lncRNA鋅指蛋白反義鏈 1對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的作用

王錦坡, 黃月紅, 陳運新, 陳治新, 陳豐霖

肝纖維化(liver fibrosis, LF)是肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的平衡被打破,導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的一種病理變化,出現(xiàn)在慢性肝病的所有類型中。若LF無法得到控制,將導(dǎo)致肝硬化或肝癌,甚至進展為肝衰竭乃至死亡。全球每年死于肝硬化的 100 萬例患者中,我國就占了約1/3[1]。研究[2-3]表明,若病因能得到有效控制,LF可逆轉(zhuǎn)。因此,尋找并探索新的治療方法逆轉(zhuǎn)或阻止LF已勢在必行。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度>200 nt的非編碼RNA,可參與許多疾病的病理和生理過程,包括細(xì)胞分化和發(fā)育、腫瘤的發(fā)生和遷移、器官和組織纖維化[4]。近年來,多項研究[5-9]結(jié)果表明,lncRNAs可在多種臟器的纖維化組織中異常表達,并參與纖維化的調(diào)節(jié),lncRNAs本身、其結(jié)合蛋白和靶基因均可能成為新的治療靶點,特別是在LF的發(fā)生過程中,已發(fā)現(xiàn)有多種異常表達的lncRNAs,如MALAT1、lnc-LFAR1、HIF1A-AS1和GAS5[6,8-9]等。

鋅指蛋白反義鏈1(zinc finger antisense 1, ZFAS1)是新發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA,定位在染色體20q13,位于含 NFX-1 型鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger NFX-1-type containing, Znfx1)啟動子區(qū)域的反義鏈上,是 3 種小核仁RNA的宿主[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn),ZFAS1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)患者中高表達,與肝內(nèi)、外轉(zhuǎn)移及HCC預(yù)后不良有關(guān)[12-13]。此外,ZFAS1參與多種臟器或組織纖維化的發(fā)展。YANG等[14]在肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)的研究中發(fā)現(xiàn),lncRNA ZFAS1通過 ZFAS1/miR-150-5p/SLC38A1軸參與PF的發(fā)生,并可能成為治療PF的新標(biāo)志物。本研究擬探討ZFAS1在LF組織和細(xì)胞中的表達情況及作用機制,為LF提供新的診斷及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞 6～8周齡雄性SPF級C57小鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006]。NCTC1469(CL-0407)、AML12(CL-0602)(上海普諾賽公司)。

1.2 試劑 AML12細(xì)胞專用培養(yǎng)基(上海普諾賽公司);轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1,美國Affinity公司);四氯化碳(CCl4,湖南匯虹試劑有限公司);橄欖油(上海源葉生物科技有限公司);Trizon Reagent、Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CWBIO,中國康為世紀(jì)公司);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA,美國Proteintech公司);Ⅰ型膠原α1(collagen Ⅰα1, Col1α1,美國Affinity公司);基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2,英國Abcam公司);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋公司);羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)測定試劑盒(南京建成公司)。

1.3 方法

1.3.1 LF模型構(gòu)建 小鼠按隨機數(shù)據(jù)表分為對照組(n=5)和模型組(n=5)。模型組小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10% CCl4(溶于橄欖油,2 mg/kg),每周 2 次,誘導(dǎo)小鼠LF模型。對照組小鼠腹腔注射相應(yīng)體積的橄欖油。于第6周末處死小鼠,留取肝組織樣品。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色(H-E染色) 4%多聚甲醇固定的肝組織經(jīng)梯度乙醇脫水,常規(guī)透明,浸蠟。石蠟包埋,切片。H-E染色,中性樹脂封片。鏡檢觀察肝組織病理變化。

1.3.3 天狼猩紅染色 取出肝組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟水化。用天狼星紅染色液染色1 h,流水沖洗;Mayer蘇木精染細(xì)胞核10 min,流水清洗;95%乙醇脫水(5～10 s脫水3次),二甲苯胺透明3次,后用中性樹膠封固。

1.3.4 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC) 組織切片放入65 ℃烤箱中烤2 h,在二甲苯共放置20 min,乙醇梯度脫水,純化水沖洗。用檸檬酸緩沖液抗原修復(fù),去除內(nèi)源性過氧化物酶。常規(guī)方法37 ℃非特異性封閉30 min。敷一抗α-SMA(1∶100)、Col1α1(1∶100)。敷二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,鹽酸乙醇分化,返藍;沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。使用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.5 ELISA檢測樣本的光密度(optical density, OD)值 小鼠肝組織分組處理后,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,在光徑 1 cm、波長550 nm條件下測各樣本的OD值,計算HYP含量。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 NCTC1469細(xì)胞按以下分組進行轉(zhuǎn)染:對照組、干擾對照組、hZFAS1-697、hZFAS1-539 和hZFAS1-624。當(dāng)細(xì)胞密度達70%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染劑量以 6 孔板 1 個孔計算,按照說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞進行檢測。各siRNA序列見表1。

表1 siRNA序列

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR) 收集對照組及模型組的肝組織細(xì)胞,用超純RNA提取試劑盒進行RNA提取,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對各組細(xì)胞中目的基因的表達進行檢測。收集上述各組NCTC1469細(xì)胞,用超純RNA提取試劑盒提取RNA,并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。檢測上述各組細(xì)胞中目的基因的表達。反應(yīng)如下:預(yù)變性95 ℃ 10 min→變性95 ℃ 10 s→退火58 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 30 s;40個循環(huán)。引物序列見表2。

表2 各引物序列信息及PCR反應(yīng)條件

1.3.8 Western-blot檢測蛋白含量 各組細(xì)胞加入裂解液裂解,獲得各組細(xì)胞的總蛋白,測定各組細(xì)胞蛋白含量。蛋白變性后,行凝膠電泳試驗,濕法轉(zhuǎn)膜。加一抗,4 ℃過夜孵育;加二抗,室溫孵育 1～2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Quantity one軟件分析各抗體條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 纖維化小鼠肝臟病理組織形態(tài)學(xué)改變 與對照組比較,模型組小鼠肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤增多,纖維結(jié)締組織生成明顯增多(H-E染色,圖1A);模型組小鼠肝組織內(nèi)膠原纖維蛋白合成增加,大量沉積(天狼猩紅染色,圖1B)。

A:H-E染色;B:天狼猩紅染色。模型組:CCl4處理組。

2.2 纖維化小鼠肝組織α-SMA 和 Col1α1 表達情況 肝組織IHC染色顯示,α-SMA陽性著色主要位于血管周圍和肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的細(xì)胞質(zhì),而Col1α1蛋白陽性著色主要位于肝組織纖維間隔(圖2A)。半定量結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組中的α-SMA、Col1α1蛋白表達水平明顯升高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。

α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;Col1α1:Ⅰ 型膠原α1;IHC:免疫組織化學(xué)。模型組:CCl4處理組。A:IHC染色檢測肝組織 α-SMA和Col1α1表達定位;B:半定量分析肝組織 α-SMA和Col1α1表達。與對照組比較,△:P<0.05。

2.3 纖維化小鼠肝組織中HYP的含量 與對照組比較,模型組小鼠肝組織的HYP含量明顯升高(P<0.05,圖3),提示CCl4處理可促進膠原產(chǎn)生。

HYP:羥脯氨酸。與對照組比較,△:P<0.05。

2.4 纖維化小鼠肝組織 lncRNA ZFAS1 表達 與對照組比較,模型組小鼠肝組織中l(wèi)ncRNA ZFAS1表達水平顯著增高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

ZFAS1:鋅指蛋白反義鏈1。與對照組比較,△:P<0.05。

2.5 小鼠肝細(xì)胞系NCTC1469和AML12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFAS1表達變化 為進一步探討lncRNA ZFAS1在LF進展中的作用,體外通過qRT-PCR檢測小鼠永生化正常肝細(xì)胞系NCTC1469和AML12細(xì)胞內(nèi)源性lncRNA ZFAS1表達水平。與AML12細(xì)胞比較,NCTC1469細(xì)胞中 lncRNA ZFAS1表達水平顯著升高(P<0.05,圖5)。因此,后續(xù)RNA干擾實驗將以NCTC1469細(xì)胞作為實驗對象。

ZFAS1:鋅指蛋白反義鏈1。與對照組比較,△:P<0.05。

2.6 lncRNA ZFAS1 敲低細(xì)胞株的構(gòu)建 在NCTC1469細(xì)胞分別脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同靶點的siZFAS1片段(siRNA-697、siRNA-539和siRNA-624),qRT-PCR檢測各組NCTC1469中l(wèi)ncRNA ZFAS1的表達(圖6),3 種siZFAS1片段均可有效抑制ZFAS1表達。與空白對照組比較,siRNA對照組lncRNA ZFAS1的表達無明顯變化(P>0.05);與陰性對照組(siRNA NC)比較,siRNA-697、siRNA-539和siRNA-624組的lncRNA ZFAS1表達均顯著下降,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中siRNA-539下降最為明顯,故后續(xù)干擾實驗以siRNA-539為干擾靶點。

qRT-PCR:實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng);ZFAS1:鋅指蛋白反義鏈1。Control組:空白對照組;siRNA NC組:陰性對照組;siRNA-697組:轉(zhuǎn)染siRNA-697組;siRNA-539組:轉(zhuǎn)染siRNA-539組;siRNA-624組:轉(zhuǎn)染siRNA-624組。與陰性對照組比較,△:P<0.05。

2.7 siRNA敲低lncRNA ZFAS1對肝細(xì)胞Col1α1、TGF-β1和MMP-2表達的影響 TGF-β1是公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子,研究中常用 5 ng/mL TGF-β1 處理細(xì)胞 24 h 模擬小鼠肝細(xì)胞纖維化模型[15],TGF-β1處理細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梭形或針尖樣,類似成纖維樣細(xì)胞,提示造模成功(圖7)。本研究通過Western-blot檢測NCTC1469細(xì)胞在有、無沉默lncRNA ZFAS1的基礎(chǔ)上對TGF-β1誘導(dǎo)后,NCTC1469表達纖維化相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化,評估lncRNA ZFAS1表達對LF的影響。與對照組比較,模型組(即TGF-β1處理組)的Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表達水平顯著升高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示TGF-β1處理上調(diào)NCTC1469細(xì)胞表達纖維化相關(guān)標(biāo)志蛋白Col1α1、TGF-β1和MMP-2;與模型組比較,ZFAS1干擾+模型組NCTC1469細(xì)胞表達Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白顯著下降,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖8),提示siRNA干擾抑制lncRNA ZFAS1表達后,可有效阻斷TGF-β1對肝細(xì)胞的促纖維化作用。

Col1α1:Ⅰ型膠原α1;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子-β1;MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶-2;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;ZFAS1:鋅指蛋白反義鏈1。A組:對照組;B組:模型組+TGF-β1處理組;C組:ZFAS1干擾對照組;D組:ZFAS1干擾對照+模型組;E組:ZFAS1干擾組;F組:ZFAS1干擾+模型組。A:免疫印跡法檢測各組Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表達情況;B:半定量分析各組Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白相對表達量。與對照組比較,△:P<0.05;與模型組比較,▲:P<0.05。

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)的小鼠LF模型,探討了lncRNA ZFAS1與LF發(fā)病的關(guān)系。與對照組比較,lncRNA ZFAS1在纖維化小鼠肝組織中表達明顯升高。進一步構(gòu)建體外LF細(xì)胞模型實驗發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA ZFAS1后,Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表達水平明顯下降,提示lncRNA ZFAS1在LF發(fā)展中的潛在作用及抑制ZFAS1后可能對LF具有治療作用。

LF是肝臟慢性損害的共有病理變化,其關(guān)鍵原因是 HSCs 被激活,HSCs體積增大,并和巨噬細(xì)胞等其他非實質(zhì)細(xì)胞一起分泌大量的TGF-β1,同時增加ECM的分泌。另外,激活的HSCs還可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細(xì)胞,這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達α-SMA和Col1α1等,負(fù)責(zé)ECM沉積和LF[16-17]。α-SMA 陽性是HSCs活化的標(biāo)志,而Col1α1是活化HSCs分泌的主要膠原蛋白之一。HYP是膠原的代謝產(chǎn)物,其含量的高低可反映肝組織中膠原含量,是判斷LF程度的另一重要指標(biāo)。由于CCl4誘導(dǎo)的LF模型與人類肝硬化的發(fā)病機制類似,且該模型穩(wěn)定,易于操作,因此筆者采用該模型。本研究結(jié)果表明,纖維化小鼠肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯,膠原纖維沉積明顯增多,HYP含量增加,α-SMA和Col1α1的表達也明顯升高。

分子研究的最新進展表明,lncRNAs導(dǎo)致多種病理生理機制,并在包括LF在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中充當(dāng)基因表達的重要調(diào)節(jié)者[7,18-20]。lncRNAs(如miRNAs和lncRNAs)的失調(diào)導(dǎo)致HSCs中的基因表達異常[21-22]。lncRNA ZFAS1最初通過上調(diào)細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial mesenchymal transition, EMT),被鑒定為一種新的腫瘤相關(guān)lncRNA[12,23-24]。最近,lncRNA ZFAS1的上調(diào)被證明通過促進ZEB2的表達誘導(dǎo)EMT和ECM沉積[25],表明lncRNA ZFAS1可能參與纖維化的進展。本研究還發(fā)現(xiàn),與對照組比較,lncRNA ZFAS1在LF模型小鼠中表達水平明顯升高,而抑制體外LF模型的lncRNA ZFAS1后,Col1α1、TGF-β1和MMP-2等蛋白的表達水平明顯下降,提示lncRNA ZFAS1可能參與小鼠LF的形成。

然而,關(guān)于lncRNA ZFAS1在LF發(fā)生、發(fā)展中可能的機制目前仍未明確。lncRNA可通過TGF-β信號通路、DNA甲基化和競爭性內(nèi)源性RNA的調(diào)節(jié)[5-9]及致死性脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的異常表達等機制在LF中發(fā)生作用[26]。最近,在纖維化相關(guān)疾病的組織中還檢測到鐵死亡生物標(biāo)志物,如ROS、丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶4,并發(fā)現(xiàn)鐵負(fù)荷可能加重肝臟病理,提示鐵死亡可能參與LF的過程[27-30],調(diào)節(jié)鐵死亡信號通路能改善LF和HSCs的活化[27]。而lncRNA ZFAS1可以促進鐵死亡[14],提示lncRNA ZFAS1可能通過鐵死亡參與LF過程。在后續(xù)的研究中,筆者將進一步探索其在LF中的作用機制。