中醫(yī)藥干預(yù)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)在糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

代金玲，金 珠，李 雯

糖尿病周圍神經(jīng)病變是威脅糖尿病患者健康的重要隱患。在多民族成人2 型糖尿病的一項INTERPRET-DD 研究中，該病的總體患病率為26.71%［1］；據(jù)統(tǒng)計，2017 年世界范圍內(nèi)糖尿病患者大約有4.51 億， 預(yù)計到2045 年被確診患有糖尿病的人將增長到6.93 億［2］。患者出現(xiàn)手足部麻木、痛覺過敏、或?qū)ΨQ性燒灼感等與周圍神經(jīng)功能障礙相關(guān)的臨床表現(xiàn)，甚至雙足潰爛，最終可能導(dǎo)致截肢，這將大大降低患者的后期生存質(zhì)量［3-4］。研究表明，在糖尿病大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡被抑制的狀態(tài)下，其坐骨神經(jīng)的形態(tài)學(xué)損傷會明顯減輕，傳導(dǎo)速度也會得到提高［5］。在應(yīng)用中醫(yī)、中藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的相關(guān)研究中，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）被作為觀測細(xì)胞凋亡的“指南針”。

GRP78 是重要的熱休克蛋白70 伴侶蛋白， 主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，幫助多肽鏈正確折疊，防止不正確折疊的蛋白聚集［6］。在人類9 號染色體上，4532 個核苷酸編碼654 個氨基酸，組成GRP78。它是一種水溶性蛋白質(zhì)，其中的小塊疏水性片段對于識別未折疊蛋白質(zhì)，并將這些蛋白定向降解或重新折疊至關(guān)重要［7］。參與蛋白質(zhì)的合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷、維持細(xì)胞正常生理功能，是GRP78 的兩個主要功能［8］。這主要依靠位于氨基末端的ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ATP binding domain，ABD）和位于羧基末端的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（substrate binding domain，SBD）來完成［9］?，F(xiàn)代研究表明，GRP78 純合敲除的小鼠在胚胎發(fā)育第3.5 天表現(xiàn)出嚴(yán)重的增殖缺陷，GRP78 幫助蛋白正確合成，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保障細(xì)胞正常生理功能［10］。中醫(yī)藥可以通過調(diào)節(jié)GRP78 的表達(dá)水平， 影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑下游與凋亡相關(guān)因子的表達(dá)， 緩解糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡（圖1）［11］。

圖1 GRP78 結(jié)構(gòu)功能域示意圖

1 中醫(yī)藥干預(yù)GRP78 表達(dá)調(diào)節(jié)線粒體途徑誘導(dǎo)的糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡

機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞凋亡皆是由線粒體控制，因此線粒體被喻為細(xì)胞凋亡的控制中心。高血糖造成線粒體膜電位降低或者消失，膜電位的下降意味著膜的膜通透性變強(qiáng)，這時膜內(nèi)的細(xì)胞色素-C、Ca2+等促凋亡因子趁機(jī)流入到細(xì)胞質(zhì)中，大量的促凋亡因子活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）；在Caspase-3 被激活后，它可以引起后續(xù)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，這些反應(yīng)迫使DNA 斷裂，最終致使細(xì)胞死亡［12-14］。GRP78 既可以穩(wěn)定線粒體膜的通透性減少細(xì)胞凋亡，亦可以起到相反的作用增加細(xì)胞凋亡，通過中醫(yī)藥治療手段調(diào)節(jié)GRP78 的表達(dá)水平， 可以有效改善糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

1.1 穩(wěn)定線粒體膜的通透性減少細(xì)胞凋亡 GRP78 可以使線粒體膜的通透性恢復(fù)穩(wěn)定， 抑制細(xì)胞色素-C 流入到細(xì)胞質(zhì)中［15］。Caspase-3 活化的關(guān)鍵因子就是細(xì)胞色素-C，且在Caspase 級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中， 許多反應(yīng)皆是通過激活Caspase-3 實(shí)現(xiàn)的，Caspase-3 是Caspase 級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵下游［16］。黃芪甲苷可以下調(diào)Caspase-3 的表達(dá)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能， 進(jìn)而使背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡減少，緩解糖尿病大鼠周圍神經(jīng)的損傷［17］。已經(jīng)有研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物處理可以使大鼠雪旺細(xì)胞中GRP78 表達(dá)水平明顯下降，Caspase-3 活性明顯增強(qiáng)， 細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，而糖絡(luò)寧可以上調(diào)GRP78 的表達(dá)水平，降低Caspase-3 的表達(dá)，減輕坐骨神經(jīng)病理損傷［18-20］。

1.2 提高線粒體膜的通透性增加細(xì)胞凋亡 另外，GRP78亦可以反其道而行之。有研究表明，GRP78 的表達(dá)水平的升高可以增加氧自由基產(chǎn)生，提高線粒體膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素-C、Ca2+釋放以及capase-3 活化并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21］。糖尿病大鼠氧自由基會和不飽和脂肪酸在線粒體膜上發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起線粒體膜通透性增大，允許Ca2+通過線粒體膜釋放至細(xì)胞漿，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA 斷裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡［22］。筋脈通能夠顯著降低糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)GRP78 的表達(dá)， 減少氧自由基的生成，緩解坐骨神經(jīng)損傷［23-24］。

綜上，通過中醫(yī)藥手段干預(yù)GRP78 表達(dá)水平，可能成為阻斷線粒體途徑誘導(dǎo)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)。但因GRP78 對細(xì)胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，所以，在疾病發(fā)展的各個階段，其最佳表達(dá)水平還有待進(jìn)一探究。

2 中醫(yī)藥干預(yù)GRP78 表達(dá)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)的糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡

當(dāng)細(xì)胞暴露于高糖狀態(tài)下時，蛋白將不能正確折疊并且順利的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放，隨著這些不能正確折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中越積越多，將會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。在應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會通過未折疊蛋白反應(yīng)幫助這些不能正確折疊的蛋白恢復(fù)正確折疊或者直接把它們降解，未折疊蛋白反應(yīng)本質(zhì)上是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持自身穩(wěn)態(tài)的一種手段［25］。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身恢復(fù)的能力是有限的，隨著大量不正確折疊蛋白的長時間積累會導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)失敗， 并通過CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白 （CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP） 通路以及Jun 氨基末端激酶 （Junami noterminal kinases，JNK）通路引起細(xì)胞死亡［26］。

當(dāng)細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時，GRP78 與蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶 （Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）解離導(dǎo)致CHOP 表達(dá)增加，過表達(dá)的CHOP 通過增加Caspase-3 的表達(dá)誘使細(xì)胞發(fā)生凋亡［27-28］。研究表明，抑制PERK、CHOP 的表達(dá)，降低Caspase-3 的活性，可以顯著降低N2A 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對抗高葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性［29］。肌醇需要酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE1）也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感受器蛋白。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，GRP78 與IRE1 解離，IRE1 激活c-Jun 氨基末端激酶 （c-Junami no-terminal kinases，JNK），JNK 活化Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［30-31］。研究表明，JNK 信號通路參與乙醇醛誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)和ND7/23 神經(jīng)元細(xì)胞的死亡， 并且JNK活性被抑制后，ND7/23 神經(jīng)元細(xì)胞死亡得到顯著改善［32］。

2.1 幫助蛋白質(zhì)折疊減少細(xì)胞凋亡 GRP78 被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的“信號燈”，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，GRP78 表達(dá)水平顯著增加［33］。它以自身SBD 中富含賴氨酸的結(jié)構(gòu)域?yàn)槊浇椋c內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非正確折疊或尚未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過ABP與ATP 結(jié)合， 從ATP 水解中獲得能量幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)折疊并防止細(xì)胞凋亡［34-35］。草豆蔻有效成分生松素可以通過增加GRP78 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)未折疊蛋白折疊，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，三甲基氧是一種化學(xué)伴侶，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)正常折疊，抵消內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使糖尿病病程12 周大鼠保持正常的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度［36-37］。

2.2 抑制感受器蛋白過度激活減少細(xì)胞凋亡 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能正常的情況下，GRP78 是以非活性形式與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的無活性感受器蛋白結(jié)合， 所以當(dāng)GRP78 更多的與感受器蛋白結(jié)合時，其表達(dá)水平應(yīng)該是減少的，這與GRP78 為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的“信號燈”，GRP78 表達(dá)水平下降表明細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度得到緩解是一致的［9，38］。研究表明， 紅花黃色素能降低GRP78 表達(dá)，使高糖狀態(tài)下由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的小鼠足細(xì)胞死亡得到緩解［39-40］。另外，在降低高糖狀態(tài)下細(xì)胞GRP78表達(dá)水平緩解細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中， 感受器蛋白PERK、IRE1 以及下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)的物質(zhì)CHOP、JNK、caspase 家族成員的表達(dá)水平也會隨之下降［41-43］。因此認(rèn)為通過降低GRP78表達(dá)水平可減少細(xì)胞凋亡， 實(shí)質(zhì)上可能是通過促進(jìn)GRP78與感受器蛋白結(jié)合，抑制感受器蛋白過度激活導(dǎo)致下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，通過中醫(yī)藥手段增強(qiáng)GRP78與感受器蛋白的結(jié)合能力可能是糖尿病周圍神經(jīng)病變治療的新方向。

2.3 促進(jìn)GRP78 與caspase-12 結(jié)合減少細(xì)胞凋亡caspase-12 是caspase 家族的第1 個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)成員， 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，caspase-12 被特異性切割活化， 并進(jìn)一步觸發(fā)caspase-3 的活化，從而通過caspase 級聯(lián)反應(yīng)誘使細(xì)胞凋亡，當(dāng)caspase-12 的活性被特異性抑制以后，細(xì)胞凋亡顯著減少［44］。一項通過針刺保護(hù)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)的研究結(jié)果顯示，電針肺俞、脾俞、足三里等穴位減少caspase-12 在糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中的表達(dá)， 亦可以減輕坐骨神經(jīng)損傷［45］。有研究表明，GRP78 的異位表達(dá)可與caspase-7 和caspase-12 形成復(fù)合物，抑制caspase-12 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，糖絡(luò)寧可以上調(diào)GRP78 的活性， 從而使在糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)中檢測到的Caspase-12 的表達(dá)顯著降低，減緩高糖狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡（圖2）［46-47］。

圖2 GRP78 調(diào)節(jié)糖尿病周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡示意圖

3 總結(jié)與展望

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病周圍神經(jīng)病變是因消渴日久，氣陰俱損，血脈瘀痹所致，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。晉《針灸甲乙經(jīng)》云：“衛(wèi)氣不行則為不仁，經(jīng)曰：營衛(wèi)不能相將，三焦無所仰，身體痹而不仁?！北砻鳉馓摬蛔阋酝苿友哼\(yùn)行，三焦氣化不利，水谷精微運(yùn)行輸布障礙，無以溫養(yǎng)四肢百脈，導(dǎo)致肢體麻木不仁。近代醫(yī)家對于糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療也多以益氣養(yǎng)陰，和血化瘀為主［48-49］。由此可見，“虛”是該病發(fā)病的內(nèi)在原因，虛則無以濡養(yǎng)全身，導(dǎo)致氣血不足、血脈瘀阻、皮肉失養(yǎng)而痿痹，這與西醫(yī)所講的細(xì)胞凋亡不謀而合。通過中藥、針刺、湯劑等方法多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)GRP78 表達(dá)水平，抑制糖尿病狀態(tài)下最為重要的caspase 級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，最終影響疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。

糖尿病周圍神經(jīng)病變起病隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀或明顯缺陷， 就無法逆轉(zhuǎn)，10% ~ 18% 的患者在確診為糖尿病時，就被發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)病變，這表明神經(jīng)元損傷發(fā)生在疾病的早期階段［50-51］。因此，早期診斷、及時干預(yù)是預(yù)防糖尿病神經(jīng)病變發(fā)展的重要手段。GRP78 在大鼠血糖持續(xù)升高時，最先出現(xiàn)上升趨勢，對糖尿病周圍神經(jīng)病變的預(yù)防和治療皆有重要意義［52-54］。然而，縱觀目前的研究，大部分文獻(xiàn)僅提到通過中醫(yī)藥手段干預(yù)GRP78 表達(dá)水平對細(xì)胞凋亡有影響，并未說明其具體作用機(jī)制。因此，應(yīng)進(jìn)一步探索和研究其中的奧妙，以便更準(zhǔn)確的調(diào)控GRP78 的表達(dá)，將中醫(yī)藥診療方法更好的應(yīng)用于糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療。