重組人HMGB1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞成血管作用的機(jī)制初探

鄧金濤 許文斌 任建華 張文輝 王哲 梁堂釗

由創(chuàng)傷、感染及腫瘤導(dǎo)致的大段骨缺損是骨損傷后常見并發(fā)癥，存在治療難度大、自身愈合不佳等問題，是骨科醫(yī)師面臨的主要挑戰(zhàn)[1]。臨床上常用的治療方法包括自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植等方式[2-4]。但這些常規(guī)治療方式伴隨著各種問題，如自體來源骨組織有限及移植部位感染、血管神經(jīng)損傷等[5-8]。此外，同種異體骨的使用也會受到骨源有限、供體部位感染、異常骨吸收等嚴(yán)重并發(fā)癥的限制而無法大規(guī)模使用[9]。目前臨床上常用的生物材料由于骨誘導(dǎo)能力差、組織相容性低等缺點(diǎn)無法與人體骨組織形成有效的結(jié)合[10-11]。

近些年3D 打印的生物支架在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，通過3D 打印的方式，將一些生物材料按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的結(jié)構(gòu)構(gòu)建移植替代物，有望成為骨缺損治療的新方向[12]。遺憾的是目前3D 打印的生物支架由于缺少合適的生物活性物質(zhì)，無法在損傷部位形成合適的血管網(wǎng)，也限制了其在臨床上的應(yīng)用。

高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一類在真核細(xì)胞核內(nèi)常見的核蛋白，多種干細(xì)胞均可分泌，參與多種生理、病理活動，包括炎癥、血栓形成、組織再生等[13-16]。已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在炎癥或者缺氧條件下，HMGB1 可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）遷移、成骨分化[17]。但是生理或病理?xiàng)l件下的HMGB1 濃度較低，治療效果不佳。Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo 信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，通過入核發(fā)揮作用，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡的調(diào)控[18-19]，是再生領(lǐng)域研究的熱門蛋白[20]。YAP 參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[21]，除此之外，在干細(xì)胞增殖分化、血管再生領(lǐng)域中也發(fā)揮著重要作用[22-23]。本文將外源高濃度的重組人HMGB1（recombinant human HMGB1，rhHMGB1）蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，探索高濃度rhHMGB1 蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞遷移及成血管活性物質(zhì)釋放能力的影響，為后期將rhHMGB1 蛋白搭載至生物支架進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)搭載rhHMGB1 支架臨床治療大段骨缺損積累充足的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑

人骨髓MSC、內(nèi)皮細(xì)胞均購自廣州吉妮歐公司。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit，CCK）-8、多聚甲醛溶液、結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天公司。一抗[血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、CD31、YAP、磷酸化YAP（p-YAP）、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α]、二抗、熒光標(biāo)記二抗、內(nèi)參購自江蘇親科生物公司。RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊公司，rhHMGB1 蛋白購自北京義翹神州公司。本實(shí)驗(yàn)研究方案已通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

MSC、內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含有青霉素-鏈霉素以及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合至90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合消化液，當(dāng)細(xì)胞變圓后迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，收集細(xì)胞。離心，棄去上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，隔日換液。

實(shí)驗(yàn)分組：將內(nèi)皮細(xì)胞分為對照組、MSC 上清組及rhHMGB1 組。對照組使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；MSC 上清組使用MSC 的培養(yǎng)上清對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2 μg/mL rhHMGB1 對內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用較明顯，因此rhHMGB1 組選擇2 μg/mL rhHMGB1 蛋白來處理內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSC 上清提取 MSC 在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，去除原有培養(yǎng)基，用PBS 清洗，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h 后，收集細(xì)胞上清，800×g，4 ℃離心10 min，小心吸取上清，10 000×g，4 ℃離心20 min，將上清分裝到無菌的1.5 mL 離心管中，-80 ℃保存。

1.3.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 對數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞以830 個(gè)/孔接種于96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞60%融合后棄去上清，各組細(xì)胞孵育48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞增殖率。

1.3.3 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將內(nèi)皮細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中重懸后加入Transwell 上室，并補(bǔ)足無血清培養(yǎng)基500 μL，在下室中根據(jù)分組加入不同的培養(yǎng)基500 μL，隨即將上室放入下室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、6、12、18、24 h 后，將上室取出，在下室加入500 μL 多聚甲醛溶液，固定20 min，隨后加入600 μL 結(jié)晶紫，染色10 min。染色結(jié)束后，清洗上室2 次，用棉花輕輕拭去小室內(nèi)膜表面的細(xì)胞，自然晾干后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），并通過2-ΔΔCt法對VEGF、CD31、HIF-1α 及YAP 的信使RNA（messenger RNA，mRNA）相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法 提取內(nèi)皮細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進(jìn)行一抗4 ℃過夜孵育（稀釋比為1∶1 000），二抗室溫孵育2 h（稀釋比為1∶5 000），清洗后使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像，檢測VEGF、CD31、YAP、HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量。

1.3.6 免疫熒光 將內(nèi)皮細(xì)胞用多聚甲醛溶液固定30 min，PBS 清洗后加入TritonX-100 透化，接著使用山羊血清封閉30 min。加入一抗（YAP、p-YAP，稀釋比為1∶100）4 ℃過夜。清洗后二抗（稀釋比為1∶100）室溫避光孵育1 h，清洗后加入防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。使用YAP/p-YAP 的比值來反映出YAP 的入核率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8 和Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhHMGB1 對內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，P＞0.05）。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，MSC上清組內(nèi)皮細(xì)胞遷移率有所提高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B、C，P＞0.05）；與對照組比較，rhHMGB1 組內(nèi)皮細(xì)胞遷移率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B、C，P＜0.05），且細(xì)胞遷移率隨著時(shí)間的延長而增加。

圖1 rhHMGB1 對內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響Figure 1 Effect of rhHMGB1 on proliferation and migration of endothelial cells

2.2 rhHMGB1 對內(nèi)皮細(xì)胞釋放成血管活性物質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果見圖2。與對照組比較，MSC上清組VEGF 蛋白相對表達(dá)量增加，rhHMGB1 組的VEGF 和HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，rhHMGB1 組的VEGF 和CD31 mRNA 相對表達(dá)量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。與MSC 上清組比較，rhHMGB1 組的CD31 mRNA 相對表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 rhHMGB1 對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、HIF-1a、CD31、YAP 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of rhHMGB1 on the expression levels of VEGF,HIF-1a,CD31 and YAP mRNA and protein in endothelial cells

2.3 rhHMGB1 對YAP 入核的作用

免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，MSC 上清組p-YAP 蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），YAP/p-YAP 比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，P＞0.05）。與對照組比較，rhHMGB1組的YAP和p-YAP蛋白表達(dá)均增多，YAP/p-YAP 比值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，均為P＜0.05）。與MSC 上清組比較，YAP 蛋白表達(dá)增多，YAP/p-YAP 比值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，均為P＜0.05）。

圖3 rhHMGB1 對YAP 入核的影響Figure 3 Effect of rhHMGB1 on YAP entry into the nucleus

3 討論

骨缺損部位愈合高度依賴充足的血管系統(tǒng)[24]，充足的血管網(wǎng)可以為細(xì)胞增殖、骨組織沉積提供營養(yǎng)支持，單純的生物支架放入后由于沒有血管新生，會導(dǎo)致缺損部位骨再生失敗[25]，因此，采取支架搭載生物活性物質(zhì)可以提高支架本身生物活性。骨髓MSC由于易獲得且具有較強(qiáng)的增殖能力、多向分化能力，在過去被用作種子細(xì)胞與支架一起來進(jìn)行骨移植治療骨缺損[26]，但因?yàn)槿狈ρ撬鐼SC 無法發(fā)揮生物治療的作用，最終導(dǎo)致骨移植失敗。通過本課題的探究發(fā)現(xiàn)，外源rhHMGB1 蛋白可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及血管活性物質(zhì)的釋放，并且高濃度（2 μg/mL）情況下細(xì)胞毒性小，不會對支架以及周圍細(xì)胞、組織產(chǎn)生負(fù)面影響，是一種高效、安全的生物活性物質(zhì)，在骨移植領(lǐng)域具有很高的研究價(jià)值。

HMGB1 參與多種生理、病理活動，包括炎癥、組織再生等[13]，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境中骨髓MSC 可以通過釋放HMGB1 來增強(qiáng)自身的遷移以及成骨分化能力，對內(nèi)皮細(xì)胞也有一定的促進(jìn)作用[17,27]，但是具體調(diào)節(jié)方式還不清楚。缺氧環(huán)境會誘導(dǎo)細(xì)胞分泌HIF-1α，低氧條件下HIF-1α 會在細(xì)胞質(zhì)中積累，接著進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與啟動子結(jié)合，從而誘導(dǎo)一系列基因表達(dá)[28]，包括許多與血管再生相關(guān)的基因[29-31]，因此HIF-1α 的高表達(dá)有利于促進(jìn)缺損部位早期血管化[32-34]。CD31，又稱為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，是細(xì)胞黏附分子家族成員，是一類跨膜蛋白，包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，通常位于血管內(nèi)皮、血小板上，在內(nèi)皮細(xì)胞連接處高度表達(dá)，維持內(nèi)皮細(xì)胞連接完整性以及促進(jìn)血管發(fā)育[35-36]。本研究使用外源rhHMGB1 以及MSC 上清分別對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理，MSC 上清組代表正常情況下MSC 分泌的HMGB1。通過研究發(fā)現(xiàn)2 μg/mL rhHMGB1 通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及釋放更多的VEGF、CD31 及HIF-1α 來促進(jìn)血管生成，MSC 上清中由于HMGB1 濃度不足，所以促進(jìn)能力低于rhHMGB1。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放成血管活性物質(zhì)這一過程里，YAP 蛋白也扮演著重要角色。這為后續(xù)骨移植替代物中生物活性物質(zhì)的改造提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

YAP 是Hippo 信號通路的關(guān)鍵蛋白，屬于轉(zhuǎn)錄共激活因子，需要與核內(nèi)的TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來啟動下游相關(guān)靶基因的表達(dá)，YAP 磷酸化會在胞質(zhì)內(nèi)酶解失活，只有未被磷酸化的YAP 才能順利進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用[37]。因此，本研究通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)簡單探究了外源HMGB1 處理內(nèi)皮細(xì)胞后YAP 入核情況，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 μg/mL rhHMGB1 蛋白處理后，YAP 入核比例增加，結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測YAP 入核后可能通過激活下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF、CD31 及HIF-1α 來促進(jìn)血管再生。這一結(jié)果為后續(xù)HMGB1 與Hippo 信號通路深入機(jī)制的探索提供了前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)，詳細(xì)的機(jī)制探索還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，外源高濃度rhHMGB1 可能通過介導(dǎo)YAP 入核促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，并上調(diào)血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)。后續(xù)可以通過基因工程的手段來人為地提高骨髓MSC 中HMGB1 的表達(dá)水平，進(jìn)而提高生物支架血管再生的能力。然而，高濃度HMGB1蛋白與YAP 蛋白相互作用的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探討，以期為骨移植替代物中種子細(xì)胞的選擇及改造提供更科學(xué)的證據(jù)。