姜黃素通過(guò)Nrf2/HO-1通路抑制高糖誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞鐵死亡的作用

王艷, 孫照陽(yáng), 任欣會(huì), 趙志剛

糖尿病神經(jīng)病變(diabetic neuropathy, DN)是一種糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥,表現(xiàn)為肢體感覺(jué)異常、四肢遠(yuǎn)端麻木甚至疼痛等癥狀,分為糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和糖尿病周圍神經(jīng)病變等[1-2]。DN影響全球50%～60%的糖尿病患者[3],如得不到有效控制,可導(dǎo)致糖尿病足發(fā)生,影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。目前唯一能預(yù)防和緩解DN的措施是控制血糖[4]。神經(jīng)細(xì)胞損傷是DN的重要發(fā)病機(jī)制之一。鐵死亡(ferroptosis)是一種新發(fā)現(xiàn)的、由鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化累積引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡,在遺傳、生化和形態(tài)上不同于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡,其發(fā)生與核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)通路密切相關(guān)[5]。鐵死亡在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6-7]。從姜黃科姜黃屬植物(CurcumalongaL.)的根狀莖中分離得到的姜黃素(curcumin, Cur)可通過(guò)控制炎癥、氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑抑制DN的進(jìn)展[8-9]。本研究擬從鐵死亡的角度,觀察Cur對(duì)高糖誘導(dǎo)的Neuro-2a(N2a)小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞鐵死亡的抑制作用和其與Nrf2/HO-1通路的關(guān)系,探討Cur抑制DN的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng) N2a細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家模式與特色實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)。細(xì)胞復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)的MEM培養(yǎng)基(添加NaHCO31.5 g/L,丙酮酸鈉 0.11 g/L)及體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Cur(C110685)和Nrf2抑制劑(ML385,M304758)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1,Fer-1,HY-100579,美國(guó)MedChemExpress公司);CCK-8檢測(cè)試劑盒(L20356)、蛋白裂解液(P2213B)、PBS(W002358)和Western-blot試劑盒(W25681)(武漢靈思生物技術(shù)有限公司);TRIzol(15596026,美國(guó)Invitrogen公司);All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(QP076,廣州易錦生物技術(shù)有限公司);qPCR SYBR Green Master Mix(GK20308,上海捷瑞生物工程有限公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(A020-2-2)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)測(cè)定試劑盒(A006-1-1)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1-2)和總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測(cè)定試劑盒(A001-3-2)等生化檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司);細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0027,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);鐵離子濃度檢測(cè)試劑盒(ab83366)、兔抗谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗體(ab125066)、兔抗鐵蛋白重鏈多肽1(ferritin heavy chain 1, FTH-1)抗體(ab65080)、兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR-1)抗體(ab269513)(英國(guó)Abcam公司);兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)抗體(26864-1-AP)、兔Nrf2抗體(80593-1-RR)、兔HO-1抗體(10701-1-AP)、兔抗核纖層蛋白B1(nuclear lamina protein B1,Lamin B1)抗體(12987-1-AP)和兔抗GAPDH抗體(60004-1-Ig)(武漢Proteintech公司)。qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(CelCulture,新加坡Esco公司);熒光定量PCR儀(CFX96,美國(guó)BIO-RAD公司);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan SkyHigh,美國(guó)Thermo Fisher公司);迷你型垂直電泳儀(SE250/SE260,瑞典Cytiva公司)。

1.2 方法

1.2.1 高糖誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞損傷模型構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[3,10],將N2a細(xì)胞分為:正常對(duì)照組(Control組,含5.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng))、OS組(含5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng))和高糖組(HG組)。其中,HG組的葡萄糖終濃度分別設(shè)置為12.5、25.0、30.0和50.0 mmol/L。連續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選出最佳干預(yù)濃度。

1.2.2 Cur和Fer-1濃度篩選 N2a細(xì)胞按照4×104個(gè)/ 孔的細(xì)胞量接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,以Cur(終濃度分別為0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μmol/L)或Fer-1(終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μmol/L)處理N2a細(xì)胞6 h后,構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞損傷模型,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的活力變化,篩選出Cur和Fer-1的最佳作用濃度。

1.2.3 細(xì)胞分組和干預(yù) N2a細(xì)胞按照4×104個(gè)/孔的細(xì)胞量接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為:Control組、OS組、HG組、Fer-1組、Cur組、ML385組和Cur+ML385組。其中,Control組細(xì)胞以含5.5 mmol/L葡萄糖的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;OS組細(xì)胞以含5.5 mmol/L葡萄糖和24.5 mmol/L 甘露醇培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;HG組以含30.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Fer-1組、Cur組和ML385組分別以1.0 μmol/L的Fer-1、5.0 μmol/L 的Cur和10.0 μmol/L的ML385處理6 h后,再以30.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Cur+ML385組以5.0 μmol/L的Cur和10.0 μmol/L的ML385處理6 h后,再以30.0 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 N2a細(xì)胞按照1.2.3的步驟干預(yù)完成后,按照CCK-8檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明,每孔加入10 μL CCK-8溶液,將細(xì)胞置于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的光密度(optical density, OD)值。

1.2.5 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)檢測(cè)細(xì)胞增殖 N2a細(xì)胞按照1.2.3的步驟干預(yù)完成后,每孔細(xì)胞中加入總濃度為20 μmol/L的EdU工作液,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸去培養(yǎng)基,37 ℃預(yù)熱PBS漂洗3次,每次5 min,4%多聚甲醛室溫固定20 min,熒光顯微鏡拍照分析。

1.2.6 LDH、GSH、MDA和SOD檢測(cè) N2a細(xì)胞按照1.2.3的步驟干預(yù)完成后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基,按照LDH檢測(cè)試劑盒步驟,檢測(cè)LDH活性變化。同時(shí)收集各組細(xì)胞,超聲破碎,4 ℃、10 000 r/min(離心半徑10 cm)離心20 min,吸取細(xì)胞上清液,BCA蛋白定量試劑盒定量,按照GSH、MDA和SOD檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)GSH、MDA和SOD的活性變化。

1.2.7 鐵離子含量測(cè)定 N2a細(xì)胞按照1.2.3的步驟干預(yù)完成后,收集細(xì)胞,超聲破碎,3 000 r/min(離心半徑 20.4 cm)離心20 min,收集各組上清液。按照鐵離子檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)各組細(xì)胞中鐵離子的含量變化。

1.2.8 qRT-PCR檢測(cè)鐵死亡相關(guān)基因表達(dá) N2a細(xì)胞按照1.2.3的步驟干預(yù)完成后,棄去培養(yǎng)基,4 ℃預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞后,加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞提取各組細(xì)胞RNA,All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后以qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min→95 ℃ 15 s→54 ℃ 20 s→72 ℃ 15 s;38個(gè)循環(huán);65 ℃ 15 s→95 ℃ 30 s。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCT計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量,其中:

ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因

ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組

1.2.9 Western-blot檢測(cè) 各組干預(yù)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基,4 ℃預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞后,加入2 mL強(qiáng)度RIPA裂解后,4 ℃、10 000 r/min(離心半徑10 cm)離心20 min,吸取細(xì)胞上清即為每組細(xì)胞樣本全蛋白。細(xì)胞核蛋白按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒步驟進(jìn)行。獲得蛋白后,使用BCA蛋白定量試劑盒定量,每孔按照25 μg蛋白上樣,SDS-PAGE電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,分別以兔抗GPX4抗體(1∶1 200)、兔抗FTH-1抗體(1∶800)、兔抗TFR-1抗體(1∶500)、兔抗SLC7A11抗體(1∶800)、兔抗Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗HO-1抗體(1∶1 000)、兔抗GAPDH抗體(1∶10 000),4 ℃冰箱孵育12 h,PBS清洗3～5次,每次5 min,加入HRP酶標(biāo)兔抗抗體。加入ECL發(fā)光液后置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中掃描,通過(guò)Image J2X軟件分析相應(yīng)的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 Cur對(duì)N2a細(xì)胞活力的影響 與Control組比較,不同濃度的高糖均可顯著抑制N2a細(xì)胞活力(F=85.99,P<0.01)。30.0 mmol/L高糖刺激后,N2a細(xì)胞活力降低約50%,結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)[3,10],最終篩選出以30.0 mmol/L濃度的葡萄糖構(gòu)建高糖損傷模型(圖1A)。

與未加Fer-1比較,不同濃度的Fer-1均可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞活力(F=33.38,P<0.01),1.0 μmoL/L的Fer-1促進(jìn)N2a細(xì)胞活力的效果最佳(t=11.23,P<0.01),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以1.0 μmoL/L的Fer-1干預(yù)(圖1B)。

與未加Cur處理組比較,不同濃度的Cur均可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞活力(F=27.78,P<0.01),而5.0 μmoL/L 的Cur促進(jìn)N2a細(xì)胞活力的效果最佳(t=8.75,P<0.01),后續(xù)實(shí)驗(yàn)以5.0 μmoL/L的Cur干預(yù)(圖1C)。

與Control組比較,HG組的N2a細(xì)胞活力顯著降低(t=10.28,P<0.01);與HG組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞活力(t=5.34,P<0.01),Fer-1亦可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞活力(t=8.43,P<0.01);與ML385組比較,Cur可顯著抑制ML385對(duì)N2a細(xì)胞活力的作用(t=3.70,P=0.02,圖1D)。

OD:光密度;HG:高糖;Fer-1:鐵死亡抑制劑;Cur:姜黃素;ML385:Nrf2抑制劑;N2a:Neuro-2a。a組:Control組,5.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);b組:OS組,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng);c組:HG組,30.0 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);d組:Fer-1組,1.0 μmol/L Fer-1+HG;e組:Cur組,5.0 μmol/L Cur+HG;f組:ML385組,10.0 μmol/L ML385+HG;g組:Cur+ML385組,5.0 μmol/L Cur+10.0 μmol/L ML385+HG。A～C:CCK-8法檢測(cè)不同濃度的高糖、Fer-1和Cur對(duì)N2a細(xì)胞活力的影響;D:CCK-8法檢測(cè)Cur對(duì)N2a細(xì)胞活力的影響。2 組比較,△:P<0.05;△△:P<0.01;ns:P>0.05。

EdU檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),HG組N2a細(xì)胞增殖能力顯著降低;與HG組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞增殖,Fer-1亦可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞增殖;與ML385組比較,Cur可顯著抑制ML385對(duì)N2a細(xì)胞增殖的作用(圖2)。

HG:高糖;Fer-1:鐵死亡抑制劑;Cur:姜黃素;ML385:Nrf2抑制劑;EdU:5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷;N2a:Neuro-2a。Control組:5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);OS組:5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng);HG組:30.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);Fer-1組:1.0 μmol/L Fer-1+HG;Cur組:5.0 μmol/L Cur+HG;ML385組:10.0 μmol/L ML385+HG;Cur+ML385組:5.0 μmol/L Cur+10.0 μmol/L ML385+HG。

2.2 Cur對(duì)N2a細(xì)胞LDH、GSH、MDA和SOD的影響 與Control組比較,HG組N2a細(xì)胞中LDH活性(t=23.30,P<0.01)和MDA含量(t=28.12,P<0.01)均顯著增加,SOD的活性(t=13.54,P<0.01)和GSH含量(t=8.76,P<0.01)均顯著降低。與HG組比較,Fer-1可顯著抑制N2a細(xì)胞中LDH活性(t=6.84,P<0.01)、降低MDA含量(t=34.87,P<0.01),上調(diào)SOD活性(t=6.27,P<0.01)和GSH含量(t=13.58,P<0.01);與HG組比較,Cur可顯著抑制N2a細(xì)胞中LDH活性(t=7.26,P<0.01)、降低MDA含量(t=34.56,P<0.01),上調(diào)SOD活性(t=6.21,P<0.01)和GSH含量(t=13.12,P<0.01);與ML385組比較,Cur可顯著抑制ML385所導(dǎo)致的N2a細(xì)胞中LDH活性(t=16.23,P<0.01)和增加MDA含量(t=14.27,P<0.01),上調(diào)SOD活性(t=11.23,P=0.00)和GSH含量(t=8.12,P<0.01,表2)。

表2 N2a細(xì)胞中LDH、GSH、MDA和SOD含量比較

2.3 Cur對(duì)N2a細(xì)胞鐵離子含量的影響 與Control組比較,HG組N2a細(xì)胞中鐵離子的含量顯著升高(t=24.50,P<0.01);與HG組比較,Fer-1可顯著降低N2a細(xì)胞中鐵離子含量(t=26.67,P<0.01);與HG組比較,Cur可顯著抑制N2a細(xì)胞中鐵離子含量(t=22.24,P<0.01);與ML385組比較,Cur可顯著抑制ML385所導(dǎo)致的N2a細(xì)胞中鐵離子含量升高(t=14.47,P<0.01,表3)。

表3 各組N2a細(xì)胞中鐵離子質(zhì)量比的比較

2.4 Cur對(duì)N2a細(xì)胞鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 與Control組比較,HG組N2a細(xì)胞中GPX4(t=17.10,P<0.01)、FTH-1(t=10.28,P<0.01)和SLC7A11(t=14.04,P<0.01)mRNA表達(dá)水平顯著降低,TFR-1 mRNA 表達(dá)顯著升高(t=20.58,P<0.01);與HG組比較,Fer-1可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4(t=18.28,P<0.01)、FTH-1(t=8.43,P<0.01)和SLC7A11(t=23.92,P<0.01)mRNA表達(dá)水平,抑制TFR-1 mRNA表達(dá)(t=21.29,P<0.01);與HG組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4(t=13.30,P<0.01)、FTH-1(t=5.34,P<0.01)和SLC7A11(t=18.40,P<0.01)mRNA表達(dá)水平,抑制TFR-1 mRNA表達(dá)(t=16.07,P<0.01);與ML385組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4(t=3.70,P=0.02)、FTH-1(t=3.74,P=0.02)和SLC7A11(t=6.12,P=0.03)mRNA表達(dá)水平,抑制TFR-1 mRNA表達(dá)(t=5.03,P=0.04,圖3A)。

與Conrol組比較,HG組N2a細(xì)胞中GPX4(t=15.53,P<0.01)、FTH-1(t=14.28,P<0.01)和SLC7A11(t=18.42,P<0.01)蛋白表達(dá)水平顯著降低,TFR-1蛋白表達(dá)顯著升高(t=18.68,P<0.01);與HG組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4(t=9.34,P<0.01)、FTH-1(t=14.25,P<0.01)和SLC7A11(t=12.48,P<0.01)表達(dá)水平,抑制TFR-1表達(dá)(t=10.77,P<0.01);與ML385組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4(t=4.21,P=0.01)、FTH-1(t=5.59,P<0.01)和SLC7A11(t=4.18,P=0.01)表達(dá)水平,抑制TFR-1表達(dá)(t=4.33,P=0.01,圖3B)。

N2a:Neuro-2a;GPX4:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4;SLC7A11:溶質(zhì)載體家族7成員11;FTH-1:鐵蛋白重鏈多肽1;TFR-1:轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;HG:高糖;Fer-1:鐵死亡抑制劑;Cur:姜黃素;ML385:Nrf2抑制劑。a組:Control組,5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);b組:OS組,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng);c組:HG組,30.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);d組:Fer-1組,1.0 μmol/L Fer-1+HG;e組:Cur組,5.0 μmol/L Cur+HG;f組:ML385組,10.0 μmol/L ML385+HG;g組:Cur+ML385組,5.0 μmol/L Cur+10.0 μmol/L ML385+HG。A:qRT-PCR檢測(cè)分析Cur干預(yù)后,N2a細(xì)胞中GPX4、FTH-1、TFR-1和SLC7A11 mRNA表達(dá);B:Western-blot檢測(cè)分析Cur干預(yù)后,N2a細(xì)胞中GPX4、FTH-1、TFR-1和SLC7A11 等蛋白表達(dá)。2組比較,△:P<0.05;△△:P<0.01;ns:P>0.05。

2.5 Cur對(duì)Nrf2/HO-1通路表達(dá)的影響 與Control組比較,HG組N2a細(xì)胞中Nrf2(t=26.28,P<0.01)和HO-1(t=21.13,P<0.01)表達(dá)水平顯著降低;與HG組比較,Fer-1可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中Nrf2(t=18.35,P<0.01)和HO-1(t=15.76,P<0.01)表達(dá)水平;與HG組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中Nrf2(t=15.19,P<0.01)和HO-1(t=12.14,P<0.01)表達(dá);與ML385組比較,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中Nrf2(t=5.37,P<0.01)和HO-1(t=3.89,P=0.01)表達(dá)(圖4)。

N2a:Neuro-2a;Nrf2:核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2;Lamin B1:核纖層蛋白B1;HO-1:血紅素加氧酶1;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;HG:高糖;Fer-1:鐵死亡抑制劑;Cur:姜黃素;ML385:Nrf2抑制劑。a組:Control組,5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);b組:OS組,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng);c組:HG組,30.0 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);d組:Fer-1組,1.0 μmol/L Fer-1+HG;e組:Cur組,5.0 μmol/L Cur+HG;f組:ML385組,10.0 μmol/L ML385+HG;g組:Cur+ML385組,5.0 μmol/L Cur+10.0 μmol/L ML385+HG。A:Western-blot檢測(cè)電泳條帶;B:Nrf2相對(duì)表達(dá)量;C:HO-1相對(duì)表達(dá)量。2 組比較,△:P<0.05;△△:P<0.01;ns:P>0.05。

3 討 論

DN是糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。預(yù)計(jì)到2035年,糖尿病將影響全球約5.92億人,DN在1型或2型糖尿病患者中均可能發(fā)生,而以2型糖尿病患者為主[11-12]。氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和炎癥是DN發(fā)生、發(fā)展的重要途徑[13]?？刂蒲鞘悄壳拔ㄒ荒茴A(yù)防和延緩DN發(fā)生和進(jìn)展的有效措施[4],但對(duì)于大多數(shù)糖尿病患者來(lái)說(shuō),維持血糖正常是很困難的。Cur可通過(guò)控制炎癥、氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑抑制DN的進(jìn)展[8-9,14]。本研究發(fā)現(xiàn),Cur可顯著抑制高糖所導(dǎo)致的N2a細(xì)胞氧化損傷,促進(jìn)細(xì)胞活力。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的由鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化累計(jì)所引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[5]。鐵死亡的特征性變化包括氧化還原活性鐵的積累、抗氧化能力的降低和含磷脂的多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化等[15]。在高糖處理下,N2a細(xì)胞中鐵離子濃度、LDA活性和MDA含量顯著升高,GSH和SOD含量顯著降低。而Cur處理后,Cur可顯著抑制N2a細(xì)胞中鐵離子濃度、LDA活性和MDA含量,促進(jìn)GSH和SOD表達(dá)水平,說(shuō)明Cur可能通過(guò)調(diào)控鐵死亡抑制高糖對(duì)N2a細(xì)胞損傷。GPX4和SLC7A11被認(rèn)為是鐵死亡的重要生物標(biāo)志物,GPX4和SLC7A11的表達(dá)缺乏可能會(huì)導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生和GSH功能障礙[16-17]。TFR-1和FTH-1是參與鐵代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因,與鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]。在高糖處理下,N2a細(xì)胞中GPX4、SLC7A11和FTH-1的mRNA和蛋白的表達(dá)均被下調(diào),而TFR-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。而Cur處理后,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中GPX4、SLC7A11和FTH-1的mRNA 和蛋白的表達(dá),抑制TFR-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果表明,Cur抑制高糖誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞損傷與抗氧化系統(tǒng)(GPX4和SLC7A1)和鐵代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)(FTH-1和TFR-1)密切相關(guān)。

作為轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2在抗氧化中起關(guān)鍵作用,也被認(rèn)為是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子,是鐵儲(chǔ)存和運(yùn)輸相關(guān)的重要基因[20-21]。研究發(fā)現(xiàn),Nrf2/HO-1信號(hào)通路可作為一種內(nèi)源性抗氧化劑,通過(guò)拮抗多個(gè)器官中的氧化應(yīng)激損傷[22]。激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路可增強(qiáng)多種抗氧化劑的表達(dá),保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧自由基造成的損傷[23]。Nrf2通路的激活可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[24]。激活Nrf2/HO-1通路,可有效控制DN的發(fā)生和進(jìn)展[25]。在高糖處理下,N2a細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)均被下調(diào);而Cur處理后,Cur可顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá);Nrf2特異性抑制劑ML385可部分抑制Cur對(duì)N2a細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響,表明Cur抑制高糖所致N2a細(xì)胞鐵死亡可能與Nrf2/HO-1通路相關(guān)。

綜上所述,Cur可通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路,抑制高糖所致N2a細(xì)胞鐵死亡,促進(jìn)N2a細(xì)胞活力。但本研究?jī)H局限于細(xì)胞水平,后續(xù)還需以動(dòng)物模型深入研究Cur抑制DN發(fā)生、進(jìn)展與鐵死亡的關(guān)系,以及其影響Nrf2/HO-1通路的具體機(jī)制。