基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的胃腺癌銅死亡相關(guān)lncRNA預(yù)后模型構(gòu)建

胡夢奕 屠小龍 王永生 張婷素

作者單位：315010 寧波市中醫(yī)院腫瘤科

我國惡性腫瘤的新發(fā)病率約為456.88/14 萬，有300.3 萬例患者因此而死亡，其中胃癌的新發(fā)病率和死亡率均位居全國第三[1]。胃癌起病隱匿，早期常無明顯癥狀或體征，當(dāng)發(fā)現(xiàn)時常常已進(jìn)入晚期。腺癌是胃癌中最常見的病理類型，約占胃癌的90%以上[2]。手術(shù)仍是主要的治療手段，對于無法手術(shù)的患者，經(jīng)常使用姑息性化療，然而二線化療失敗后缺乏公認(rèn)的有效治療方案，5 年生存率不到10%，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[3]。因此，目前迫切需要構(gòu)建一個可靠的預(yù)后模型為胃腺癌的診療提供新思路。

銅死亡是最近提出的一種銅和線粒體依賴的獨立的細(xì)胞死亡機制，多個研究證實相較于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞對銅的需求更高，銅離子含量增加可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤血管生成等[4]，銅死亡將是癌癥研究的一個有前景的領(lǐng)域。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面發(fā)揮重要作用[5]。目前關(guān)于胃腺癌患者銅死亡相關(guān)lncRNA 特征及其與生存預(yù)后的相關(guān)性研究較少，本研究基于癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型，并對其腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、微衛(wèi)星狀態(tài)以及藥物敏感性等方面進(jìn)行探索分析，以期為胃腺癌的臨床治療提供新的思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載整理 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）中下載343 例胃腺癌組織和30 例正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和對應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，并提取其中l(wèi)ncRNA。根據(jù)目前已發(fā)表的文獻(xiàn)[6]獲得19 個銅死亡相關(guān)基因。運用Pearson 相關(guān)分析將上述19 個基因與TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取獲得的lncRNA 進(jìn)行共表達(dá)分析，獲得銅死亡相關(guān)lncRNA，篩選條件為|r|＞0.4，P＜0.01。

1.2 構(gòu)建銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型 對1.1 中確定的銅死亡相關(guān)lncRNA 采用單因素Cox 回歸分析，將其中P＜0.05 的銅死亡相關(guān)lncRNA 通過套索算法回歸進(jìn)行降維，然后采用多因素Cox 回歸分析篩選出最有預(yù)后價值的lncRNA 建立預(yù)后模型，并計算風(fēng)險評分（risk score，RS）。計算公式：RS=coefi×xi，其中coefi代表預(yù)后相關(guān)lncRNA 的相關(guān)系數(shù)，xi代表每個lncRNA 的表達(dá)量。以RS 中位值為分界點，將患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。

1.3 預(yù)后模型驗證 采用主成分分析將分組可視化，以判斷參與構(gòu)建模型的lncRNA 是否可以區(qū)分高低風(fēng)險組。采用對數(shù)秩檢驗，應(yīng)用Kaplan-Meier 曲線評估高低風(fēng)險組的生存差異。通過ROC 曲線評價預(yù)后模型的預(yù)測效能。

1.4 獨立預(yù)后分析及建立列線圖 對患者性別、年齡、組織學(xué)分級、臨床分期、RS 分別進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析，從而獲得獨立預(yù)后因子。對鑒定出的獨立預(yù)后因子進(jìn)行綜合分析，構(gòu)建列線圖預(yù)測胃腺癌患者1、3、5 年生存率，繪制列線圖的校準(zhǔn)曲線以評估其預(yù)測值與實際觀測值之間的一致性。

1.5 預(yù)后模型的TME 分析 利用ESTIMATE 算法推斷基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞的水平，估算每個樣本的腫瘤純度。從TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.comp-genomics.org/）獲得免疫浸潤樣本，應(yīng)用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORTABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL、EPIC 等計算方法分析免疫細(xì)胞在高低風(fēng)險組中的浸潤情況，以P＜0.05 為篩選條件提取有差異的免疫細(xì)胞繪制熱圖。對高低風(fēng)險組進(jìn)行免疫功能的單樣本基因集富集分析（single sample GSEA，ssGSEA），并評估兩組免疫功能、免疫檢查點基因的差異，繪制箱線圖。

1.6 預(yù)后模型的TMB、微衛(wèi)星狀態(tài)分析 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載胃腺癌患者的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，計算TMB。根據(jù)TMB 最佳閾點值將預(yù)后模型中的胃腺癌患者分為高、低TMB 兩組，采用對數(shù)秩檢驗方法，通過Kaplan-Meier 曲線比較高、低TMB 組患者生存差異，并對TMB 和RS 進(jìn)行聯(lián)合生存分析。比較高低風(fēng)險組中微衛(wèi)星狀態(tài)差異。

1.7 預(yù)后模型的免疫逃逸和藥物敏感性分析 應(yīng)用腫瘤免疫功能障礙和排斥（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）工具（http://tide.dfci.harvard.edu/）計算每個樣本的TIDE 評分，比較高低風(fēng)險組TIDE 評分的差異。使用oncoPredict 包預(yù)測高低風(fēng)險組患者對常見抗癌藥物的治療反應(yīng)，根據(jù)半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）進(jìn)行藥物敏感性預(yù)測，評估高低風(fēng)險組藥物敏感性的差異。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R 4.1.3 軟件及相關(guān)的R 程序包。計量資料兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定銅死亡相關(guān)lncRNA 并構(gòu)建預(yù)后模型 19 個銅死亡相關(guān)基因均在TCGA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有表達(dá)，經(jīng)過共表達(dá)分析后獲得434 個銅死亡相關(guān)lncRNA，通過單因素Cox 回歸分析進(jìn)一步篩選出20 個具有預(yù)后作用的lncRNA，再將上述lncRNA 進(jìn)行套索算法回歸和多因素Cox 回歸分析，最終確定10 個關(guān)鍵lncRNA 納入構(gòu)建預(yù)后模型。RS=（-0.390 7×AC016394.2 表達(dá)量）+（-0.852 8×LINC00571 表達(dá)量）+（0.495 9×LINC01094 表達(dá)量）+（0.559 1×LINC02863 表達(dá)量）+（0.382 0×HAGLR 表達(dá)量）+（1.102 9×SLC6A1-AS1 表達(dá)量）+（-0.555 5×AC108693.2 表達(dá)量）+（0.564 6×LINC01150 表達(dá)量）+（0.947 2×AC008915.2 表達(dá)量）+（-0.394 1×PINK1-AS 表達(dá)量）。

2.2 預(yù)后模型生存分析 高風(fēng)險組患者總生存期（overall survival，OS）、無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）均明顯短于低風(fēng)險組（均P＜0.01）（圖1A、B，見插頁）。納入構(gòu)建模型的10 個lncRNA，AC016394.2、LINC00571、AC108693.2、PINK1-AS 在高風(fēng)險組呈低表達(dá)，而LINC01094、LINC02863、HAGLR、SLC6A1-AS1、LINC01150、AC008915.2 呈高表達(dá)（圖1C，見插頁）。

圖1 銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型生存分析（A：高、低風(fēng)險組患者OS 的生存曲線；B：高、低風(fēng)險組患者PFS 的生存曲線；C：預(yù)后模型10 個lncRNA 表達(dá)熱圖）

2.3 驗證預(yù)后模型預(yù)測效能 主成分分析結(jié)果表明，該預(yù)后模型能夠很好地區(qū)分高、低風(fēng)險組（圖2A，見插頁）。應(yīng)用預(yù)后模型預(yù)測所有患者1、2、3 年生存率的AUC 分別為0.711、0.730 和0.759（圖2B，見插頁）。預(yù)后模型預(yù)測所有患者1 年生存率的AUC 大于性別、年齡、組織學(xué)分級、臨床分期、腫瘤TNM 分期，提示構(gòu)建的預(yù)后模型在生存預(yù)測上優(yōu)于以上臨床參數(shù)（圖2C，見插頁）。

圖2 預(yù)后模型驗證（A：預(yù)后模型主成分分析；B：預(yù)后模型預(yù)測所有患者1、3、5 年生存率的ROC 曲線；C：風(fēng)險評分和其他相關(guān)臨床參數(shù)的ROC 曲線）

2.4 預(yù)后模型的臨床價值 單因素和多因素Cox 回歸分析顯示年齡、臨床分期和RS 是預(yù)后的獨立因子（圖3A、B）?；谏鲜霆毩㈩A(yù)后因子，構(gòu)建列線圖預(yù)測患者1、3、5 年生存率，結(jié)果顯示患者1、3、5 年生存率分別為71.1%、32.0%和22.2%（圖3C），結(jié)合校準(zhǔn)曲線，表明預(yù)測的生存率與實際生存率基本一致（圖3D）。說明結(jié)合臨床特征和銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后特征的列線圖穩(wěn)定準(zhǔn)確，可用于胃腺癌患者的臨床觀察。

圖3 獨立預(yù)后因素評估及生存預(yù)測（A：單因素Cox 回歸分析評估風(fēng)險評分和相關(guān)臨床參數(shù)與OS 之間的關(guān)系；B：多因素Cox 回歸分析評估風(fēng)險評分和相關(guān)臨床參數(shù)與OS 之間的關(guān)系；C：基于獨立預(yù)后因子的胃腺癌患者1、3、5 年生存率的列線圖；D：列線圖對胃腺癌患者1、3、5 年生存率預(yù)測的校準(zhǔn)曲線）

2.5 不同風(fēng)險組的免疫差異分析 基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞在高風(fēng)險組患者中含量更高（圖4A，見插頁），高低風(fēng)險組間多種免疫細(xì)胞、免疫功能、免疫檢查點相關(guān)基因比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4BD，見插頁）。

圖4 高低風(fēng)險組的免疫細(xì)胞及免疫功能差異比較（A：高低風(fēng)險組中基質(zhì)成分、免疫細(xì)胞及綜合評分比較；B：高低風(fēng)險組中不同算法免疫細(xì)胞分布熱圖；C：基于ssGSEA算法，高低風(fēng)險組免疫功能差異的箱線圖；D：高低風(fēng)險組免疫檢查點基因表達(dá)差異的箱線圖）

2.6 高低風(fēng)險組的TMB 及微衛(wèi)星狀態(tài)分析 低風(fēng)險組TMB 高于高風(fēng)險組（圖5A，見插頁），且高TMB 患者預(yù)后優(yōu)于低TMB 患者（圖5B，見插頁）。根據(jù)中位RS與中位TMB，將人群劃分為高TMB+高風(fēng)險、高TMB+低風(fēng)險、低TMB+高風(fēng)險、低TMB+低風(fēng)險4 組，高TMB+低風(fēng)險患者表現(xiàn)出更顯著的生存優(yōu)勢（圖5C，見插頁）。低風(fēng)險組患者具有高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（high-level microsatellite instability，MSI-H）（圖5D、E，見插頁）。

圖5 高低風(fēng)險組患者TMB、微衛(wèi)星狀態(tài)的差異比較（A：高低風(fēng)險組TMB 比較；B：高、低TMB 患者OS 的生存曲線；C：高TMB+高風(fēng)險、高TMB+低風(fēng)險、低TMB+高風(fēng)險、低TMB+低風(fēng)險4 組間OS 的生存曲線；D：高低風(fēng)險組微衛(wèi)星狀態(tài)分布占比；E：風(fēng)險評分與微衛(wèi)星狀態(tài)相關(guān)性分析）

2.7 免疫治療分析和藥物篩選 低風(fēng)險組患者TIDE評分較低，提示低風(fēng)險組患者能從免疫治療中獲益更多（圖6A）。oncoPredict 包預(yù)測了胃腺癌患者對198 種抗癌藥物治療的IC50評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組患者對AZD8055、CZC24832、達(dá)沙替尼、WZ4003、XAV939 等藥物更敏感（圖6B-F），低風(fēng)險組患者對BMS-345541、二氫魚藤酮、地膽草新內(nèi)酯、ERK_6604、KRAS（G12C）Inhibitor-12、司美替尼、優(yōu)立替尼、長春新堿等更敏感（圖6G-N）。

圖6 TIDE 評分及藥物敏感性分析（A：高低風(fēng)險組患者TIDE 評分比較；B-N：高低風(fēng)險組患者藥物敏感性差異分析，其中B：AZD8055；C：CZC24832；D：達(dá)沙替尼；E：WZ4003，F(xiàn)：XAV939；G：BMS-345541；H：二氫魚藤酮；I：地膽草新內(nèi)酯；J：ERK_6604；K：KRAS(G12C)Inhibitor-12；L：司美替尼；M：優(yōu)立替尼；N：長春新堿）

3 討論

全球43.9%的胃癌新發(fā)病例和48.6%的胃癌致死病例發(fā)生在我國[7]，但是與日韓等國家不同，我國早期胃癌比例較低，僅占19.7%[8]，30%～40%的患者確診時已無根治性手術(shù)指征，預(yù)后較差[9]，盡管放化療、靶向、免疫等治療已廣泛用于胃癌治療，但胃癌患者的存活率仍然較低。

銅穩(wěn)態(tài)與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，其失衡引起的細(xì)胞毒性可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長和增殖的速率[10]。Tsvetkov 等[11]發(fā)現(xiàn)銅離子可以通過直接結(jié)合三羧酸循環(huán)中的脂質(zhì)酰化成分，導(dǎo)致脂質(zhì)?；鞍拙奂丸F硫簇蛋白丟失，引發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)并最終介導(dǎo)細(xì)胞死亡，這種新型的細(xì)胞死亡方式被定義為銅死亡。不同細(xì)胞死亡途徑的啟動者和效應(yīng)者是癌癥研究領(lǐng)域的熱點[12]，破譯癌細(xì)胞中銅死亡的生物學(xué)過程可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。lncRNA 參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活、核內(nèi)運輸、基因組表達(dá)、細(xì)胞分化等多種生物學(xué)功能[13]，隨著研究的深入，大量胃癌相關(guān)的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，它們通過多種信號通路參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，并可作為胃癌的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點[14]，但是仍有大量胃癌相關(guān)的lncRNA 未被發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于銅死亡相關(guān)基因的報道較少，也缺乏將銅死亡相關(guān)基因與lncRNA 結(jié)合起來預(yù)測胃癌患者預(yù)后的研究。

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫建立了銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型，該模型能較好地區(qū)分高低風(fēng)險人群，由此模型區(qū)分的高低風(fēng)險人群顯示出理想的生存差異，并在ROC 曲線中達(dá)到良好的AUC 值，與傳統(tǒng)的臨床預(yù)后因素相比，該模型對于胃腺癌預(yù)后預(yù)測的效能明顯提高。同時，該模型區(qū)分的高低風(fēng)險人群對藥物治療的反應(yīng)性存在差異，提示該模型在后續(xù)的治療方案選擇中或可作為參考。本模型共納入10 個lncRNA，根據(jù)lncRNA 在高低風(fēng)險組間差異表達(dá)的熱圖可以看出，模型中大多數(shù)lncRNA 傾向于在高風(fēng)險組中高表達(dá)，其中部分lncRNA 被報道與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如lncRNA-HAGLR 在胃癌細(xì)胞中上調(diào)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、導(dǎo)致氟尿嘧啶耐藥，并與預(yù)后不良相關(guān)[15]。在胃癌細(xì)胞中沉默PINK1-AS 可抑制胃癌細(xì)胞進(jìn)展，PINK1-AS 上調(diào)則產(chǎn)生相反的結(jié)果[16]，而在本研究的預(yù)后模型中，PINK1-AS 卻在高風(fēng)險組人群中表達(dá)較低。LINC01094 則已被證實可促進(jìn)卵巢癌[17]、胰腺癌[18]細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

免疫細(xì)胞是TME 的重要組成部分，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。免疫細(xì)胞在TME 中存在時有助于腫瘤進(jìn)展，癌細(xì)胞和近端免疫細(xì)胞之間的串?dāng)_最終導(dǎo)致促進(jìn)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的環(huán)境[20]。本研究顯示，低風(fēng)險組患者TME 免疫浸潤水平較低，兩組間免疫功能也存在差異。同時本研究還發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組患者基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞含量更高，這說明高風(fēng)險患者的腫瘤純度較低，低腫瘤純度與腫瘤進(jìn)展、耐藥以及預(yù)后等密切相關(guān)[21]，以上這些可能是導(dǎo)致兩組預(yù)后差異的重要因素。

傳統(tǒng)化療藥物治療晚期胃癌已在瓶頸期[22-23]，本研究探索了不同風(fēng)險組的潛在敏感藥物，這些藥物可能有助于緩解耐藥性和改善臨床結(jié)果，胃腺癌患者生存時間的差異或與他們對藥物的敏感性不同有關(guān)。胃癌治療正在經(jīng)歷從化療到靶向、再到免疫的變遷，晚期胃癌免疫治療相關(guān)的臨床研究也從三線向一線治療靠攏[24]。研究表明胃癌患者TMB 越高則預(yù)后越好，且高TMB 與免疫檢查點抑制劑（immunecheckpoint inhibitors，ICI）治療有效性、化療有效性相關(guān)[25]。MSI-H 是晚期胃癌ICI 有效治療的預(yù)測標(biāo)志物，MSI-H 型胃癌患者的生存期更長，有著更佳的預(yù)后[26]。本研究發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險組患者TMB 高于高風(fēng)險組，且呈現(xiàn)MSI-H，而且低風(fēng)險組患者多種免疫檢查點的表達(dá)量更低，以上結(jié)果表明低風(fēng)險組患者更能從ICI治療中獲益。

綜上所述，本研究通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫中胃腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)的挖掘，構(gòu)建了銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型，該模型能夠較好地預(yù)測患者預(yù)后。然而本研究仍有一定的局限性，如該預(yù)測模型是基于公共數(shù)據(jù)庫的回顧性數(shù)據(jù)所建立的，固有的選擇偏倚可能會影響其穩(wěn)健性，還需要更多的臨床數(shù)據(jù)來加以驗證；構(gòu)建模型納入的lncRNA 影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制有待進(jìn)一步實驗研究。