藥物［6-8］。

多黏菌素是一類發(fā)現(xiàn)于多黏芽孢桿菌的天然抗生素分子［9］，也是目前臨床上治療革蘭氏陰性多重耐藥菌感染的最后一道防線。作為一種脂肽類抗生素，多黏菌素通過結(jié)合細(xì)菌外膜的脂多糖（LPS）分子，破壞細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡［10］。然而目前對(duì)其抗菌機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)仍十分欠缺。另一方面，不斷出現(xiàn)的多黏菌素耐藥菌株［11］，以及多黏菌素導(dǎo)致的嚴(yán)重腎毒性都成為制約其臨床應(yīng)用的主要因素［12］。本文從多黏菌素的發(fā)現(xiàn)歷史和設(shè)計(jì)入手，梳理了分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)在多黏菌素活性、耐藥和腎毒性機(jī)制方面的最新進(jìn)展應(yīng)用，并分析了這一領(lǐng)域的未來發(fā)展方向，為理解多黏菌素藥理機(jī)制，研發(fā)新一代多黏菌素藥物提供新思路。

1 多黏菌素概述

多黏菌素最早于20 世紀(jì)50 年代在多黏芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)，屬于脂肽類抗生素分子。分子結(jié)構(gòu)由N端脂肪酸鏈、連接三肽和環(huán)狀七肽構(gòu)成。與大多數(shù)抗生素藥物靶向胞內(nèi)作用靶點(diǎn)不同，多黏菌素主要通過與細(xì)菌外膜中的LPS 相互作用［13］，破壞外膜的結(jié)構(gòu)完整性，并導(dǎo)致細(xì)菌死亡［10，14］。正是由于這種特殊的膜靶向型作用機(jī)制，多黏菌素對(duì)革蘭氏陰性多重耐藥菌仍然保有強(qiáng)力的殺菌效果，是目前臨床上革蘭氏陰性治療多重耐藥菌感染的最后一道防線［15］。

自多黏菌素被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種天然多黏菌素，主要包括：多黏菌素A、B、C、D、E、F、M、P、S 和T 分支。天然多黏菌素的結(jié)構(gòu)差異主要在于N 端的脂肪酸基團(tuán)以及第3、6、7 和10 位的氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)變化涵蓋脂肪酸長(zhǎng)度差異、脂肪酸有無側(cè)支、氨基酸種類和立體化學(xué)異構(gòu)差異等。2022 年，洛克菲勒大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過基因組挖掘技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一種全新的多黏菌素分子并將其命名為Macolacin［16］。該分子與多黏菌素B具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保留相同的細(xì)菌外膜靶向機(jī)制，但對(duì)多黏菌素B耐藥菌株，例如肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和大腸桿菌，表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗菌活性。這說明自然界中仍然存在著尚待挖掘的多黏菌素分子，這為新型抗生素藥物的挖掘和設(shè)計(jì)提供了可能［17］。

除了自然界天然存在的多黏菌素外，研究人員設(shè)計(jì)超過2 000 種人工合成的多黏菌素，包括作者團(tuán)隊(duì)利用化學(xué)全合成方法，開發(fā)的FADDI-039、FADDI-287、FADDI-365等多種新型多黏菌素候選藥物［18-20］，其中FADDI-365 正開展臨床I 期試驗(yàn)。在最新研究中，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院李卓榮研究員團(tuán)隊(duì)［21］借助于化學(xué)生物學(xué)方法，研究了多黏菌素類分子的結(jié)構(gòu)-活性和結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系，并設(shè)計(jì)出具有高抗菌活性、低腎毒性的新型多黏菌素類先導(dǎo)化合物C-02。此外，山東大學(xué)卞小瑩教授團(tuán)隊(duì)［22］發(fā)展了一種基于合成生物學(xué)技術(shù)的多黏菌素分子改造策略，為多黏菌素藥物的設(shè)計(jì)提供了新方法。

值得注意的是，細(xì)菌形成多黏菌素耐藥的比例遠(yuǎn)低于其他抗生素。臨床數(shù)據(jù)顯示主要的革蘭氏陰性致病菌對(duì)常用治療藥物，例如氨芐西林、環(huán)丙沙星、美羅培南等的耐藥率超過50%，但對(duì)多黏菌素耐藥的比例仍低于1%［5］。造成這種差異的原因在于多黏菌素獨(dú)特的膜靶向抗菌機(jī)制：LPS是多黏菌素的主要作用靶點(diǎn)，其生物合成涉及多步酶催化反應(yīng)，屬于典型的非模板式合成過程。因此，LPS具有相對(duì)保守的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不容易受到基因突變的直接影響，細(xì)菌也就難以快速通過改變LPS結(jié)構(gòu)來形成多黏菌素耐藥。在細(xì)菌耐藥形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻的背景下，多黏菌素高抗菌活性、易編輯的分子結(jié)構(gòu)以及低耐藥發(fā)生率等特點(diǎn)表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為一類極具應(yīng)用前景和開發(fā)潛力的抗生素分子［23-24］。

2 多黏菌素藥理機(jī)制與細(xì)胞膜系統(tǒng)的內(nèi)在關(guān)系

2.1 抗菌活性機(jī)制

除細(xì)胞膜以外，革蘭氏陰性細(xì)菌還擁有一層特殊的外膜結(jié)構(gòu)，主要由LPS、磷脂和外膜蛋白組成。細(xì)菌外膜是典型的非對(duì)稱膜，外小頁主要由LPS組成，內(nèi)小頁則主要是磷脂。通過相鄰脂質(zhì)形成的直接相互作用以及鈣離子介導(dǎo)的間接相互作用，細(xì)菌外膜形成了對(duì)外源有害物質(zhì)（例如抗生素）的滲透屏障，提高了逆境生存能力［25］。多黏菌素通過與細(xì)菌外膜LPS相結(jié)合，破壞細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)完整性并導(dǎo)致細(xì)菌死亡。然而，通過傳統(tǒng)的生物化學(xué)或生物物理手段，難以精確地分析多黏菌素與細(xì)菌外膜相互作用的細(xì)節(jié)，限制了多黏菌素抗菌機(jī)制以及結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的深入研究。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，從不同角度探究了多黏菌素與細(xì)菌外膜的相互作用機(jī)制（圖1）。2015 年，Berglund等［26］研究了多黏菌素B與大腸桿菌外膜的相互作用，發(fā)現(xiàn)多個(gè)多黏菌素分子在細(xì)菌外膜表面發(fā)生聚集，并且多黏菌素N端脂肪酸鏈部分地插入到外膜疏水區(qū)。這種相互作用抑制了細(xì)菌外膜的流動(dòng)，并導(dǎo)致外膜的厚度減小。2017 年，Santos 等［27］研究了多黏菌素B與模型化細(xì)菌外膜的相互作用，發(fā)現(xiàn)多黏菌素B的結(jié)合能夠置換出原本結(jié)合在細(xì)菌外膜上的Ca2+，導(dǎo)致細(xì)菌外膜曲率改變和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。這些研究為理解多黏菌素的抗菌機(jī)制提供了幫助，但依然存在兩個(gè)主要缺陷：a. 研究中細(xì)菌外膜的脂質(zhì)組成是理想化設(shè)置的，難以反映細(xì)菌外膜的真實(shí)結(jié)構(gòu)特征；b. 研究中多黏菌素主要停留在細(xì)菌外膜的表面，而不能實(shí)現(xiàn)跨膜運(yùn)動(dòng)，這也阻礙了對(duì)多黏菌素抗菌活性機(jī)制的深入分析。

為了克服上述難題，作者團(tuán)隊(duì)利用細(xì)胞膜定量脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了鮑曼不動(dòng)桿菌外膜的脂質(zhì)組成，包括LPS的化學(xué)型和不同磷脂的精確比例，并在此指導(dǎo)下搭建了具有生物真實(shí)度的細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)模型［28］。此外，通過整合拉伸動(dòng)力學(xué)和傘狀取樣技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多黏菌素跨膜動(dòng)態(tài)的全過程追蹤，發(fā)現(xiàn)多黏菌素在細(xì)菌外膜內(nèi)部形成特異性折疊構(gòu)象，有助于充分結(jié)合細(xì)菌外膜LPS并破壞外膜結(jié)構(gòu)［10］。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)生物學(xué)和藥理學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步分析了多黏菌素各結(jié)構(gòu)位點(diǎn)在分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變和跨外膜運(yùn)動(dòng)中的作用，從而建立了多黏菌素全結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的功能解析模型，全面地揭示了多黏菌素關(guān)鍵位點(diǎn)的改造對(duì)抗菌活性的影響，為多黏菌素分子結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)提供了一種新的方法。利用這一方法，作者團(tuán)隊(duì)成功設(shè)計(jì)出了具有更高抗菌活性的新型多黏菌素候選藥物FADDI-287［19］。這些研究為從原子水平上深入認(rèn)識(shí)多黏菌素的抗菌活性機(jī)制，理性設(shè)計(jì)新一代多黏菌素藥物奠定了基礎(chǔ)。

2.2 細(xì)菌耐藥機(jī)制

隨著多黏菌素的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯氏菌等開始出現(xiàn)對(duì)多黏菌素的耐藥［15］。細(xì)菌采取了多種不同的策略來改變外膜LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)，抑制多黏菌素的活性。這些策略包括：a. 雙組分系統(tǒng) PhoPQ、PmrAB 等可以感應(yīng)環(huán)境中的抗生素分子、高濃度的鐵離子或低pH值，上調(diào)表達(dá)LPS結(jié)構(gòu)修飾通路中的相關(guān)基因，例如arnT、eptA、pagL等，導(dǎo)致LPS 中的脂質(zhì)A組分發(fā)生磷酸乙醇胺、阿拉伯糖胺、脫脂酰化等修飾［29］；b. 2016年開始陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的mcr-1到mcr-9基因家族通過表達(dá)磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)LPS的乙?；揎棧?0-31］，這些位于質(zhì)粒中的mcr基因以水平基因轉(zhuǎn)移的方式，促進(jìn)多黏菌素耐藥在物種間的傳播，進(jìn)一步加劇了細(xì)菌耐藥危機(jī)；c. 最近在鮑曼不動(dòng)桿菌中的研究還發(fā)現(xiàn)lpxA、lpxC和lpxD基因突變會(huì)阻礙脂質(zhì)A合成，導(dǎo)致細(xì)菌外膜LPS的完全丟失，促使細(xì)菌產(chǎn)生高水平的多黏菌素耐藥性［28，32］。這些研究都證明了外膜結(jié)構(gòu)重塑是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多黏菌素耐藥的關(guān)鍵機(jī)制。盡管如此，LPS修飾或丟失如何影響細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)特征，以及如何干擾與多黏菌素相互作用的具體機(jī)制仍不明確。

作者團(tuán)隊(duì)通過多尺度分子模擬技術(shù)，揭示了細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)重塑導(dǎo)致多黏菌素耐藥的多樣化機(jī)制（圖1）。通過全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬手段，全面分析了LPS磷酸乙醇胺修飾、阿拉伯糖胺修飾、脫脂酰化修飾在多黏菌素耐藥中的作用［18，33-34］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些修飾顯著降低了多黏菌素對(duì)細(xì)菌外膜的結(jié)合，抑制了多黏菌素分子在外膜內(nèi)部形成折疊構(gòu)象，并阻礙了多黏菌素的跨膜運(yùn)動(dòng)，從原子水平上闡明了LPS修飾賦予的“防御型耐藥”機(jī)制。作者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一種特化的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株只在有多黏菌素的環(huán)境下才能生存。脂質(zhì)組學(xué)分析表明這一菌株完全喪失了LPS的合成能力，因此其細(xì)菌外膜是一種LPS丟失的缺陷型結(jié)構(gòu)。利用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，多黏菌素以“補(bǔ)丁結(jié)合”的方式結(jié)合到外膜表面，而不能插入細(xì)菌外膜內(nèi)部［28］。這種特殊的結(jié)合方式反而增強(qiáng)了細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，揭示了一種由LPS丟失賦予的“多黏菌素依賴型耐藥”機(jī)制。另外，通過大尺度粗?；肿幽M手段，作者團(tuán)隊(duì)還分析了多黏菌素與LPS糖鏈部分的相互作用過程，發(fā)現(xiàn)LPS中的酸性多糖分子能夠招募大量的Ca2+，促進(jìn)LPS分子間形成更復(fù)雜的交叉作用網(wǎng)絡(luò)，減少了多黏菌素分子與脂質(zhì)A部分的接觸［35］?；诖?，作者提出了“能量陷阱”假說，解釋了革蘭氏陰性菌對(duì)多價(jià)陽離子型抗生素廣譜耐藥的理論機(jī)制。

通過分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)探究細(xì)菌形成多黏菌素耐藥的復(fù)雜機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抑制多黏菌素折疊、降低多黏菌素跨膜運(yùn)動(dòng)是最核心的兩個(gè)因素。因此，提出了基于“活性折疊構(gòu)象篩選”和“跨膜熱動(dòng)力學(xué)分析”的藥物設(shè)計(jì)策略［18-19］。通過建立虛擬多黏菌素分子庫，探究其在細(xì)菌外膜內(nèi)部的折疊情況和跨膜自由能譜，實(shí)現(xiàn)藥物抗菌活性的預(yù)測(cè)，從而大大加快新一代抗超級(jí)細(xì)菌藥物的設(shè)計(jì)和篩選。

2.3 腎毒性機(jī)制

多黏菌素曾一度因腎毒性而被禁止使用，直到20世紀(jì)90年代革蘭氏陰性多重耐藥菌的大量出現(xiàn)，多黏菌素才得以重新回歸臨床。然而，腎毒性問題卻依然是制約多黏菌素臨床應(yīng)用最主要的因素。為了降低腎毒性發(fā)生，臨床上往往采用次優(yōu)劑量的多黏菌素［36］，這不僅降低了治療效果，還增加了細(xì)菌產(chǎn)生多黏菌素耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。

多黏菌素誘發(fā)腎毒性的比例高達(dá)60%［37］，臨床表現(xiàn)包括蛋白尿、血尿和急性腎小管壞死，嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性腎功能衰竭［38］。靜脈注射給藥后，多黏菌素在腎臟中大量積累，而幾乎不在肝臟、肺臟、心臟等器官中出現(xiàn)［39］，這種現(xiàn)象與腎小管上皮細(xì)胞大量重吸收多黏菌素有關(guān)。經(jīng)腎臟重吸收后，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的多黏菌素濃度可達(dá)胞外濃度的4 760倍［40］。這說明腎臟重吸收多黏菌素導(dǎo)致胞內(nèi)累積可能是造成腎毒性的源頭。然而，目前對(duì)多黏菌素與腎臟細(xì)胞相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很不充分。

作者團(tuán)隊(duì)根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞膜脂質(zhì)組成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立了腎小管上皮細(xì)胞膜的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬和原子力顯微成像技術(shù)，分析了4 種不同的多黏菌素對(duì)腎臟細(xì)胞膜的影響［41］。結(jié)果表明，雖然不同的多黏菌素均能快速吸附到細(xì)胞膜表面，但對(duì)細(xì)胞膜造成結(jié)構(gòu)損傷的程度具有明顯差異。不同的多黏菌素分子能夠插入到細(xì)胞膜的不同深度，增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性，從而干擾細(xì)胞正常代謝活動(dòng)。這一研究從細(xì)胞膜損傷的角度揭示了多黏菌素腎毒性的機(jī)制，并初步探索了多黏菌素的結(jié)構(gòu)-腎毒性關(guān)系。此外，通過膜蛋白-多黏菌素互作掃描體系，還發(fā)現(xiàn)多黏菌素能夠識(shí)別并結(jié)合離子通道蛋白Kir4.2 和Kir5.1，導(dǎo)致兩者維持在開放構(gòu)象狀態(tài)，造成鉀離子持續(xù)外流和細(xì)胞膜點(diǎn)位紊亂，最終造成腎小管上皮細(xì)胞的代謝障礙［42］。這一研究說明多黏菌素對(duì)關(guān)鍵膜蛋白功能的干擾可能也是誘發(fā)下游腎毒性反應(yīng)的重要機(jī)制（圖1）。

Fig. 1 Applications of molecular dynamics simulations in the research of polymyxin pharmacology圖1 分子動(dòng)力學(xué)模擬在多黏菌素藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用

3 總結(jié)與展望

多黏菌素是目前臨床上治療革蘭氏陰性多重耐藥感染的最后一道防線。多黏菌素的結(jié)構(gòu)易編輯性、膜靶向的抗菌機(jī)制以及低耐藥發(fā)生率，使其成為一類極具開發(fā)潛力的抗生素分子。多黏菌素的藥理機(jī)制與細(xì)胞膜系統(tǒng)密切相關(guān)，但由于生物膜固有的流動(dòng)性和異質(zhì)性特征，常規(guī)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)難以準(zhǔn)確分析多黏菌素與細(xì)胞膜相互作用的分子機(jī)制，這極大地限制了從根本上理解多黏菌素的藥理機(jī)制，也影響了新一代多黏菌素藥物的研發(fā)。

隨著分子模擬技術(shù)的不斷發(fā)展，藥物-細(xì)胞膜互作計(jì)算體系為深入探究多黏菌素的藥理學(xué)機(jī)制提供了新思路。通過構(gòu)建精確的細(xì)菌外膜、腎臟細(xì)胞膜等模型，定量化表征多黏菌素與細(xì)胞膜系統(tǒng)的互作模式，多黏菌素的藥理學(xué)機(jī)制得到了更精細(xì)化的剖析（圖1）。然而，目前多黏菌素-細(xì)胞膜互作的模擬研究仍是采用簡(jiǎn)化的細(xì)胞膜模型，例如膜蛋白和脂質(zhì)的糖基化修飾等因素未被考慮，同時(shí)細(xì)胞膜的尺寸多是在幾納米到數(shù)十納米的范圍。這些因素可能會(huì)影響對(duì)多黏菌素活性、耐藥和毒性機(jī)制細(xì)節(jié)的探究。因此，在未來工作中如何構(gòu)建具有“生物學(xué)真實(shí)度”的計(jì)算模擬體系，從更大的空間尺度、更長(zhǎng)的時(shí)間尺度上分析多黏菌素與細(xì)胞膜系統(tǒng)的相互作用，將是進(jìn)一步完善多黏菌素藥理機(jī)制，建立多黏菌素理性設(shè)計(jì)策略的重要方向。