麻杏石甘湯調(diào)控TLR4/NF-κB 信號(hào)通路治療慢性阻塞性肺疾病的機(jī)制

李莉莎，王鳳嬋

青島市中醫(yī)院,山東 青島 266033

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)主要是由肺部慢性炎癥所引發(fā)的呼吸道氣流受限、慢性支氣管炎、肺氣腫等，若不及時(shí)加以控制，會(huì)引發(fā)更嚴(yán)重的肺心病及呼吸困難，嚴(yán)重威脅患者生命［1-2］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)用于治療COPD 的藥物主要是糖皮質(zhì)激素、抗生素等，可以緩解急性期癥狀，但難以穩(wěn)定控制肺部炎癥［3-4］。近些年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯治療COPD 有很好的療效，能有效控制肺部炎癥反應(yīng)，維持肺組織完整，改善呼吸困難，從而有效治愈COPD，然而其治療COPD 的機(jī)制仍不明確［5-6］。既往研究已經(jīng)明確，Toll 樣受體4（toll-like receptor 4 polypeptide，TLR4）/與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，TLR4與某些大分子物質(zhì)結(jié)合后，能夠激活炎癥反應(yīng)關(guān)鍵介質(zhì)核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB），進(jìn)而調(diào)控促炎因子表達(dá)，因而TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路。研究證實(shí)，調(diào)控TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可改善COPD 后的炎癥［7-9］。MMP-9 是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解，研究發(fā)現(xiàn)異常的MMP-9 表達(dá)與肺功能的損害有著密切聯(lián)系［10-11］。因此，本次研究著重探討麻杏石甘湯對TLR4/NF-κB信號(hào)通路、MMP-9的調(diào)節(jié)作用及對炎癥因子白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）表達(dá)的影響，明確麻杏石甘湯治療COPD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)用6～8 周齡SD 大鼠36 只，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2014-0003。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，給予充足的無菌飼料及無菌水正常飼養(yǎng)，保持室溫以及每日12 h 的光照時(shí)間，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。

1.2 試劑及儀器麻杏石甘湯藥物組成：麻黃9 g，杏仁9 g，甘草6 g，石膏18 g。所有中藥均購于青島市中醫(yī)院中藥房，加工成每毫升中藥制劑中含藥1 g的湯劑藥。LPS（Sigma，美國，批號(hào)：L-8274）；一抗：anti-TLR4（Abcam，美國，批號(hào)：ab2204）、anti-NF-κB p65（CST，美國，批號(hào)：#8242）、anti-MMP-9抗體（Abcam，美國，批號(hào)：ab76003）；二抗（Abcam，美國，批號(hào)：ab6721，ab6728）；ELISA 試劑盒（索萊寶，北京，批號(hào)：SEKR-0005、SEKR-0054）；PVDF 膜（Immobilon，美國，批號(hào)：IPFL00010）。HI-801 型肺功能檢測儀（Chest，日本）；DM500 型光學(xué)顯微鏡（萊卡，德國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模及分組 采用隨機(jī)數(shù)表法將36 只實(shí)驗(yàn)用SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組12 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，正常組僅行氣管切開并縫合后不予任何處理，模型組和治療組采用吸煙聯(lián)合LPS 滴入氣管的方式復(fù)制大鼠COPD 模型［12］，具體方法為：干預(yù)第1、14天，用1%的戊巴比妥鈉溶液按5 mL/kg 的量注入大鼠腹腔使其麻醉后，借助喉鏡將200 μL 的LPS（濃度為1 mg/mL）于1 s 內(nèi)注入大鼠氣道內(nèi)，并使大鼠直立，旋轉(zhuǎn)大鼠使LPS 均勻流入兩側(cè)肺中；第2～13、15～28 天于密閉容器內(nèi)給予大鼠香煙吸入，每日2 次，間隔8 h，每次吸煙時(shí)間為30 min。造模成功表現(xiàn)：大鼠出現(xiàn)頻繁嗆咳，提示造模成功。

1.3.2 給藥方法 治療組自第14 天開始每日早晚給予麻杏石甘湯灌胃（按大鼠和人的體表面積法計(jì)算結(jié)果為6.3 g/kg，大鼠每日灌胃2次，故每天灌胃量為12.6 g/kg），假手術(shù)組和模型組不予藥物干預(yù)。連續(xù)灌胃4周后取材。

1.3.3 標(biāo)本采集 大鼠麻醉成功后，每組6 只大鼠直接取材，即打開胸腔后直接取出大鼠部分肺組織，并用生理鹽水迅速?zèng)_洗后置于EP 管中，于-80 ℃下保存以備用，用于后續(xù)Western blot 實(shí)驗(yàn)，取出另一部分新鮮肺組織搗碎，離心半徑10 cm，13 000 r/min 離心20 min，吸取上清液于-80 ℃下保存?zhèn)溆?，用于ELISA 檢測；剩余每組6 只大鼠采用多聚甲醛灌注固定后取材，大鼠麻醉成功后剪開大鼠胸腔，暴露心臟，自左心耳處切一小口，灌注200 mL生理鹽水沖洗血管組織后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛200 mL以固定組織，然后取出肺組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用于HE 染色。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肺功能檢測 采用小動(dòng)物肺功能儀進(jìn)行檢測，方法為：取材前4 h 對所有大鼠進(jìn)行肺功能檢測，將1%的戊巴比妥鈉溶液（注射量為5 mL/kg）腹腔注射至大鼠體內(nèi)麻醉大鼠，待大鼠麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于固定臺(tái)上，消毒脖頸后，作一長約2 cm 手術(shù)切口，緩慢暴露氣管后將氣管T型切開，然后連接小動(dòng)物肺功能檢測儀進(jìn)行吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）、呼氣阻力（respiratory resistance，Re）和肺組織順應(yīng)性（dynamic lung compliance，Cdyn）的檢測。

1.4.2 HE 染色觀察肺組織病理改變 將固定好的組織經(jīng)過脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、展片、烤片后制作成5 μm 厚的肺組織切片，將上述肺組織切片脫蠟后采用HE 染色試劑盒進(jìn)行染色，最后于二甲苯中透明處理后即可采用中性樹膠封片，光鏡下觀察，采集圖片。

1.4.3 Western blot檢測MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量 采用BCA 法測好總蛋白濃度后進(jìn)行上樣處理，依次進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用脫脂奶粉于4 ℃下封閉1.5 h后加入配置好的MMP-9和TLR4、NF-κB p65單克隆抗體（1∶1000）在4 ℃下充分孵育反應(yīng)過夜，PBST 漂洗，加入二抗（1∶1000）于常溫下作用1.5 h后進(jìn)行顯色處理，采用凝膠成像系統(tǒng)顯示條帶。

1.4.4 ELISA檢測炎癥因子IL-6和IL-18水平 解凍肺組織離心后的上清液，并按照1∶100 比例用PBS 緩沖液稀釋，使用Elisa 試劑盒按照樣本說明書檢測炎癥因子IL-6和IL-18水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺功能模型組和治療組Ri、Re 顯著高于正常組（P＜0.05），Cdyn 顯著低于正常組（P＜0.05）；治療組Ri、Re顯著低于模型組（P＜0.05），Cdyn顯著高于模型組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠肺功能水平

2.2 大鼠肺組織病理改變正常組肺小葉結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁結(jié)構(gòu)正常，無增厚、塌陷，間質(zhì)中無炎性顆粒浸潤；模型組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重塌陷、肺泡壁連續(xù)性消失，出現(xiàn)增厚，肺間質(zhì)大量炎性因子浸潤，出現(xiàn)充血、水腫；治療組可見完整肺泡結(jié)構(gòu)，肺間質(zhì)中稍見充血現(xiàn)象。見圖2。

2.3 Western blot檢測各蛋白表達(dá)結(jié)果Western blot 顯示，模型組和治療組的MMP-9、TLR4、NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組MMP-9、TLR4、NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖3 各組大鼠MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量電泳圖

2.4 ELlSA 檢測炎癥因子水平ELISA 結(jié)果顯示模型組和治療組IL-6和IL-18的表達(dá)量顯著高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組IL-6 和IL-18 含量顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠蛋白相對表達(dá)量及炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠蛋白相對表達(dá)量及炎癥因子水平比較（±s）

注：正常組相對于自身比值為1；*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

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3 討論

近些年來COPD 的發(fā)病率逐年升高，成為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)為，長期的吸煙及吸入有害顆粒或有毒氣體等導(dǎo)致氣道發(fā)生炎癥是COPD發(fā)生的原因［13-14］。因此本研究亦采取公認(rèn)的LPS 氣道吸入加吸煙的造模方法來制備大鼠COPD 模型，且本次實(shí)驗(yàn)ELISA 結(jié)果顯示模型組炎癥因子IL-6 和IL-18 表達(dá)升高，HE 染色結(jié)果也提示模型組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重塌陷，肺泡壁連續(xù)性消失，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)充血、水腫等，這與文獻(xiàn)報(bào)道COPD的表現(xiàn)一致，說明本次實(shí)驗(yàn)COPD模型的建立是成功的。

外界因素不斷刺激，致使氣道持續(xù)性出現(xiàn)炎癥因子，這些炎癥因子不斷堆積并侵襲到肺組織內(nèi)，使整個(gè)肺組織遭到炎癥因子的攻擊，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)損傷，正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，生理功能亦受到嚴(yán)重影響，引起氣體交換困難，肺組織的順應(yīng)性減低等［15-16］。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠炎癥因子表達(dá)較其余兩組高，大鼠呼吸也較其余兩組更困難，肺組織順應(yīng)性也低于其余兩組，亦說明炎癥是導(dǎo)致COPD的重要原因。因此，從炎癥因子的角度出發(fā)，去探究COPD 發(fā)病的具體病理機(jī)制，繼而去研究相應(yīng)的治療手段，具有重大意義。

大量研究證實(shí)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，TLR4 被激活后所引起的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而激活其下游的NF-κB p65，活化后的NF-κB p65 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合促炎基因的啟動(dòng)子，使得炎癥因子不斷激活并釋放到組織中造成炎癥損傷［17-19］。因此，防止TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化是治療炎癥的重要靶點(diǎn)，且針對COPD的研究［20-21］也發(fā)現(xiàn)，COPD 患者TLR4 表達(dá)較高，而NF-κB 與氣道炎癥的產(chǎn)生聯(lián)系密切，這提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路與COPD的產(chǎn)生密不可分。本研究亦發(fā)現(xiàn)，COPD 大鼠TLR4、NF-κB 表達(dá)較正常組高。細(xì)胞外基質(zhì)是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，MMP-9是一種能促進(jìn)其分解的酶類，正常組織中表達(dá)較少，當(dāng)受到刺激出現(xiàn)MMP-9 大量異?；罨螅?xì)胞外基質(zhì)發(fā)生過度分解，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，繼而出現(xiàn)纖維細(xì)胞增多，血管過度擴(kuò)張，肺泡壁間隔增厚，肺實(shí)質(zhì)損傷，肺功能下降等一系列病理表現(xiàn)。大量研究表明，MMP-9 的表達(dá)可接收TLR4/NF-κB的調(diào)控作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路可減少M(fèi)MP-9的活化，繼而減少肺泡壁及其間隔出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，從而縮小炎癥因子浸潤的場所。本實(shí)驗(yàn)中，模型組TLR4、NF-κB、MMP-9表達(dá)均高于正常組，進(jìn)一步證實(shí)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路可調(diào)控MMP-9的表達(dá)。

中醫(yī)學(xué)將COPD 歸納為“肺脹”范疇，機(jī)體肺臟遭到外邪侵襲，肺失宣降，氣機(jī)壅阻不暢，津液無法正常舒布，故聚而為痰，痰邪反過來亦能阻遏肺氣。如此反復(fù)循環(huán)繼而加重呼吸困難，再者痰阻氣滯，血液失去推動(dòng)，機(jī)體可進(jìn)一步出現(xiàn)水飲、瘀血。且痰邪從寒而傷陽，從熱而損陰，機(jī)體正氣受損，無力御邪，進(jìn)而易感受外邪襲擾，如此反復(fù)為病。因此痰邪既是病理產(chǎn)物，亦是致病因素，貫穿COPD 的發(fā)病始末，而由于氣候變暖、大氣環(huán)境污染、飲食結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致濕熱內(nèi)生等因素，痰邪多夾雜熱邪，痰熱壅肺證是COPD的主要證型［22］。

麻杏石甘湯出自《傷寒論》。方中以麻黃為君藥，取其解表散寒、宣肺平喘之功，取“火郁發(fā)之”之意，石膏為臣藥以解肌透熱生津，佐以杏仁降肺氣，再以甘草調(diào)和諸藥。全方共奏清痰熱，降肺氣，平喘止咳之功效。因此從中醫(yī)學(xué)理論角度出發(fā)，麻杏石甘湯治療COPD 是可行的。此外基礎(chǔ)和臨床研究也發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯可減少COPD 后的炎癥堆積，改善呼吸，促進(jìn)肺損傷的修復(fù)。

本研究通過肺功能檢測Ri、Re、Cdyn 發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯可改善呼吸困難，提高肺組織順應(yīng)性。HE 染色提示麻杏石甘湯可減少肺泡壁增厚，抑制肺組織纖維化。Western blot 結(jié)果提示麻杏石甘湯可抑制COPD大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，抑制MMP-9 的表達(dá)。ELISA 結(jié)果證實(shí)麻杏石甘湯可減少COPD 大鼠IL-6 和IL-18 炎癥因子的表達(dá)。綜上所述，麻杏石甘湯可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路活化，減少M(fèi)MP-9 表達(dá)的同時(shí)，還可抑制炎癥因子IL-6和IL-18的分泌，從而治療COPD。