間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡對(duì)放射性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

陳池 蕭家麒 隋昕 張英才

放射治療（放療）是指用放射線破壞細(xì)胞DNA，使細(xì)胞失去活性與功能[1]。放療在癌癥的治療中被廣泛應(yīng)用[2-4]，據(jù)報(bào)道，在癌癥患者中，約2/3 的患者接受過(guò)放療[5]。肝臟對(duì)照射具有高敏感性[6-8]，照射后引起放射性肝損傷，可能進(jìn)一步發(fā)展成肝纖維化，甚至威脅患者生命，故而及時(shí)有效地治療放射性肝損傷尤為重要[9-12]。

有文獻(xiàn)指出，鐵死亡在放射性損傷的發(fā)病機(jī)制中有著十分重要的地位[13]。鐵死亡由依賴于鐵離子的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程誘導(dǎo)[13-14]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道鐵死亡在多個(gè)器官放射性損傷中的重要作用[14-16]。研究認(rèn)為，鐵死亡與多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[17-19]。鐵死亡在放射性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中的作用，筆者尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

目前，國(guó)際指南沒有明確放射性肝損傷的治療方法。近年來(lái)中藥被發(fā)現(xiàn)可緩解放射性肝損傷[20-21]，但無(wú)更高效穩(wěn)定的手段[22]。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle，MSC-EV）具有極好的修復(fù)潛能[23-24]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，MSC-EV 可以通過(guò)降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平來(lái)緩解疾病進(jìn)展[25]。有研究認(rèn)為，在照射致?lián)p過(guò)程中細(xì)胞外囊泡可以在受損器官（如肝、腎、骨髓等）中積累[26]，具體機(jī)制有待深入探究。本研究通過(guò)建立放射性肝損傷的動(dòng)物和細(xì)胞模型，探討MSC-EV 的保護(hù)作用及其機(jī)制，揭示其對(duì)放射性肝損傷的治療潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級(jí)雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)自廣東藥康公司。小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress 公司。該動(dòng)物研究方案經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，信使RNA（Messenger RNA，mRNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢塞維爾公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）偶聯(lián)Annexin-V 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司，二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）試劑購(gòu)于中國(guó)Cell Bank of Type Culture Collection 公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）4、鐵死亡抑制蛋白（ferroptosis suppressor protein，F(xiàn)SP）1 抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)于中國(guó)塞維爾公司。

1.2 急性動(dòng)物放射性損傷模型的建立與分組

取27 只6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量16～20 g。小鼠編號(hào)后系統(tǒng)隨機(jī)抽取編號(hào)分為空白組、造模組和MSC-EV 治療組（治療組），每組9 只。造模組和治療組小鼠均進(jìn)行一次性15 Gy X 線照射，治療組照射后1 h 尾靜脈注射含100 μg MSC-EV 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）200 μL，造模組相同時(shí)間尾靜脈注射同體積PBS?？瞻捉M不予照射處理，尾靜脈注射同體積PBS。照射后48 h 取小鼠的肝組織與血清置于-80 ℃冰箱保存，部分肝組織多聚甲醛溶液固定以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠肝細(xì)胞系放射性損傷模型建立與分組

將AML12 細(xì)胞分為對(duì)照組、照射組和MSC-EV干預(yù)組（干預(yù)組）。照射組與干預(yù)組均進(jìn)行一次性6 Gy X 線照射，干預(yù)組照射后1 h 給予含15 μg/mL MSC-EV 的PBS，照射組相同時(shí)間予同體積PBS。對(duì)照組不進(jìn)行照射處理，相同時(shí)間予同體積PBS。照射后15 h 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蘇木素-伊紅染色檢測(cè)肝組織病變情況 獲取肝組織，多聚甲醛溶液固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm，常規(guī)脫蠟、水化、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。酒精脫水和二甲苯透明、中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡觀察病變情況。肝損傷評(píng)分（Suzuki’s 組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)）方法參考文獻(xiàn)[27]。

1.4.2 TUNEL 染色檢測(cè)肝組織凋亡情況 組織固定后冰凍切片取出置于烘箱30 min，經(jīng)過(guò)0.2%Trizon 破膜20 min 并用PBS 潤(rùn)洗后，平衡樣本并以脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶孵育緩沖液孵育，PBS 潤(rùn)洗并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，抗熒光淬滅劑封片。烘干后觀察肝組織細(xì)胞凋亡情況。

1.4.3 DHE 染色檢測(cè)過(guò)氧化物水平 未固定的組織冰凍切片取出置于烘箱30 min，PBS 潤(rùn)洗后，以含DHE 熒光染劑的預(yù)熱PBS 溶液37 ℃孵育，PBS 潤(rùn)洗并DAPI 染核，抗熒光淬滅劑封片。烘干后觀察肝組織及肝細(xì)胞系ROS 產(chǎn)生水平。

1.4.4 血清轉(zhuǎn)氨酶水平檢測(cè) 取得小鼠血清后，采用全自動(dòng)化學(xué)分析儀酶法檢測(cè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）水平。

1.4.5 RT-qPCR 檢測(cè)炎癥因子及趨化因子水平 提取各組小鼠肝組織和AML12 細(xì)胞的總RNA，RT-qPCR 測(cè)定白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β、CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定GPX4、FSP1 蛋白表達(dá) 提取各組小鼠肝組織蛋白和AML12 細(xì)胞蛋白，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育90 min，置于化學(xué)發(fā)光儀中曝光顯影。

1.4.7 MDA 含量測(cè)定 肝組織及細(xì)胞MDA 含量測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.8 碘化丙啶染色測(cè)定細(xì)胞凋亡情況 AML12 細(xì)胞于24 孔板鋪板，PBS 潤(rùn)洗后，取碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染劑1:1 000 處理30 min，染核后顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.9 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔測(cè)定 AML12 細(xì)胞于24 孔板鋪板按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行mPTP 染色處理，染色30 min，染核后顯微鏡下觀察線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是否異常打開，并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 照射誘導(dǎo)小鼠放射性肝損傷

利用15 Gy X 射線照射小鼠48 h 后，與空白組比較，造模組小鼠血清AST、ALT 水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，均為P＜0.05）。RT-qPCR結(jié)果顯示，造模組小鼠肝組織IL-1β、CXCL10 和TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量較空白組均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B，均為P＜0.05）。MDA 含量測(cè)定結(jié)果顯示，與空白組比較，造模組小鼠肝組織MDA含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C，P＜0.05）。肝組織HE 染色結(jié)果顯示，造模組小鼠肝組織大部分肝細(xì)胞體積變大、腫脹，邊緣不清，胞質(zhì)氣球樣變性，染色變淺，部分肝細(xì)胞核固縮，間質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1D），且肝損傷評(píng)分較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1E，P＜0.05）。TUNEL 染色結(jié)果顯示，造模組的細(xì)胞凋亡率較空白組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1F、H，P＜0.05）。DHE 染色結(jié)果顯示，造模組的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1G、I，P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，造模組小鼠肝組織GPX4、FSP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白組下降（圖1J）。

2.2 MSC-EV 通過(guò)減輕鐵死亡改善小鼠放射性肝損傷

利用15 Gy X 線照射小鼠1 h 后予尾靜脈注射MSC-EV，處理48 h 后，治療組小鼠的血清AST、ALT 水平均低于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，均為P＜0.05）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，治療組的IL-1β、CXCL10 和TGF-β 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量較造模組均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B，均為P＜0.05）。MDA 檢測(cè)結(jié)果顯示，治療組的MDA含量較造模組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C，P＜0.05）。HE 染色結(jié)果示，與造模組比較，治療組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞邊緣仍不清，肝細(xì)胞腫脹、空泡化有明顯改善，染色稍變淺，但仍未恢復(fù)正常形態(tài)，炎癥浸潤(rùn)減輕（圖1D），且肝損傷評(píng)分更低（圖1E，P＜0.05）。TUNEL 染色結(jié)果顯示，治療組的細(xì)胞凋亡率較造模組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1F、H，P＜0.05）。DHE 染色結(jié)果顯示，治療組的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平較造模組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1G、I，P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，治療組的GPX4 和FSP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較造模組增多（圖1J）。

圖1 MSC-EV 對(duì)小鼠肝臟放射性損傷的保護(hù)作用Figure 1 Protective effect of MSC-EV on liver radiation injury in mice

2.3 照射誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞放射性損傷

利用6 Gy X 線照射細(xì)胞后，PI 染色結(jié)果顯示，照射組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A、C，P＜0.05）。DHE 染色結(jié)果顯示，照射組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B、D，P＜0.05）。mPTP 染色結(jié)果顯示，照射組的mPTP 熒光強(qiáng)度較對(duì)照組減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E、F，P＜0.05），表明照射導(dǎo)致線粒體通透性孔道異常開放，線粒體功能破壞。RT-qPCR 結(jié)果顯示，照射組的IL-1β、TGF-β、IL-6 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2G，均為P＜0.05）。MDA 檢測(cè)結(jié)果顯示，照射組AML12細(xì)胞內(nèi)MDA 水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2H，P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，照射組AML12 細(xì)胞內(nèi)GPX4、FSP1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組減少（圖2I）。

2.4 MSC-EV 通過(guò)減輕鐵死亡改善AML12 細(xì)胞的放射性損傷

利用6 Gy X 射線照射后予以MSC-EV 干預(yù)，處理15 h 后，PI 染色結(jié)果顯示，與照射組比較，干預(yù)組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A、C，P＜0.05）。DHE 染色結(jié)果顯示，干預(yù)組AML12細(xì)胞內(nèi)ROS 水平較照射組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B、D，P＜0.05）。mPTP 結(jié)果顯示，干預(yù)組mPTP 熒光強(qiáng)度水平較對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E、F，P＜0.05），表明MSC-EV 干預(yù)可以減輕照射導(dǎo)致的AML12 細(xì)胞線粒體孔道異常開放和功能紊亂。RT-qPCR 結(jié)果顯示，干預(yù)組IL-1β、IL-6 及TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量較照射組均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2G，P＜0.05）。MDA 含量測(cè)定結(jié)果顯示，干預(yù)組的MDA 含量較照射組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2H，P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，干預(yù)組的抗過(guò)氧化酶GPX4、FSP1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量較照射組均增多（圖2I）。

圖2 MSC-EV 對(duì)AML12 細(xì)胞放射性損傷的保護(hù)作用Figure 2 Protective effect of MSC-EV on liver radiation injury in AML12 cell

3 討論

照射損傷肝細(xì)胞的主要機(jī)制是導(dǎo)致DNA 鏈斷裂和大量自由基產(chǎn)生，從而影響肝細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致炎癥與肝功能失常。大多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為放射性肝損傷的發(fā)病時(shí)間通常在放射治療后4～8 周，甚至更久[28]，病理特征是肝靜脈閉塞征，具體為靜脈阻塞、小葉結(jié)構(gòu)扭曲、實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞竇性充血以及腹腔積液、疲勞和肝酶升高等臨床癥狀。但近年已有文獻(xiàn)報(bào)道，在照射后72 h 肝臟過(guò)氧化物產(chǎn)生明顯增高，脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)已經(jīng)開始出現(xiàn)異常[29]，故而研究放射性肝損傷的早期損傷特點(diǎn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療尤為重要。肝組織HE染色是評(píng)判肝臟的結(jié)構(gòu)是否完整、肝細(xì)胞形態(tài)是否正常的重要手段，有研究報(bào)道，照射可引起肝臟的病理學(xué)改變，HE 染色可見肝中央靜脈擴(kuò)張充血，胞質(zhì)溶解、消失、淡染[30]。AST、ALT 作為反映肝功能的最敏感的指標(biāo)，在照射后明顯增高[31]。有文獻(xiàn)報(bào)道，照射可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡比例增高，與凋亡有關(guān)的分子水平明顯改變[32]。照射可損傷多種分子，如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，過(guò)程中產(chǎn)生大量ROS，使氧化還原體系失衡，進(jìn)而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激[33]。mPTP 是一種由線粒體內(nèi)外膜一起組成的非特異性通道，在細(xì)胞死亡過(guò)程中參與有害物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。線粒體損傷可導(dǎo)致孔道打開，線粒體內(nèi)熒光染料鈣黃綠素被進(jìn)入線粒體的重金屬淬滅。作為產(chǎn)生ROS 最多的部位，線粒體在照射導(dǎo)致的損傷中發(fā)生了功能性損傷[34]。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，唯一不同是HE 染色可見照射組肝細(xì)胞胞質(zhì)腫脹，肝竇大部分消失，未觀察到肝中央靜脈的內(nèi)徑變化?？赡苁且?yàn)楸狙芯咳〔臅r(shí)間早，肝細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為水腫，導(dǎo)致肝竇消失，血管內(nèi)徑未增大甚至有縮小的趨勢(shì)。

細(xì)胞外囊泡是一種脂質(zhì)雙分子層膜顆粒，通過(guò)囊泡包裹的內(nèi)容物（包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸）在治療細(xì)胞損傷過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。目前還沒有研究直接證明MSC-EV 可以減輕放射性肝損傷，但近年有研究指出其可治療其它器官的放射性損傷，如MSC-EV可以減輕照射引起的放射性肺損傷，包括血管損傷、炎癥、纖維化，以及通過(guò)下調(diào)ATM/P53/P21 信號(hào)來(lái)降低輻射誘導(dǎo)的DNA 損傷水平[35]。已有文獻(xiàn)報(bào)道MSC-EV 可以通過(guò)減輕ROS 來(lái)緩解疾病進(jìn)展[25]，而ROS可以誘導(dǎo)鐵死亡。鐵死亡是一種細(xì)胞死亡的形式，不同于凋亡，它由依賴于鐵離子的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程誘導(dǎo)[13,36]。真核細(xì)胞在鐵離子與過(guò)氧化物的作用下，可導(dǎo)致細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸磷脂發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物如果無(wú)法及時(shí)得到清除，過(guò)度累積可損害細(xì)胞正常功能，并且該過(guò)程也使細(xì)胞膜失去其正常的結(jié)構(gòu)與功能，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[37-39]。許多研究證明，照射可導(dǎo)致肝臟的抗氧化酶體系紊亂，脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積[9,40]。本研究結(jié)果與報(bào)道相符，照射導(dǎo)致抗氧化酶GPX4、FSP1 水平均下降，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平升高，引起鐵死亡，MSC-EV 治療均可緩解這些改變，減少鐵死亡。本研究結(jié)果表明MSC-EV 改善放射性肝損傷的機(jī)制可能是通過(guò)減少鐵死亡。

綜上所述，MSC-EV 對(duì)照射導(dǎo)致的肝功能障礙、肝臟病理?yè)p傷、肝細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激均有顯著的改善作用，其機(jī)制可能是通過(guò)減少鐵死亡，提高抗氧化水平，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生。但本實(shí)驗(yàn)仍存在不足，未進(jìn)一步研究MSC-EV 具體導(dǎo)致抗氧化酶降低的分子機(jī)制，未抑制鐵死亡以觀察照射對(duì)肝臟的影響，未來(lái)仍需進(jìn)一步研究。