母源性表達(dá)基因8在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用

王蓄楊, 陳王靈

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而誘發(fā)的慢性疾病,其特征是絕對(duì)或相對(duì)的胰島素缺乏及高血糖、血脂異常和神經(jīng)血管損傷[1]。這種損害可能影響患者體內(nèi)的每一個(gè)器官或系統(tǒng),并給患者的家庭和經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。DM視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是胰島素代謝異常而引發(fā)的眼部神經(jīng)及組織血管微循環(huán)改變,是1型和2型DM常見的微血管并發(fā)癥,也是DM患者致盲的重要原因[2]。臨床上,根據(jù)是否有視網(wǎng)膜新生血管生成,將DR分為非增殖性DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,病情隱匿且早期臨床癥狀不顯著,多數(shù)患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)疾病已進(jìn)入中期甚至更嚴(yán)重的階段[3]。因此,探究DR的發(fā)病機(jī)理、尋找有潛力的DR診斷標(biāo)記物,對(duì)臨床上DR的有效診斷及治療十分必要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄RNA分子,是轉(zhuǎn)錄、分化、侵襲、凋亡等多種生物過程的重要調(diào)控因子[4]。lncRNA正發(fā)展成為多種人類疾病新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。既往研究[5-7]報(bào)道,lncRNA 人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)在DM相關(guān)并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化及妊娠DM)中發(fā)揮促炎和促細(xì)胞凋亡的作用,因而具有成為DM相關(guān)并發(fā)癥治療靶點(diǎn)的潛力。lncRNA母源性表達(dá)基因8(maternally expressed gene 8,MEG8)最初被發(fā)現(xiàn)在肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和巨細(xì)胞瘤等多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)[8]。近年來(lái),有研究[9]發(fā)現(xiàn),MEG8在DM患者的血清中上調(diào),而在DM腎病患者中進(jìn)一步上調(diào)。另一項(xiàng)研究[10]表明,MEG8在妊娠DM患者血清中表達(dá)升高,且高水平的MEG8對(duì)妊娠DM具有較高的診斷價(jià)值。此外,高水平MEG8患者腎損傷發(fā)生率較高[11]。本研究旨在通過臨床及細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn),探討MEG8在DR中的表達(dá)情況及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 共納入 179 例受試者,其中DM 59 例,DR 60 例,健康人群 60 例。DM的診斷依據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American Diabetes Association,ADA)于 2017 年制定的標(biāo)準(zhǔn)[12]。DR的診斷參照ADA頒布的診斷指南[13]。選取同期在筆者醫(yī)院體檢的 60 例無(wú)DM病史和其他眼病家族史的健康人作為對(duì)照組。所有受試者均排除惡性腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病。本研究獲得中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并遵循《赫爾辛基宣言》中關(guān)于人體研究的倫理原則,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 采集所有受試者靜脈血,高速離心后分離血清,保存于-80 ℃冰箱中備用。人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)購(gòu)自上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海SIBCB公司)。培養(yǎng)條件:DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(30 mg/mL),于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育。通過高糖誘導(dǎo)HRMECs構(gòu)建體外增殖型DR細(xì)胞模型[14]。DR組采用30.0 mmol/L的高糖誘導(dǎo)細(xì)胞24 h,對(duì)照組采用5.5 mmol/L的高糖處理細(xì)胞24 h。將 2 組細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的 CO2潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種到12孔板中,培養(yǎng)過夜。使用Lipofectamine 2000將si-MEG8、si-NC、miR-15a-5p mimic、miR-NC、miR-15a-5p inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染到HRMECs細(xì)胞中。

1.2.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR) 采用TRIzol 法提取并純化血清和HRMECs細(xì)胞中的總RNA。采用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。利用miScript SYBR Green PCR試劑盒在Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System上進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。用GAPDH和U6分別對(duì)MEG8和miR-15a-5p進(jìn)行歸一化,并采用2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力。將HRMECs細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中。在每一個(gè)預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)0、24、48和72 h時(shí),向每孔中加入CCK-8溶液10 μL和新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液90 μL,暗處孵育2 h后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度(optical density, OD)值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 使用Transwell小室進(jìn)行HRMECs的細(xì)胞遷移分析。收集轉(zhuǎn)染完成的細(xì)胞,將其分散在200 μL無(wú)血清的培養(yǎng)基中,將細(xì)胞接種到上腔室。同時(shí)在下腔室中加入800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將上述Tranwell小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,用甲醇固定遷移至插入物下方的細(xì)胞,室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色。在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選取 5 個(gè)視野對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因 StarBase v2.0在線程序預(yù)測(cè)到MEG8和miR-15a-5p的3’-UTR區(qū)具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),采用熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MEG8和miR-15a-5p的相互作用。將MEG8的3’-UTR片段克隆到pGL3熒光素酶報(bào)告載體中,構(gòu)建野生型(wild-type, WT)報(bào)告載體MEG8 3’-UTR-WT和突變型(mutant-type, MUT)報(bào)告載體MEG8 3’-UTR-MUT。根據(jù)Lipofectamine 2000的產(chǎn)品說明,將上述載體與miR-15a-5p mimic/inhibitor、mimic/inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染HRMECs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞并利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定HRMECs細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 人口及臨床資料 所有受試人員的基線資料及臨床數(shù)據(jù)均見表1。3 組受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、收縮壓和舒張壓等指標(biāo)比較,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DM、DR組與對(duì)照組的糖化血紅蛋白、空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)和DM病程等指標(biāo)比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組受試者的基本信息

2.2MEG8在DM、DR組中的表達(dá)水平及對(duì)DM和DR的診斷價(jià)值分析 采用qRT-PCR檢測(cè)受試者血清中MEG8的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較,DM組血清MEG8的表達(dá)水平明顯增高(P<0.001)。DR組的MEG8水平較DM組和對(duì)照組更高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖1A)。建立ROC曲線評(píng)價(jià)MEG8對(duì)DM和DR的診斷價(jià)值,該曲線的曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.862,敏感度為85.5%,特異度為80.0%,初步表明MEG8對(duì)DM的診斷準(zhǔn)確性較高(圖1B)。另外,在DM和DR患者中,血清MEG8同樣展現(xiàn)出較高的臨床診斷價(jià)值,其ROC曲線的AUC為0.918,敏感度和特異度分別為83.3%和80.6%(圖1C)。

lncRNA:長(zhǎng)鏈非編碼RNA;MEG8:母源性表達(dá)基因8;DM:糖尿病;DR:糖尿病視網(wǎng)膜病變。A:血清MEG8的表達(dá)水平(與對(duì)照組比較,☆:P<0.001;與DM組比較,△:P<0.001);B:對(duì)照組、DM組MEG8表達(dá)水平的ROC曲線;C:DM、DR組MEG8表達(dá)水平的ROC曲線。

2.3 血清MEG8水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 為進(jìn)一步驗(yàn)證MEG8異常表達(dá)與DR的關(guān)系,采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估MEG8與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。MEG8水平與患者的病程、糖化血紅蛋白水平、空腹血糖水平及胰島素抵抗指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.01,表2)。

表2 lncRNA MEG8與部分臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.4MEG8的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響 本研究采用高糖誘導(dǎo)HRMECs細(xì)胞構(gòu)建體外DR細(xì)胞模型。與對(duì)照組比較,高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞的MEG8的表達(dá)水平顯著上調(diào),而細(xì)胞轉(zhuǎn)染MEG8小干擾RNA后明顯降低了高糖誘導(dǎo)所致的HRMECs細(xì)胞內(nèi)MEG8升高(P<0.001)。細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,高糖誘導(dǎo)能顯著促進(jìn)HRMECs細(xì)胞的增殖和遷移能力,抑制MEG8則可逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用(P<0.001,圖2)。

lncRNA:長(zhǎng)鏈非編碼RNA;MEG8:母源性表達(dá)基因8。A:細(xì)胞建模及轉(zhuǎn)染;B:細(xì)胞活力;C:細(xì)胞遷移。與對(duì)照組比較,☆:P<0.001;與高糖組比較,◇:P<0.001。

2.5MEG8直接靶向miR-15a-5p并負(fù)調(diào)控miR-15a-5p的表達(dá)水平 為進(jìn)一步確定MEG8在DR中的作用機(jī)制,采用StarBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-15a-5p與MEG8的3’-UTR有結(jié)合位點(diǎn),二者的互補(bǔ)序列見圖3A。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-15a-5p模擬物后,MEG8-3’-UTR-WT組的熒光素酶活性顯著降低,而轉(zhuǎn)染miR-15a-5p抑制劑后,MEG8-3’-UTR-WT組的熒光素酶活性增高(P<0.001,圖3B)。此外,細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-15a-5p模擬物或miR-15a-5p抑制劑均對(duì)MEG8-3’-UTR-MUT組的熒光素酶活性無(wú)影響。筆者初步確定miR-15a-5p是MEG8的直接靶基因,并受到MEG8的負(fù)調(diào)控。據(jù)此,對(duì)臨床受試者的血清miR-15a-5p的水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),DM組和DR組患者血清miR-15a-5p的表達(dá)與MEG8的表達(dá)趨勢(shì)相反,即DR患者血清miR-15a-5p水平顯著低于對(duì)照組和DM組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖3C)。Pearson相關(guān)系數(shù)提示,miR-15a-5p的表達(dá)與MEG8水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.001,圖3D)。另外,高糖誘導(dǎo)細(xì)胞后胞內(nèi)miR-15a-5p的表達(dá)水平明顯降低,而抑制MEG8的表達(dá)則相應(yīng)促進(jìn)miR-15a-5p的表達(dá)水平(P<0.001,圖3E)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),MEG8與miR-15a-5p在體外DR細(xì)胞模型中的關(guān)系。

pmirGLO Vector:熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體;PGK:磷酸甘油酸激酶;Luciferase:熒光素酶;MEG8:母源性表達(dá)基因8;3’-UTR:3’-非翻譯區(qū);WT:野生型;MUT:突變型;hsa-miR-15a-5p:人源miR-15a-5p;lncRNA:長(zhǎng)鏈非編碼RNA。A:MEG8與miR-15a-5p的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn);B:熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn);C:血清miR-15a-5p的表達(dá)水平;D:Pearson相關(guān)系數(shù)分析;E:細(xì)胞模型中miR-15a-5p的水平。與對(duì)照組比較,☆:P<0.001;與DM組比較,△:P<0.001;與高糖組比較,◇:P<0.001。

3 討 論

DR是導(dǎo)致失明的重要眼病之一。在DR發(fā)展過程中,可以發(fā)現(xiàn)許多特征性的視網(wǎng)膜異常,包括微動(dòng)脈瘤、印跡出血、棉毛斑和視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張等,這些被認(rèn)為是微血管損傷的特征[15]。目前,DR的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,一般認(rèn)為是由于糖代謝紊亂導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)受損所致[16]。多年來(lái),DNA、RNA和蛋白質(zhì)的功能失調(diào)被認(rèn)為是包括DM在內(nèi)的人類疾病發(fā)生和發(fā)展的主要因素。lncRNA 在DR中的作用是一個(gè)相對(duì)新的探索領(lǐng)域,對(duì)其在疾病發(fā)病過程中改變分子和細(xì)胞過程機(jī)制的研究至關(guān)重要。

lncRNAMEG8位于人類14號(hào)染色體上的δ樣1 同源脫碘酶-碘甲狀腺原氨酸3印記區(qū)內(nèi),已知該印記區(qū)對(duì)人類疾病具有重要的調(diào)控作用[17]。TERASHIMA等[18]的研究發(fā)現(xiàn),在人肺癌細(xì)胞株中,MEG8參與介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,對(duì)腫瘤的發(fā)生具有重要意義。ZHANG等[19]發(fā)現(xiàn),在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中,MEG8通過海綿作用miR-181a-5p促進(jìn)α-過氧化物酶體增殖物激活受體蛋白的表達(dá),從而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡,在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),MEG8在DM患者血清中表達(dá)升高,而在DR患者血清中表達(dá)進(jìn)一步升高。MEG8的表達(dá)水平與DR患者的病程等臨床指標(biāo)呈正相關(guān),且MEG8對(duì)DR表現(xiàn)出良好的診斷性能。這些結(jié)果提示,MEG8可能在DR的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

DR是引起視力損傷及失明的主要原因。大劑量葡萄糖的持續(xù)誘導(dǎo)可致HRMECs的凋亡增加,而HRMECs的增殖、遷移及誘導(dǎo)血管新生是DR進(jìn)展的重要因素[20]。高靜等[21]的研究表明,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的表達(dá)促進(jìn)了HRMECs的增殖和遷移能力,并抑制了HRMECs的凋亡水平,因而可能在DM導(dǎo)致的血管病變中發(fā)揮促進(jìn)作用,故本研究通過高糖誘導(dǎo)構(gòu)建增殖型DR的體外細(xì)胞模型。高糖誘導(dǎo)導(dǎo)致HRMECs內(nèi)MEG8的表達(dá)升高。同時(shí),高糖誘導(dǎo)促進(jìn)了HRMECs的增殖和遷移能力。下調(diào)MEG8的水平能明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。因此,抑制MEG8的表達(dá)水平可緩解高糖對(duì)HRMECs細(xì)胞功能的不利影響。

研究[22]顯示,lncRNA對(duì)miRNA的調(diào)控作用可通過控制miRNA的表達(dá)來(lái)影響其靶基因的表達(dá)量,其與miRNA結(jié)合從而阻止miRNA與其靶mRNA結(jié)合,作為miRNA的靶點(diǎn)或分子海綿而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)的作用。既往的研究[23]表明,心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction associated transcript, MIAT)作為miR-342-3p的分子海綿,通過與miR-342-3p的靶向結(jié)合,調(diào)控胱天蛋白酶1的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜周細(xì)胞(human peripheral retinal cellsh,HRPCs)的焦亡,從而發(fā)揮調(diào)控DR的作用。本研究中,靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-15a-5p與MEG8具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)并且二者為靶標(biāo)關(guān)系。此前,miR-15a-5p(又稱為miR-15a)被認(rèn)為對(duì)DM患者的胰島素抵抗有緩解作用[24]。GONG等[25]的研究發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織細(xì)胞中miR-15a-5p的表達(dá)水平顯著降低,且當(dāng)HRMECs細(xì)胞暴露于高糖環(huán)境中時(shí),上調(diào)的VEGF通過下調(diào)miR-15a-5p促進(jìn)了高糖對(duì)細(xì)胞的損傷;而MASTROPASQUA等[26]的研究發(fā)現(xiàn),DM患者無(wú)論是否有DR,循環(huán)miR-15a-5p水平均明顯降低。筆者推測(cè),在高糖處理的HRMECs中,上調(diào)的MEG8可能通過下調(diào)miR-15a-5p發(fā)揮了促進(jìn)HRMECs增殖和遷移的作用。

本研究的局限性在于:首先,樣本量較小,來(lái)源單一且均為筆者醫(yī)院周邊的人群,可能存在一些無(wú)法完全避免的選擇偏差;其次,在DR人群的納入中,未對(duì)這一部分人群進(jìn)行臨床分期,即病情嚴(yán)重與病情輕微的患者均在同組中,這也導(dǎo)致MEG8的表達(dá)情況與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系不能被直觀看到。因此,在后續(xù)的研究中,筆者會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及樣本來(lái)源,并針對(duì)DR的分期進(jìn)行基因表達(dá)與疾病分期關(guān)系的研究。

綜上所述,DM患者血清MEG8水平升高,而DR患者血清MEG8水平進(jìn)一步上升。異常升高的MEG8展現(xiàn)出對(duì)DR和DM良好的辨別能力,表明MEG8對(duì)DR具有較高的診斷準(zhǔn)確性,有成為DR診斷生物標(biāo)記物的潛力,對(duì)于DR的診斷可能具有一定的輔助作用。同時(shí),體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,MEG8直接靶向miR-15a-5p。在細(xì)胞水平上,高表達(dá)的MEG8可能通過靶向miR-15a-5p發(fā)揮促進(jìn)高糖誘導(dǎo)HRMECs的增殖和遷移的作用。