黃果茄中綠原酸超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

郭蒙　郭純　蔣青　高林曉

關(guān)鍵詞：黃果茄；綠原酸；超聲波輔助提取工藝；工藝優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

黃果茄系茄科茄屬直立草本植物，在我國(guó)星散分布于貴州、四川、臺(tái)灣等地，而國(guó)外也可見于其他熱帶亞洲、大洋洲以及非洲等地[1]。一直以來，中外科研人員對(duì)黃果茄的研究非常重視，近年的研究主要集中在成分、藥理等方面，展現(xiàn)出一定的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。XU 等[2]從黃果茄果中分離出2 個(gè)具有16，17-仲膽甾烷骨架的甾體皂苷，而刁克鵬等[3]從其果中分離出黃酮（6 個(gè)）、酰胺（4 個(gè)）、香豆素（2 個(gè)）等12 個(gè)單體，其中5-羥基-8-甲氧基-6，7-亞甲二氧基黃酮為未見報(bào)道的化合物。CHAUDHARY 等[4]用高效薄層色譜法（high-performance lamina liquid chromatography，HPTLC）分別對(duì)黃果茄根、莖、果中的茄定堿和薯蕷皂苷元同時(shí)進(jìn)行定量分析，以幫助草藥的質(zhì)量控制。李學(xué)玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)，用氣質(zhì)聯(lián)用分析鑒定出黃果茄果的揮發(fā)性物質(zhì)22 種，其中醛酮類、脂類為主要成分，分別為51.03%、32.70%，而在最優(yōu)化條件下，總黃酮提取率可達(dá)4.35%，并對(duì)清除DPPH·、·OH 均展現(xiàn)出較好的效果[6]，此外，SHIVNATH 等[7]發(fā)現(xiàn)黃果茄果醇提取物可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞生存和增殖來改善骨關(guān)節(jié)炎。USMAN 等[8]研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸、咖啡酸甲酯、東莨菪堿、七葉苷等次生代謝物具有抗糖尿病、抗衰老等性能。GUPTA 等[9]發(fā)現(xiàn)，黃果茄果中分離出的槲皮素能夠提供更好的肝臟防御作用，從而可預(yù)防肝毒性。NATARAJAN 等[10]報(bào)道，黃果茄的甲醇提取物能夠治療微生物傷口感染，并有成為抗菌劑的潛力，尤其對(duì)科氏葡萄球菌菌株更有效。CHOUDHARY 等[11]和REDDY 等[12]分別發(fā)現(xiàn)黃果茄全株的水和脂提物具有免疫抑制、抗癌等的特性。ZAMAN 等[13]利用黃果茄果樣品顆粒作為吸附劑直接從水溶液中去除亞甲藍(lán)，吸附能力可達(dá)到0.051 mmol/g。此外，李學(xué)玲等[14]用水提法優(yōu)化了黃果茄果中綠原酸的提取工藝，提取率為0.28%。

綠原酸廣泛存在于雙子葉植物中藥材或食物中[15]，具有抗氧化、抗菌等藥理作用[16-17]，目前仍需要拓寬綠原酸的新來源[18-19]。綠原酸的化學(xué)提取主要有水提、醇提、酶提等方法，尤其超聲輔助醇提法的綠原酸具有更加穩(wěn)定、收率高和溶劑易回收等特性[20]，本研究擬用超聲輔助醇提取黃果茄中綠原酸。此外，高效的單因素實(shí)驗(yàn)僅能得出較粗略的參數(shù)范圍，而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)并不能明確回歸方程，因此，通過響應(yīng)面法建模，以期得到更加準(zhǔn)確的工藝條件[21]，為其今后的工業(yè)開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 成熟的黃果茄果實(shí)采自貴州都勻。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品（Vc，純度≥98%，合肥博美生物科技公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度≥98%），2，2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，純度≥99%，合肥巴斯夫生物科技有限公司），過硫酸鉀（分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司）；無水乙醇（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)于北京普析通用儀器有限公司；AR224CN電子天平購(gòu)于奧豪斯儀器公司；KH2200DE 數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)于昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司；80-1電動(dòng)離心機(jī)購(gòu)于金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0010 g，適量乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶定容，得到濃度為0.1 mg/mL 溶液。準(zhǔn)確移取0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于7 個(gè)容量瓶（10 mL）中，純乙醇定容，靜置15 min。純乙醇作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為328 nm 下分別測(cè)吸光度A 值[19， 22]。以綠原酸樣品濃度C 與吸光度A 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到二者關(guān)系：A=48.1297C–0.0107（R²=0.9941）。

1.2.2 黃果茄果綠原酸提取流程 常規(guī)流程如下：樣品→自然晾曬→烘箱烘干→粉碎、過篩→超聲乙醇提取→離心→綠原酸醇提液。

將干燥的黃果茄果粉碎成末，過孔徑40 目篩，得樣品粉末。稱0.25 g 粉末置于具塞比色管中，后以擬定工藝參數(shù)提取（定100 W 超聲功率），自然冷卻至室溫，離心，取上清液，即為樣品醇提液。

1.2.3 黃果茄果綠原酸的測(cè)定 取超聲后的樣品醇提液0.5 mL，用純乙醇定容至10 mL，靜置15 min，在波長(zhǎng)為328 nm 下測(cè)吸光度，代入上述回歸方程，進(jìn)一步計(jì)算，即可得到綠原酸提取率。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，見表2。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力 最佳工藝條件下黃果茄果醇提物和Vc 用無水乙醇配制成不同濃度的待測(cè)液，并用無水乙醇配制0.20 mmol/LDPPH 溶液[23]。取2 mL DPPH 溶液與2 mL 無水乙醇或不同濃度的2 mL 待測(cè)液避光混合，37 ℃水浴保持30 min，517 nm 處測(cè)吸光度，分別記為A₁和A₂。DPPH 清除率計(jì)算公式：

DPPH 清除率=（A₁– A₂）/A2×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)2 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design expert V8 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析，采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃果茄綠原酸得率的影響 圖1 結(jié)果表明，乙醇濃度低于35%時(shí)，提取的綠原酸量增加幅度相對(duì)較小，最終穩(wěn)定在1.79%左右。這表明，水含量較多時(shí)不利于目標(biāo)產(chǎn)物綠原酸的提取。隨著乙醇濃度逐漸增加到65%，綠原酸提取率迅速增加到最大值3.50%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將擬定乙醇濃度在65%。但是，乙醇濃度繼續(xù)增加，反而會(huì)抑制綠原酸提取，原因可能是溶劑的低極性會(huì)致使強(qiáng)親脂性等物質(zhì)的溶出減少[25]。

2.1.2 液料比對(duì)黃果茄綠原酸得率的影響 圖2結(jié)果顯示，綠原酸提取率隨著液料比的增加呈逐漸增大的趨勢(shì)，并在50 mL/g 附近得到最佳值（約4.57%），與液料比為10 mL/g 時(shí)的綠原酸提取率相比，提取率值增加了約2 倍。而在液料比60 mL/g附近的目標(biāo)物提取率略微降低，其原因可能是液料比過大導(dǎo)致黃果茄醇提取物增加了一些難溶物，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)節(jié)省成本等原因，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取液料比的最適宜值為50 mL/g[18]。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)黃果茄綠原酸得率的影響 由圖3 可知，提取時(shí)間較短或較長(zhǎng)均不利于黃果茄綠原酸的提取，最適合的時(shí)間值為60 min。提取時(shí)間較短時(shí)，綠原酸顯然不能夠充分溶出，而提取時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，樣品中可能會(huì)溶出更多的非目標(biāo)物，影響到目標(biāo)物的穩(wěn)定。最終選定最佳時(shí)間為60 min[20]。

2.1.4 超聲溫度對(duì)黃果茄綠原酸得率的影響 由圖4 可知，較低的超聲溫度不能夠保證足夠多的黃果茄綠原酸克服其周圍的環(huán)境阻力而溶出[26]，從而導(dǎo)致綠原酸提取率相對(duì)較低，而較高的溫度也會(huì)抑制綠原酸提取。溫度適當(dāng)時(shí)，傳質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)的增加會(huì)明顯增加提取效率，在40 ℃時(shí)可以得到最優(yōu)化的提取率值。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

以黃果茄綠原酸的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表3、表4，而由Design Expert V11 可以得到二次多元回歸方程：Y=–225.05+4.93α+1.15β+0.75γ+0.94δ–3.75×10^–3αβ+2.50×10^–4αγ+1.30×10^–3αδ–5.08×10^–3βγ–1.75×10^–4βδ–5.25×10^–4γδ–0.04α²–5.56×10^–3β²–4.09×10^–3γ²–0.01δ2，R²為0.9967。

由表4 可知，F(xiàn) 值為303.35，P<0.0001，說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦_(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P 為0.1115>0.05，說明此項(xiàng)不顯著。因此，選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?，其預(yù)測(cè)性好、誤差較小，可進(jìn)行進(jìn)一步的操作。一次項(xiàng)β、δ 和二次項(xiàng)α²、β²、γ²、δ²及交互項(xiàng)αβ、βγ 等8 項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，而其他項(xiàng)均不顯著。由比較F 值可知，響應(yīng)增加的順序?yàn)椋阂掖紳舛?超聲時(shí)間<超聲溫度<液料比。

黃果茄中綠原酸提取率的響應(yīng)面和交互作用見圖5。交互項(xiàng)αβ、βδ 等2 項(xiàng)呈現(xiàn)出橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡，交互作用大，但其他4 項(xiàng)的響應(yīng)面圖坡度較緩，交互作用不顯著。

2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面方程得到最佳工藝參數(shù)（64.7%乙醇濃度、55.8 mL/g 液料比、56.0 ℃超聲40.5 min）下目標(biāo)產(chǎn)物的提取率為6.81%。考慮到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的可操作性，將最優(yōu)化條件適當(dāng)調(diào)整為65%乙醇、60 mL/g 液料比、55 ℃下超聲40 min，則黃果茄綠原酸得率的3 次平均值為6.83%。此值與理論值非常接近，表明選擇的響應(yīng)面條件穩(wěn)定可行。

2.4 提取物體外抗氧化能力

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 如圖6 所示，與Vc 溶液的DPPH 清除率不同，提取液的DPPH 清除率在10～60 mg/L 范圍內(nèi)隨著濃度增加而增大，呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，且二者的IC₅₀值分別為18.4、55.7 mg/L。提取液中綠原酸等的酚羥基可提供質(zhì)子，因此對(duì)清除DPPH 有一定的效果。

2.4.2 ABTS 自由基清除能力 如圖7 所示，在5～30 mg/L 測(cè)試范圍內(nèi)，提取液的ABTS 清除率與其濃度線性相關(guān)性強(qiáng)，在提取液為30 mg/L 時(shí)，提取液的ABTS 清除率達(dá)到最大值，為65.5%。Vc 溶液和提取液的IC50 值分別為6.5、20.1 mg/L，因此Vc 溶液的清除率在測(cè)試范圍內(nèi)更好一些。

3 討論

植物內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的綠原酸主要來源于金銀花花蕾、杜仲葉、咖啡豆等，其提取物不僅可用于日用化工和醫(yī)藥等行業(yè)[27]，還可作為新型飼料添加劑用于畜禽生產(chǎn)[28]。用水、乙醇或二者混合物等作為溶劑可以促進(jìn)植物中綠原酸的提取，尤其添加醇水混合物提取物中的綠原酸與其天然狀態(tài)更接近，但僅添加水作溶劑，其高沸點(diǎn)會(huì)致使提取物雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)的純化[15]。超聲、微波和二者協(xié)同輔助作用均有利于目標(biāo)物的提取，但考慮到微波參與時(shí)，高介電常數(shù)的水更有利于微波吸收，而超聲輔助能夠顯著地克服萃取時(shí)間較長(zhǎng)、回收率較低等缺點(diǎn)[29]。此外，蒲公英葉和野菊花等作為綠原酸的新來源，提取率分別為3.92%和2.86%，尤其梔果中綠原酸提取率可高達(dá)5.68%[19， 30]。因此，本研究將超聲輔助醇提法應(yīng)用到黃果茄果中綠原酸的提取中，單因素實(shí)驗(yàn)確定液料比等因素對(duì)提取率的影響，還用響應(yīng)面法建立二次回歸模型，得到最佳工藝條件，后修正的條件為65%乙醇濃度、60 mL/g 液料比、55 ℃下超聲40 min，綠原酸產(chǎn)率可達(dá)到6.83%。

在亞健康狀況下，人體細(xì)胞代謝產(chǎn)生的自由基極可能會(huì)導(dǎo)致身體機(jī)能下降。植物粗提物中成分較為復(fù)雜，為了初步判斷其組分或類型等對(duì)自由基清除能力的影響，本研究選用了DPPH 和ABTS 等2 種抗氧化體系來進(jìn)一步評(píng)價(jià)黃果茄果醇提物的抗氧化性能[31]。黃果茄果醇提物顯然具有較好的抗氧化活性，其最佳工藝條件下提取液的DPPH 和ABTS 自由基清除能力的IC₅₀分別為55.7、20.1 mg/L。該實(shí)驗(yàn)可為探索黃果茄中綠原酸的藥理作用等應(yīng)用提供依據(jù)，還可為實(shí)現(xiàn)黃果茄中綠原酸作為藥用、保健品、畜禽生產(chǎn)等提供借鑒。